荧光定量PCR应用实例
实时荧光定量PCR技术的操作实践
实时荧光定量PCR技术的操作实践实时荧光定量PCR技术是一种在生物医学领域应用广泛的分子生物学技术，主要用于基因表达水平的研究、疾病诊断和生物制品定量等。
本文将介绍实时荧光定量PCR技术的实验原理、操作实践、结果分析和总结。
实时荧光定量PCR技术的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累与PCR产物形成正比的关系，从而实现对目标基因的定量分析。
实验过程中，荧光信号被实时检测并记录，通过荧光阈值设定，将荧光信号转换为数量，最终实现对目标基因的定量分析。
准备实验材料和设备：包括RNA提取试剂、逆转录试剂、实时荧光定量PCR仪、PCR引物、荧光染料等。
提取RNA：将组织或细胞中的总RNA提取出来，根据需要逆转录成cDNA。
实时荧光定量PCR：将cDNA、荧光染料和特异性引物混合，在实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增。
数据收集和分析：收集荧光信号数据，根据标准曲线计算目标基因的相对表达量。
RNA提取时需选择合适的试剂，根据组织或细胞类型进行优化。
实时荧光定量PCR反应条件需根据目标基因和仪器型号进行调整，以确保最佳扩增效果。
荧光染料的加入要适量，以避免对PCR产物产生影响。
标准曲线的制作要采用已知浓度的样品，以便计算未知样品的相对表达量。
实验数据分析和解读是实时荧光定量PCR技术的关键环节之一。
通过对荧光信号数据的收集和分析，可以获得目标基因的表达量。
在标准曲线上，可以根据已知样品的浓度计算未知样品的相对表达量。
通过比较不同样品中目标基因的表达量，可以研究基因表达水平的差异。
还可以利用相对定量和绝对定量两种方法对目标基因进行定量分析。
在本次实时荧光定量PCR实验中，我们成功地检测了目标基因的表达量，并对其进行了相对定量和绝对定量的分析。
通过比较已知样品和未知样品的数据，我们发现目标基因的表达量在未知样品中明显高于已知样品。
这一结果表明，目标基因在未知样品中的表达水平较高，可能与某种特定条件或因素相关。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
•理想的PCR反应：
•
X=X0*2n
•非理想的PCR反应：
•
X=X0 (1+Ex)n
• n：扩增反应的循环次数
• X：第n次循环后的产物量
• X0：初始模板量 • Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
在扩增产物达到阈值线时:
设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数
利用TaqMan法
数据分析
检测血液中的HBV
分析结果： HBV DNA的精确copy数为3.7X105
TaqMan法
应用范围
起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 SNP分析
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan
3、Molecular Beacon
4、Amplisensor
R
实时荧光定量PCR 方法 1 ---------SYBR Green 法
SYBR Green
SYBR Green 法
工作机理
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
Flourescenc
定量原理
Ck 102
Sample
Ck 104
Cycle number
Cycle number
Log of DNA concentration
SYBR Green 法 ------------PCR反应的建立
反应体系的建立及优化: 1. SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不
实时荧光定量PCR技术在真菌检测中的应用
实时荧光定量PCR技术在真菌检测中的应用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR）是一种高效、灵敏的分子生物学技术，广泛应用于科研和医学诊断等领域。
其在真菌检测中的应用，具有快速、准确和高通量的优势，被广泛应用于食品安全、环境监测和临床诊断等领域。
一、介绍实时荧光定量PCR技术的原理是通过引入荧光探针和荧光剂来实时监测PCR反应的扩增过程，从而实现样本中目标DNA的定量检测。
