荧光定量PCR应用实例

Page 32
DNA甲基化——生物学功能
DNA 甲基化是基因 表达调控中一种常 见而又重要的机制 ，参与细胞分化与 增殖、生物体老化 、肿瘤发生等多种 重要生命活动。
Page 19
SNP研究策略
Page 20
SNP——持续不断的热门研究
SNP（单核苷酸多态性） ——是由于单个核苷酸改变而导致基 因组核苷酸水平上的变异引起的DNA 序列多态性，包括单碱基的转换、颠 换、插入、缺失等。 SNP研究意义 ——遗传标记，具有已知性、可遗传 性、可检测性，用于疾病基因的定位 、克隆和鉴定； 基因多态与疾病相关性； 研究SNPs 本身对机体的影响，尤其 是疾病的易感性、个性化医疗；
2.验证SNP位点 采用对照组和实验组的大量样本，验证寻找到的实验相关的SNP位点；
3.关联性分析 根据已有的对照组合实验组的SNP分型结果，与实验目的进行关联分析。 1) 与疾病的关联分析等； 2) LOH分析； 3) 遗传连锁分析。
Page 22
SNP——检测方法 SNP检测技术基于以下4种基本原理：等位基因特 异性杂交；内切酶酶切技术；引物延伸法；寡核 苷酸连接反应；
全基因组测序
利用ABI7900/7300的绝对定量实时PCR系统,对检测样本的目标基因 (具有拷贝数多态)以及参照基因(没有拷贝数多态,通常每个基因组只有1 个拷贝)进行绝对定量,通过比较这两个检测值的比值可以估计检测样本 候选基因的拷贝数。
Page 17
荧光定量实时PCR
CNV——TaqMan法（RT-PCR）
CNV——检测方法
比较基因组杂交（aCGH）
覆盖整个基因组，为高通量分析法，aCGH一般包括了两方面的杂交: 细菌人工染色体和寡核苷酸探针；
通过比较测试样本的信号强度与其他个体的强度,而确定每个位点 的相对基因组拷贝数；
SNP芯片
最直接，当一个地方有片段缺失，或者片段增多的时候，测序的 覆盖深度会马上显示出片段的增多或缺失，成本最贵；
Page 2
2.应用
实时荧光定量PCR技术已经广泛地应用于基因表达的定量(细胞因子、 生长因子、转录因子等)和等位基因的鉴定(单核苷酸多态性的检测)等 分子生物学基础研究领域。
同时，由于其能够快速、简便地扩增微量DNA序列,且特异性好、灵敏 度高和操作简单等特点,被广泛地用于各种病原体的检测(病毒、细菌、 真菌、寄生虫等)的检测监控以及定量分析。
microRNA——生物学功能
miRNA异常表达可引起： 动物中：发育问题； 抑制细胞死亡，参与脂肪代谢； 心脏疾病、癌症，神经紊乱； 植物中：介导其靶mRNA降解； 近年microRNA研究热点： miRNA研究种类及其调控通路、疾病类别及诊断和治疗、miRNA 的治疗应用、miRNA与干细胞研究、相关研究技术；
Page 21
SNP——研究思路
1.寻找研究相关的SNP位点 1) 通过参考资料锁定研究相关的基因，通过数据库查到基因内部的SNP位点； 若数据库没有查到相关基因的SNP位点，需要提供实验组样本进行外显子测序比 对，找到SNP位点； 2) SNP芯片、二代测序检测找到相关SNP位点； 3) 查找相关的参考文献，找到研究相关的SNP位点。
荧光定量PCR应用实例
上海启因生物科技有限公司
Http：//www.wcgene.com
1.概述
荧光定量PCR技术产生并成熟于上世纪90年代，由于该技术实现了PCR 从定性到定量的飞跃，能够对PCR反应的全过程进行实时监控，并且自 动化程度高，所以该技术从产生到现在短短的十几年时间，在科研及 检验领域获得了广泛的应用，成为分子生物学领域不可或缺的一项重 要技术。 原理：荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通过分析软件 对PCR的反应进行检测分析的技术。
Page 8
microRNA——热点研究
• 1993年在线虫内首次发现 RNA：lin-4 / • 其前体大概是70~100 nt左 右，形成标准的stem结构， 加工后成为21~23 nt的单链 RNA / • microRNA的作用机制是与 mRNA 互补，让 mRNA 沉 默或者降解。
