壳聚糖制备工艺。改

实验一：壳聚糖制备工艺

一、实验目的

1、了解制备甲壳质和壳聚糖的意义；

2、学习甲壳质和壳聚糖制备工艺。

二、实验原理

壳聚糖是碱性多糖，有止酸、消炎作用，可抑制胃溃疡。动物实验表明，可降低胆固醇、血脂。国外已报道用作心血管系统降低胆固醇的药物。经分子修饰制得的肝素类似物，具有抗血栓作用，能与肝素妣美。壳聚糖广泛用于食品与医药，如用作药物的载体具有缓释、持效的优点；用于制作人造皮肤、人造血管、人工肾、手术缝合线等。

虾蟹壳含无机盐碳酸钙和磷酸盐约占45%；蛋白和脂肪约占27%；甲壳质约占20-25%（蟹壳含甲壳质17.1-18.2%;龙虾含甲壳质22.5%;虾壳含甲壳质20-25%）甲壳质是聚-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖，以β-（1，4）糖苷键连接而成，是一种线型高分子多糖，天然的中性粘多糖。甲壳质一般与蛋白质或碳酸钙或两者紧密结合在一起。盐酸浸泡处理可除掉壳里的无机盐碳酸钙、磷酸盐，壳中的CaCO3与HCL生成CaCL存在于废酸液中被除掉。碱处理可除掉壳中的蛋白和脂肪。经分离制得的甲壳质为白色无定型粉末，或亮白色半透明的小片状物。甲壳质不溶于水、稀酸、碱溶液和乙醇、乙醚等有机溶剂，溶于无水甲酸、浓无机酸。

浓热碱液与甲壳质作用，可脱掉甲壳质分子结构上的乙酰基，生成壳聚糖。即壳聚糖是由甲壳质在高浓度碱液中脱乙酰制备而成。壳聚糖为可溶性甲壳质，化学名称为聚-2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖，以β-（1，4）糖苷键连接而成。相对分子量约为12万-59万，是一种大分子阳离子聚合物。壳聚糖不溶于水和一般有机溶剂，不溶于碱，可溶于酸性水溶液（但不溶于硫酸）。

制备高黏度（高分子量）壳聚糖，脱乙酰工艺路线有几条，学生自行设计：

1.60-70℃，40-41%NaOH溶液保温20h；

2.110-120℃，45-50% NaOH溶液反应1h左右；

3.间歇式工艺路线：100℃条件下，45%的NaOH 溶液，1+1间歇反应2次，每次反应1h，每次反应后水洗至中性。

三、实验材料

1.材料与试剂

虾壳，1mol/L盐酸，5%氢氧化钠，95%乙醇，乙醚，硼氢化钠

2.仪器与设备

粉碎机，20目筛，方盘，磁力搅拌器，电磁炉，恒温水浴锅，真空干燥箱，布氏漏斗，抽滤瓶，循环水泵，三口烧瓶，冷凝管，温度计，烧杯，量筒，pH试纸，滤纸，纱布。

四、实验步骤

虾壳（称重，取25g），加1mol/L盐酸溶液，（固液比1:10，搅拌，静置12h）过滤。加5% 氢氧化钠溶液，（固液比1:8），搅拌,隔水煮1h，过滤，得甲壳质，烘干，粉碎，待用。

取5g甲壳质于三口瓶中，加45%氢氧化钠溶液（固液比1:20），再加1% 硼氢化钠，于110-120℃搅拌反应1h，冷却，离心，移去上清液，水洗沉淀，再离心，再移去上清液，水洗沉淀，再移去上清液，以95%乙醇洗涤沉淀，一起倒入抽滤瓶中，抽滤，留滤饼，得壳聚糖，晾干，称重。

五、实验结果

1.测定产品的主要质量指标黏度和脱乙酰度；

2.每种指标有两种测定方法，学生可以自选，测定方法见实验讲义附件。

六、思考题

1．由甲壳质制备壳聚糖为什么要加入硼氢化钠？

2．如何评价壳聚糖的质量？

七、参考书目

李良铸、李明晔编〈最新生化药物制备技术〉中国医药科技出版社，2001.3

附：壳聚糖脱乙酰度测定方法

壳聚糖的脱乙酰度，也就是壳聚糖分子链上自由氨基的含量，是一项极为重要的技术指标之一。壳聚糖脱乙酰度的高低，直接关系到它在稀酸中的溶解能力、黏度、离子交换能力、絮凝性能和氨基有关的化学反应能力，以及许多方面的应用。

壳聚糖的脱乙酰度可定义为壳聚糖分子中脱除乙酰基的糖残基数占壳聚糖分子中总的糖残基数的百分数。测定脱乙酰度的方法有很多，如：红外光谱法、紫外光谱法、滴定法等。

方法一：紫外光谱法

仪器：

紫外-可见分光光度计、紫外皿4个、精密pH计1台

100mL容量瓶3个、电子天平1台、架1个、10mL试管15支

500mL烧杯1个、250mL烧杯1个、50mL烧杯1个

试剂：N-乙酰葡萄糖胺、去离子水、盐酸（分析纯）

方法：以0.001mol/L HCl (分析纯) 为溶剂，用0.1mg/mL N-乙酰葡萄糖胺标准品配成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL 的标准溶液。以0.001mol/L HCl为参比液，在199nm处测定系列溶液的吸光度，最大吸光度A与浓度C的关系为A=17C.

称10~20mg壳聚糖样品于100mL容量瓶中，加入10mL 0.01mol/L盐酸，全部溶解后，用去离子水稀释至刻度、摇匀。以0.001mol/L盐酸作参比液，测量其在199nm时的吸光度，制作工作曲线，从工作曲线中得到样品中N-乙酰葡萄糖胺的浓度，从而求得

脱乙酰度（%）=100%-（样品中乙酰基浓度/标准品浓度）×100%。

方法二：酸碱滴定法

酸碱滴定法，不需要特殊的仪器，重复性较好，特别适合于生产过程中的质量监控。

仪器：碱式滴定管2个、500mL烧杯1个、250mL烧杯2个

50mL烧杯1个、吸管2个、滴定台1个

250mL三角瓶9个、精密pH计1台、100mL容量瓶3个

电子天平1台、试管架1台、10mL试管10支

试剂：N-乙酰葡萄糖胺，凡士林，去离子水，盐酸（分析纯），甲基橙指示剂，氢氧化钠滴定液（0.1mol/L），盐酸滴定液(0.1mol/L)。

①实验原理：壳聚糖的自由氨基呈碱性，可与酸定量地发生质子化反应，形成壳聚糖的胶体溶液，溶液中游离的H+用碱反滴定，这样，从用于溶解壳聚糖的酸量与滴定用去的碱量之差，即可推算出壳聚糖自由氨基结合酸的量，从而计算出壳聚糖分子中自由氨基的含量。

②实验前准备：用1mol/L的盐酸标定NaOH，得C NaOH=0.1047mol/L根据药典的规定配制甲基橙指示剂；

③实验步骤：准确称取0.3～0.5克壳聚糖样品，置于250mL三角瓶中，加入标准0.1mol/L 盐酸溶液30mL，在20～25℃搅拌至溶解完全（可加适量的蒸馏水稀释），加入2～3滴指示剂，用标准0.1047mol/L的NaOH溶液滴定游离的盐酸。另取一份样品，置于105℃烘干至衡