相比传统的聚合酶链反应，实时荧光定量PCR技术的特点在于不需要进行后续的凝胶电泳步骤，并且具有更高的灵敏度和特异性。
二、真菌检测的重要性真菌是一类广泛存在于自然环境中的微生物，对于人类的健康和生态系统的平衡具有重要影响。
某些真菌可以引起严重的传染病，比如肺真菌感染和侵袭性真菌感染，对人类健康构成威胁。
此外，在食品加工和贮存过程中，真菌的污染也会导致食品腐败和毒素产生，对食品安全产生负面影响。
因此，及早检测和鉴定真菌的存在是至关重要的。
三、实时荧光定量PCR技术在真菌检测中的应用1. 物质检测实时荧光定量PCR技术可以应用于食品加工和生物样品中真菌物质的检测。
通过选择合适的荧光探针和引物，可以在样本中快速且准确地检测到真菌的存在及其数量水平。
这种方法不仅可以大大缩短检测时间，还可以减少人为操作的干扰和误差。
2. 环境监测实时荧光定量PCR技术在环境监测中广泛应用于水体、土壤和空气中真菌的检测。
通过采集样品并提取其中的DNA，利用实时荧光定量PCR技术可以在短时间内快速、精确地检测出真菌的存在和分布情况，为环境保护和生态研究提供科学依据。
3. 临床诊断实时荧光定量PCR技术在临床诊断中应用广泛，可以用于快速检测和鉴定引起病原菌感染的真菌种类。
通过从患者样本中提取DNA，并使用特定的引物和荧光探针，实时PCR可以在短时间内对真菌感染进行准确诊断，从而指导临床治疗和预防措施的制定。
实时荧光定量PCR介绍课件
实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 21
质粒标准品构建流程
目的基因
PCR
目的基因
目的基因克隆
目的基因
基因组DNA 质粒
质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 22
体外转录RNA标准品构建流程
目的基因
4/5/2024 • 12
RT Primer的选择
• Random Primer • Oligo dT Primer • Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-Primer PCR R-Primer
实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 13
RT Primer的选择
Random
目的片段在mRNA任何位
5’
目的片段
3’ 置都能使用。通常mRNA
F
R
Random
表达量分析最适。
5’
目的片段
AAA··· 3’ 适用于mRNA表达量分析，
F
R
提升反应检测的灵敏度。
1,500 base
OOligligooddTTPPrirmimeer r 目的片段在距Poly(A) Tail
Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同
普通PCR引物 目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚 体要求不严格。
Real Time PCR引物 目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异 性反应和引物二聚体要求严格。
荧光定量PCR实验案例介绍
荧光定量PCR实验案例介绍实验分组：A 正常组；B 阴性对照组；C XXXX-1转染组；D XXXX-2转染组；E XXXX-3转染组第一个筛选实验：荧光定量PCR实验实验分组：实验试剂：Trizol Invitrogen ，#15596-026；RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit Fermentas #K1631；Deoxyribonuclease I (DNase I) Fermentas #EN0521；RiboLock? Ribonuclease Inhibitor Fermentas #EO0381；SYBR GreenPCR Master Mix，ABI 4309155；Realtime-PCR仪ABI 7900型；引物由primer3.0软件设计并由嘉美生物合成。
步骤(略)。
结果数据：Ct（基本循环数）；ΔCt（基本循环与内参循环数差值）；ΔΔCt*（最低样本ΔCt值—其它各样本ΔCt值）；2-ΔΔCt（RQ）：目的基因mRNA相对含量（* 相对定量以含量最低的样本为标准，其余各样本的含量均为相对该样本的倍数.具体方法参见Kenneth，et al. (2001) METHODS 25 402–408）。
