医学分子生物学 DNA的损伤和修复

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43
（四）、错配修复
错配修复碱基来源：校正活性所漏校的碱基
使复制的保真性提高102～103倍
错配修复 系统(MRS Mismatch Repair System)
+ ----- A----- ------C--DNA mismatch
DNApol (ξ = 10-8) 经第二次校正ξ = 10-11 44
CTC GAG
镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) β亚基 肽链 N-val · ·leu · · · · his thr pro val glu ······ C 基因
CAC GTG
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（三） DNA链断裂

磷酸二酯键的断裂和脱氧戊糖的破坏是引起DNA链断
裂的直接原因。

碱基的破坏和脱落在DNA链上形成的不稳定位点是
5
紫外线的致损伤作用 ∧ ---嘧啶二聚体 (TT dimer )
…C T T A…
U.V.
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（二）自由基致DNA损伤

自由基：指能够独立存在，核外带有未配对电子的
原子和分子。

自由基的产生可以是外界因素与体内物质共同作用
的结果。

自由基可导致碱基、核糖、磷酸基的损伤，引起DNA
的结构和功能异常。
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后复制修复、E.coli的挽回系统
E.coli 存活%
w.t. UvrA+ RecA+
uvr arec aU.V 计量
该 系 统 存 在 的 实 验 证 据
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★ Rec-A. gene 以某种方式参与DNA损伤修复
♦ Rec修复系统比切除修复系统更有效 ♫ Uvr系统负责切除二聚体 ♫ Rec系统负责消除没有被切除的二聚体 可能造成的后果
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第二节 DNA损伤的修复

DNA损伤的修复：指纠正错配的碱基，清除DNA链上
的损伤，恢复DNA正常结构的过程。

常见的DNA修复方式：回复修复、切除修复、错配修
复和重组修复
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广义的修复系统：
♦ DNA聚合酶的校对功能(复制的范畴)
♦ 尿嘧啶-N-糖苷酶修复系统
（复制时U的渗入、C脱氨氧化成U）
●
TT dimer未被修复，仅表现在后代群体中TT dimer
浓度的稀释
●
链的非准确转移，导致突变机率的增加
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重组修复
(链转移修复)
• 复制后修复 • 容易出错 • RecA, DNApolymerae • ligase 重组修复后的损伤位点可 由其它机制进一步修复 RecA 二聚体后起始
聚合酶、连接酶
酮式Keto 5-BrU
A· TG· 转变 C
烯醇式渗入为
G· CA· 转变 T
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2、 碱基的化学修饰剂
又称化学突变剂：指对DNA链中的碱基的修饰，改变其 配对性质，从而改变DNA结构的化合物. 亚硝酸（nitrous acid HNO2） 羟氨（hydroxylamine HA） 甲磺酸乙酯（ethyl mathanesulfonate EMS） N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍 （N-mathyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidion NNG）
识别新生链中非 m6A 的GATC序列
扫描新生链中错配碱基 酶切含错配碱基的新生DNA区段
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★
DNA合成过程中的甲基化变化 DNA中的GATC(palindromic seq.)
为m6A甲基化敏感位点
平均每2kb左右有一GATC seq. 错配修复系统受甲基化的引导
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（2） 修复过程 a、MutH/MutS 扫描识别错配 碱基和邻近的GATC序列 切点－－甲基化GATC中 G的5’侧 甲基化程度的差异
使受损的碱基脱落
31
1
2
3
4
32
2）. 核苷酸切除


E．coli的核苷酸切除修复机理
在E．coli中，UvrA，UvrB，UvrC三种蛋白是必需的。而且必须同时存在 才能发挥作用，所以也叫UvrABC切除核酸酶。

UvrA是一种腺苷三磷酸酶，是损伤识别蛋白。它与UvrB 结合成A2B1复合物， 结合在损伤区，使DNA解旋、扭曲，并引起UvrB构象改变，与损伤部位形 成紧密的结合。 然后UvrA与UvrB—DNA复合物解离，后者成为UvrC特异结合靶。 UvrB 在损伤的3’侧作一内切，随而复合物构象改变， UvrC 得以在5’侧作第二 个切口。解旋酶 Ⅱ(UvrD)使寡聚核苷酸片段及UvrC从DNA链上释放，然后 DNA聚合酶Ⅰ取代UvrB。修补缺损区；最后由连接酶连接补片。
稳定位点，最终可导致DNA链的断裂。
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（二）错配
DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。
1. 转换 发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一
嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。
2. 颠换 发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶
或嘧啶变嘌呤。
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正常成人Hb (HbA)β亚基
肽链 N-val · ·leu · · · · his thr pro glu glu ······ C 基因
----TT-------AA---24