Page 9
计算PCR 芯片各个基 因的Ct值， 采用公认的 ΔΔCt
Page 30
DNA甲基化研究策略
Page 31
DNA甲基化——概念及特点
何为DNA甲基化？ 是在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(Sadenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二 核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基 的共价修饰过程。 DNA甲基化特点 不改变DNA的一级结构，但能引起染色质结构、 DNA 构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用 方式的改变； 因此在基因的表达及其调控、DNA的复制、细胞 的生长发育、X染色体失活、衰老以及许多人类疾 病发生过程中发挥重要作用。
Page 23
SNP——TaqMan (RT-PCR)
利用TaqMan 探针分析SNP原理图
Taqman探针技术
步骤：序列比对-- 引物和特异 探针设计-- DNA 提取-- PCR - 结果分析。 优点： 准确度高，适合样本多、位点 数量少的检测。
缺点： 价格昂贵（探针合成费用高,并 且DNA提取、引物合成，PCR扩 增均需费用），仅检测已知SNP 位点，不能同时发现未知SNP。
用TaqMan测CNV原理图
Page 18
CNV——TaqMan法（RT-PCR）
Βιβλιοθήκη Baidu流程
Combine and load plate
Run on real-time PCR instrument
Analyze with software
The complete TaqMan® Copy Number Assay workflow takes only 3–4 hours
能否区分序列差 不能 别小的miRNA
否，需额外 步骤
不能
是
能
Northern Blot-基于探针杂交技术 Microarray-微阵列芯片 Quantitative Real-time PCR-荧光定量PCR
Page 11
A：引物延伸法
B：poly（A）聚合酶加尾法
C：茎-环状引物反转录法
Page 10
microRNA——常用研究方法
Northern Blot 初始样本量 敏感度 特异性 动态范围 5-10ug 低 低 2logs Microarray 5ug 中等 中等 4logs qRT-PCR 1-10ng 高 高 7logs
通量
实验时间
低
几天
高
几天
中等、高
几小时
是否区分前体与 是，少数无法 成熟miRNA
另一种常用方法HRM，在后面章节有说明；
Page 25
PCR芯片研究策略
Page 26
PCR芯片——概念 运用高通量荧光定量PCR方法,在一张96孔或384孔板上同时对某个 信号通路相关的84个或372个基因的表达量变化进行检测。
96孔板
384孔板
Page 27
PCR芯片——优势及功能
Page 28
PCR芯片——用于信号通路 提供上百种不同信号通路和疾病相关基因功能分类的PCR芯片，种属包 括人、小鼠、大鼠、果蝇、猪、兔、鸡等，格式分为96孔和384孔两种 ,并且还有个性化定制芯片服务。
Page 29
PCR芯片——研究方法 实验流程
样品RNA 提取 反转录为 cDNA 配制PCR 反应体系 进行RTPCR反应
Page 24
SNP——TaqMan (RT-PCR)
Eg. 运用TaqMan探针实时荧光PCR技术检测AKAP10基因2073A/G单核苷 酸多态性* TaqMan探针实时荧光PCR结果
不同的等位基因对应不同的荧光,根据2种荧 光的不同Ct值便可区分出不同的基因型。