扩增曲线：在实时荧光PCR扩增反应中，荧光扩增曲线主要分为4个特征性阶段：基线期，指数期初期，指数期，平台期，在软件中显示形状是一条平滑的S型曲线。
目的基因的扩增曲线符合4个特征性阶段的平滑的S型曲线，阴性对照(模板为水)无显著荧光信号，提示荧光定量PCR反应程序正常运行，目的基因得到有效扩增，实验操作规范，试剂符合实验要求。
熔点曲线：从软件中显示形状只有一个峰值，没有出现杂峰，提示无非特异性荧光信号，目的基因扩增产物单一，有利于结果分析。
126.3320 6.0975-1.8954 3.7203126.0145 5.6754-2.3175 4.9847227.0101 5.9786-2.0143 4.0398 3.98410.0485 227.0077 6.0073-1.9856 3.9603227.0584 6.0103-1.9826 3.9520328.10328.33780.34490.78740.51860.2327 328.72129.3670 1.37410.3858328.50349.3785 1.38560.3827428.02107.8063-0.1866 1.1381 1.32240.2119 428.00427.6421-0.3508 1.2753427.91427.3570-0.6359 1.5539526.37427.0578-0.9351 1.9120 2.17700.3723 526.5004 6.6129-1.3800 2.6027526.6316 6.9812-1.0117 2.01631-内参20.36211-内参20.23451-内参20.33912-内参21.03152-内参21.00042-内参21.04813-内参19.76543-内参19.35423-内参19.12494-内参20.21474-内参20.36214-内参20.55725-内参19.31645-内参19.88755-内参19.6504。
荧光定量PCR原理及应用
荧光定量PCR原理及应用首先，PCR反应：荧光定量PCR使用特异性引物将目标DNA序列扩增。
PCR反应通常包括以下步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应体系中的DNA双链被加热至95°C，使其变性成两个单链。
随后，在退火温度下，引物与目标DNA的互补序列结合。
最后，在延伸温度下，DNA聚合酶以引物为模板合成新的DNA链。
这些步骤会重复多次，每次都会使目标DNA序列的拷贝数翻倍。
接下来，扩增曲线：随着PCR循环的进行，扩增曲线会呈指数增加。
扩增曲线反映了PCR反应体系中拷贝数的变化。
在扩增曲线的指数增长阶段，荧光信号会迅速增加。
随着PCR循环数增加，荧光信号的增加速率会逐渐减慢。
根据扩增曲线的特征，可以计算出PCR的阈值周期数（Ct值），即荧光信号超过背景噪音的周期数。
Ct值可以用来定量目标DNA序列的拷贝数。
最后，荧光探针：荧光探针是一种含有荧光染料和阻尼染料（quencher）的引物。
引物特异性地结合在扩增产物的靶标序列上。
在引物结合的过程中，荧光信号被抑制。
当引物与靶标序列结合后，PCR反应体系中DNA聚合酶会将DNA链分离，使荧光信号被释放出来。
通过检测释放的荧光信号，可以定量PCR反应体系中目标DNA序列的拷贝数。
1.肿瘤检测：荧光定量PCR可以检测肿瘤相关基因的突变、重排和拷贝数变化。
通过定量目标基因的变化，可以实现对肿瘤的早期诊断和治疗监测。
2.微生物检测：荧光定量PCR可以快速检测致病微生物的存在。
例如，在食品安全领域，可以用荧光定量PCR检测食品中的细菌和病毒污染。
3.分子诊断：荧光定量PCR可以定量检测与疾病相关的遗传变异。
例如，可以通过荧光定量PCR检测与遗传病相关的突变，为临床诊断提供准确的基因检测结果。
4.环境监测：荧光定量PCR可以快速检测环境中的微生物群落的变化。
例如，在水源污染监测中，可以用荧光定量PCR检测水体中的细菌和寄生虫的存在。
总之，荧光定量PCR是一种快速高效的检测技术，可以广泛应用于医学诊断、食品安全、环境监测等领域。
实时荧光定量PCR的高灵敏度应用
实时荧光定量PCR的高灵敏度应用实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种能够在PCR反应过程中实时监测并定量目标DNA的技术。
它通过添加荧光探针在PCR反应体系中，利用荧光信号的增强来判断靶标DNA的数量。
该技术具有高灵敏度的特点，能够在短时间内检测到低丰度的DNA分子，因此在多个领域有着广泛的应用。