2）嘌呤的直接插入
嘌呤插入酶 受损嘌呤→APS →插入嘌呤（糖苷键）
K+ 糖基化酶 嘌呤插入酶
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3）DNA单链断裂重接
DNA单链断裂中有一部分是通过简单的重接
而修复的，只需要一种酶——DNA连接酶
(ligase)参加，因此也属于直接回复。

DNA连接酶能催化DNA双螺旋结构中一条链
♦ 错配修复系统
♦ 损伤修复系统(光复活、重组修复、SOS修复等) ★ 限制修饰系统-----对付外源DNA的入侵
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(一）回复修复

细胞对DNA的某些损伤可以用很简单的方式加以修复 在单一基因产物的催化下，一步反应就可以完成。 这种修复方式叫回复修复。
包括：酶光学复活、嘌呤的直接插入、O6－甲基鸟嘌 呤－DNA甲基转移、单链断裂重接等。
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NH2OH (Hydroxylamine HA 羟胺) HNH H HA O H H H H N O HNH H H H N H O HN
H
N
C(a)
HO
HO C(i) A(a)
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3、嵌入染料对DNA的损伤作用
吖啶橙 (Acridine Orange AO) 溴化乙锭 (Ethidium Bromide EB ) 分子插入 -ATTTTTCG - AO -TAAAAAGCEB TAO T -A TTTCG -T AAAGC-AT EB TTTTCG-TA X AAAAGC -ATTTCG -TAAAGC-ATX’TTTTCG-TAX AAAAGC-
错配修复系统（Mismatch repair system）
（1）组成 DNA腺嘌呤甲基化酶(m6A甲基化酶) DNA polymerase Helicase SSB 外切核酸酶 (Ⅰ和Ⅶ) 连接酶 dam gene
MCE (mismatch correct enzyme) 3 subunits mutH, L, S
DNA的损伤和修复
南华大学心血管疾病研究所 王 佐
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DNA 的损伤和修复
Mutagen (诱变剂）
碱基的化学反应
DNA 损伤
损伤的修复 完全修复
回复正常
不完全修复
畸变
不能有效修复 凋亡
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第一节 DNA损伤
诱发DNA损伤的因素：
环境因素：辐射、化学毒物、药物、病毒感染、植
物和微生物代谢产物等。
生理因素：机体代谢过程中产生的有毒物质、DNA
复制错配、DNA本身的热不稳定性。
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一、DNA损伤的因素及其机制
引起损伤的因素: ♦ 自发性损伤(复制中的损伤、碱基的自发性化 学改变、自发脱碱基、 细胞的代谢产物对 DNA的损伤)
♦
♦
物理因素引起的损伤(电离辐射、紫外线)
化学因素引起的损伤（烷化剂、碱基类似物）
缺口处的5’磷酸根与相邻的一个3’羟基形成磷
酸二酯健。连接所需的能量ATP(如动物细胞)。
Hale Waihona Puke 2627(二)、切除修复
将损伤的部位（或连同其附近的一定部位）切 除，然后用正确配对的、完好的碱基替代修复。 有多种酶和基因参与。 过程：识别（损伤位点）→切除→修复（补） →连接 酶和蛋白质 DNA聚合酶
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（一）辐射致DNA损伤
根据作用原理的不同
电离辐射（α 粒子，β 粒子，γ 射线，Χ 射线等）
直接作用：能量直接传递给大分子而引起结构的破坏 间接作用：辐射先作用于溶剂分子而产生活性物质从而导致细胞损伤
非电离辐射（紫外线以及能量低于紫外线的电磁辐射）
辐射引起的DNA损伤常见的有碱基的脱落、碱基破坏、 嘧啶二聚体形成、单链和双链断裂、DNA交联等。
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1）、酶学光复活（photo reactivation ） • 复制前、不容易出错 • 400 nm 蓝光、PR 酶 ----TT-------AA-------TT-------AA---可见光激活
(photo-reactivation enzyme)
光敏裂合酶（photolyase）
----TT-------AA---PR
扁平染料分子
结果产生－－－移框突变
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二、DNA损伤的类型
DNA分子中的碱基、核糖和磷酸二酯键等均是
DNA损伤作用的靶点。 常见的损伤有：碱基脱落、碱基破坏、嘧啶二聚体形成、
单链和双链DNA断裂、DNA交联、DNA蛋白质交联等。
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（一） 碱基和核糖的破坏
由于碱基或者核糖的损伤，在DNA链上形成不
2-Amino purine
O
9
OH
H
O
Br
AGCTTCCTA TCGAAGGAT
:G
酮式5-BrU的渗入
AGCTBCCTA TCGAAGGAT
烯醇式enol
第一轮复制
AGCTTCCTA TCGAAGGAT
酮式到稀醇 式的转变
AGCTBCCTA TCGAGGGAT
H
O
Br
:A
第二轮复制
AGCTBCCTA TCGAAGGAT AGCTCCCTA TCGAGGGAT
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★ 修复时期的证明
E.coli (Rec-A, uvr-a-)
U.V. 复制
D.S. DNA
提取 变性
TT
TT
S.S. DNA
TT
TT AA TT AA TT AA
TT
TT AA 变性
复制过程越过二聚体而在相应新链上留下缺口 ★二聚体后起始
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修复相关机制:
● 与Rec-A蛋白引起的重组(strand transfer)有关
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• 复制前进行 • 不易出错 •UvrA, B, C gene
核苷酸切除修复核
苷 酸 切 除 修 复
碱基切除修复
碱基切除修复
内切核酸酶
（Endonucleases） 外切核酸酶 （Exonuclease） • DNA pol • Ligase
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（三） 重组修复