如果是纯合子,则其中一种荧光占主导,相对 应Ct值较小;如果是杂合子,则2种荧光都有, 两者Ct值亦相近。由于每个样品扩增效率不 完全相同,所以结果显示同一基因型的个体 聚集成簇,而不是一个点
数据分析
RNA质量 检测(分光 光度计检测 ，琼脂糖凝 胶电泳测 RNA浓度 和纯度)
按照逆转录 酶使用说明 将RNA逆 转录为 cDNA
需使用与 PCR Array 配套的RT² SYBR Green Master mixes
参数设置， 向含有基因 特异性引物 的96孔/384 孔加入等量 的反应液
其他应用 microRNA分析 基因拷贝数分析（CNV） 表观遗传学（甲基化） 蛋白质分析 肿瘤稀有突变检测
……
Page 5
micro RNA HRM
PCR芯 片
荧光定量PCR在miRNA， PCR芯片等方面均有较广应 用；
CNV SNP DNA甲 基化
Page 6
microRNA研究策略
Page 15
CNV——研究意义
CNVs广泛存在于正常人群基因组；
CNV与人类疾病
神经和精神系统疾病，如老年痴呆； 免疫系统疾病，如艾滋病，红斑狼疮； 罕见疾病和遗传病，如先天性心脏病； 其他疾病，如各种癌症；
人类基因组CNV图谱（Conrad等,Nature 2010）
Page 16
测序方法：常规测序，Pyrosequencing（焦磷酸测序），微 测序(SNaPshot) 基于杂交的方法：Taqman 探针法，Microarray 芯片法， 引物延伸：MALDI-Tof，dHPLC（变性高效液相色谱技术） 以构象为基础的方法：RFLP，SSCP，DGGE 溶解曲线：HRM(高分辨率溶解曲线分析技术)
Page 3
荧光定量PCR技术一般应用
核酸的定量 （RNA、DNA的定量） 核酸定性分析，如SNP分析
基因型分析
RNA变异分析 溶解曲线分析 （HRM）
Page 4
定性分析：杂合或纯合子鉴定， SNP分析，与疾病相关的等位基因 点突变检测 绝对定量：病毒和病原菌定量分析 ，基因拷贝数定量，GMO定量检 测等，基因表达研究， 转基因食 品检测 相对定量：miRNA表达量分析， 基因在不同样本中的表达差异药物 疗效考核
Page 7
非编码RNA——生物离不开的“垃圾RNA”
非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA； 包括：rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNA等； 特点：从基因组转录但不翻译成蛋白，在RNA水平行使生物学功能； 研究工作：1，大规模的鉴定新的非编码RNA；2，通过各种方法研 究非编码RNA的功能。 意义：广泛参与生命现象的各个环节，如生长、分化、发育、免疫，甚 至在肿瘤的形成中也具有重要的调控作用；
Page 13
CNV研究策略
Page 14
CNV——人类基因组变异研究新热点 拷贝数变异(Copy number variation, CNV) 是一种大小介于1kb到3Mb之 间的DNA片段的 缺失、重复、 倒位和易位，广泛存在于基因 组中，被认为个体间基因差异 的重要来源。 特点： 每个人都有CNV，自然发生的基因敲除和增加 突变率高，比SNP高100-1万倍 致病性，CNV和疾病间大都为因果关系（而非易感性）
优势
免去引物设计和实验条件的摸索过程； 可以直接了解某信号通路或某疾病中的关键基因，不需要再检索大量 文献和进行前期实验验证； 实验结果可进行在线分析，得出准确的数据分析图； 可提供准确而可靠的实验数据，节约大量的时间和精力。
生物学功能
用于检测某信号通路或某生物学功能相关的一系列重要基因的表达量变 化，即信号通路
3种荧光定量PCR技术检测microRNA原理图
Page 12
microRNA检测流程
提取总 RNA 加尾、反 转录 RT-PCR 扩增
引物设计
数据分析
运用SYBR Green荧光染料以及RT-PCR中,Poly聚合酶加尾法，我 们可对低至100ul的血清/血浆样本进行非编码RNA片段的高特异性定 量检测,并且还对517种miRNA进行了优化。