一、医学领域中的应用实时荧光定量PCR在医学领域中广泛应用于疾病的诊断与监测。
通过对病人样本中的相关基因进行检测，可以及早发现疾病的存在及其严重程度。
例如，在乳腺癌的诊断中，通过检测乳腺癌相关基因的表达水平，可以对病人的预后进行评估，为临床治疗提供依据。
实时荧光定量PCR的高灵敏度可以检测到极低浓度的靶基因，有助于早期诊断，提高治疗效果。
二、食品安全监测中的应用食品安全一直是社会关注的焦点。
实时荧光定量PCR技术在食品安全监测中具有重要的应用价值。
以检测食品中的致病菌为例，通过对食品样本中的病原菌DNA进行定量PCR检测，可以快速、准确地判断食品是否受到污染。
而实时荧光定量PCR的高灵敏度可以检测到数量极少的致病菌，从而保障了食品安全。
三、环境监测中的应用环境监测是保护生态环境和人类健康的重要任务。
实时荧光定量PCR技术在环境监测中起到了重要的作用。
例如，在水体中检测细菌的种类和数量，可以通过实时荧光定量PCR技术快速获取准确的结果，判断水质是否达到安全标准。
同样地，实时荧光定量PCR的高灵敏度可以检测到微量的细菌，对及时监测和预警环境污染起到了至关重要的作用。
综上所述，实时荧光定量PCR具有高灵敏度的特点，被广泛应用于医学、食品安全监测和环境监测领域。
通过实时荧光定量PCR技术，可以快速、准确地检测目标DNA的数量，为疾病的早期诊断、食品安全监测和环境污染监测提供了有效的手段。
未来，随着该技术的不断发展和完善，相信它将在更多的领域展现出广阔的应用前景。
实时荧光定量PCR在临床及科研中的应用
主要内容
1
Real Time PCR 用途及原理 Real Time PCR 几种方法介绍 Real Time PCR 技术应用 Real Time PCR 应用实例
2
3
4
Real Time PCR 用途
定性分析 绝对定量 相对定量
不足
特异性仅由引物保证。 特异性仅由引物保证。 非特异性双链DNA也会产生荧光信号。 也会产生荧光信号。 非特异性双链 也会产生荧光信号 不能用于多重Real-Time PCR。 不能用于多重 。
RealPCR检测原理 检测原理(TaqMan probe法 Real-Time PCR检测原理(TaqMan probe法) TaqMan探针为一寡核苷酸 探针为一寡核苷: 探针为一寡核苷酸
Real Time 进入 SYBR Green I 时代
设计合适的引物 选择适当的反应条件 使用良好的试剂
保证以上条件，使用 保证以上条件，使用SYBR Green I将会更加便 将会更加便 更为方便，并拥有良好的特异性。 宜，更为方便，并拥有良好的特异性。
Real Time PCR引物及探针设计 引物及探针设计
Real Time PCR用引物与普通 用引物与普通PCR引物设计要求不同 用引物与普通 引物设计要求不同 普通PCR引物 引物 普通 目的是获得目的基因， 目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求 不严格。 不严格。 Real Time PCR引物 引物 目的是让目的基因按照理论值进行扩增， 目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应 和引物二聚体要求严格。 和引物二聚体要求严格。 => 对引物设计要求严格
Archimed 荧光定量 PCR 系统 应用手册—非洲猪瘟荧光定量 PCR 检测说明书
A PPLICATION N OTE利用Archimed定量PCR进行非洲猪瘟病毒检测鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司阳性对照阴性样本非洲猪瘟荧光定量PCR 分析2018年8月非洲猪瘟疫情在中国爆发，爆发地区分布交广，对我国畜牧养殖造成了巨大损失。
我国将非洲猪瘟列为一类动物疫病，非洲猪瘟（ASF ）是由非洲猪瘟病毒（ASFV ）引起的猪的一种急性、烈性、高度接触性传染病，对生猪致病率高，致死率高达100%。
应用实时荧光PCR 技术可以从低微含毒量样品中扩增获得病毒特异性核酸片段，进行病毒鉴定。
通过扩增捕获ASFV 主要免疫原基因VP72，进而测定其核酸序列，可进行以毒株间核苷酸序列同源性比较为主要技术手段的非洲猪瘟分子流行病学研究。
利用Archimed 荧光定量PCR 进行非洲猪瘟检测一般流程为了帮助实验人员更便捷地进行非洲猪瘟检测，Archimed 定量PCR 在实验条件设置、孔板设置及数据分析等方面均进行了充分优化，力争以最智能化的方式帮助研究者完成该类型实验。