当DNA双链发生严重损伤时需要另一种机理来 完成正确的修复。 一种情况是两条链同时受到损伤；另一种 情况是单链损伤尚未修复时发生了复制，造成 对应于损伤位置的新链缺乏正确模板；此时需 要重组酶系将另一段未受损伤的双链DNA移到 损伤位置附近，提供正确的模板，进行重组。 这便是重组修复。

DNA连接酶
按照产物的不同可以分：碱基切除修复、核苷酸切除修复
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1)碱基切除： 特点是切除受损伤的碱基。主要过程是水
解受损伤的碱基与脱氧核糖磷酸链之间的N—
糖苷键。反应由糖基化酶催化。

也即：糖基化酶→APS→内、外切酶去除残基
→以对侧链为模板修补→DNA连接酶连接

整个修复过程可分4步。
DNA链断裂的间接原因。

单链断裂（SSB）：一条链断裂的DNA双股螺旋

双链断裂（DSB）：两条链于同一处或紧密相邻处同
时断裂。
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（四）DNA交联

链间交联：DNA双螺旋链上一条链上的碱基和另一条
链上的碱基以共价键结合

链内交联：DNA分子中同一条链内的两个碱基以共价
键结合

DNA－蛋白质交联：DNA和蛋白质以共价键结合
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DNA糖苷酶识别切除改变的碱基
核酸内切酶切除磷酸二酯键 DNA聚合酶Ⅰ填补
DNA连接酶连接
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2.识别的酶：
（1）一类DNA糖苷酶，各具特异性
e.g.尿嘧啶DNA糖苷酶—识别DNA中的U （由C突变而来） （2）作用：
识别-----DNA中改变的碱基
水解-----受损的碱基与脱氧核糖间的糖苷键
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（三）化学毒物致DNA损伤
按其作用原理可分为：
碱基类似物
碱基修饰物 嵌入染料
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1、碱基类似物（Base analog）
是指与DNA正常碱基结构类似的化合物,在DNA复制时 掺入并与互补链上碱基配对,从而引起碱基对的置换. 5-溴尿嘧啶 5-Bromine Uracil O Br NH2 2-氨基嘌呤
DNA helicase II, SSB, exonuclease I去除包括错 配碱基的片段 DNA polymerase III 和 DNA ligase 填充缺口 昂贵的代价用于保证DNA的准确性