利用Archimed 软件智能设置向导，完成一个非洲猪瘟荧光定量PCR 分析实验只需简单的6个步骤：1. 创建实验：点击启动界面右下方“创建”按钮，或者通过菜单栏选择“创建”，可以创建全新的实验流程；选择实验类型：根据实际使用的实验类型进行选择，这里选择相对绝对定量。
创建实验•创建新的相对定量实验文件并设置实验属性设置反应条件•进行相对定量运行条件的设置设置孔板•对反应孔进行属性及分布设置运行实验•开始非洲猪瘟荧光定量PCR 运行查看及分析结果•查看非洲猪瘟荧光定量图谱实验结果并进行分析导出实验结果•将图谱及实验数据导出保存以进行后续分析2.设置反应条件：实验属性设置完成后，点击页面左侧的运行条件或者右下角的下一步，进入运行条件设置界面3.设置孔板：运行条件设置完成后，点击页面左侧孔板设置或者右下角的下一步，进入孔板设置界面。
根据实际反应管放置的相应孔位选择反应孔，对样本及检测项目进行相应属性设置，并勾选分配至对应孔位中，待测样品孔位将显示相应设置属性注：Archimed孔板设置可以在反应运行前、运行中、或运行后设置，运行中或运行后进行孔板设置可以节省时间。
实时荧光定量PCR技术在临床中的应用
实时荧光定量PCR技术在临床中的应用实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种分子生物学技术，通过检测目标DNA片段的数量，能够实时定量分析DNA，具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点。
这使得实时荧光定量PCR技术在临床领域具有广泛的应用。
本文将从病毒感染、癌症检测、遗传疾病筛查以及微生物检测等方面，详细探讨实时荧光定量PCR技术在临床中的应用。
一、病毒感染的检测实时荧光定量PCR技术在病毒感染的检测中起到了关键作用。
例如，对于新型冠状病毒（COVID-19）的检测，实时荧光定量PCR技术能够快速准确地检测患者样本中是否存在病毒的核酸，实现对病毒感染的早期筛查和追踪。
此外，对于其他病毒感染，如流感病毒、乙肝病毒等，实时荧光定量PCR技术也能够高效地检测病毒的存在，帮助医生作出正确的诊断并进行相应的治疗。
二、癌症检测与监测实时荧光定量PCR技术在癌症的早期检测和监测中具有重要作用。
通过检测癌细胞DNA中特定基因的突变或染色体异常，实时荧光定量PCR技术能够帮助医生确定肿瘤的类型、分级和预后，并指导后续的治疗方案。
此外，通过监测治疗过程中肿瘤DNA的变化，实时荧光定量PCR技术还可以评估治疗效果和判断肿瘤的复发情况，为精准医学提供了重要的实验依据。
三、遗传疾病筛查与诊断实时荧光定量PCR技术在遗传疾病筛查与诊断中起到了至关重要的作用。
对于染色体异常、基因突变等遗传因素引起的疾病，实时荧光定量PCR技术能够准确检测遗传物质中的异常，帮助医生进行早期筛查与诊断。
例如，对于唐氏综合症的筛查，通过检测特定基因的拷贝数变异，实时荧光定量PCR技术能够判断胎儿是否存在唐氏综合症的风险。
四、微生物检测与定量实时荧光定量PCR技术在微生物检测与定量中也有重要的应用。
通过检测特定微生物的DNA或RNA，实时荧光定量PCR技术可以对微生物的存在与数量进行定量分析。
荧光定量PCR技术在植物基因组分析中的应用
荧光定量PCR技术在植物基因组分析中的应用PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是分子生物学领域中最常用的技术之一，它通过体外扩增DNA片段，能够在非常短的时间内从极少量的DNA样本中扩增大量的特定DNA序列，因此在DNA分子生物学和生物医学领域具有非常重要的应用价值。
而荧光定量PCR技术则在PCR技术的基础上结合荧光探针实现对PCR产物的实时同时定量检测，因此在基因检测、基因诊断、基因表达分析中具有广泛的应用。
本篇文章将重点介绍荧光定量PCR技术在植物基因组分析中的应用。
一、荧光定量PCR技术在基因检测中的应用基因在植物发育过程中发挥着重要的作用，不同的基因在不同的发育阶段和组织中具有不同的表达模式，因此通过荧光定量PCR技术可对植物基因进行检测和分析，并研究其在发育过程中的表达和功能。
在植物基因检测中，荧光定量PCR技术能够快速且准确地检测基因突变、拷贝数变异、基因重组和多态性等遗传学变异，从而帮助进行分子遗传学研究和基因功能分析。
例如，在植物的抗病性研究中，对相关基因（如R基因）的表达水平进行检测，可了解其在不同病原体侵染时的表达情况，从而为研究植物抗病机制提供基础。
而在植物基因编辑中，荧光定量PCR技术能够快速检测基因敲除或引入突变，从而帮助筛选出所需的编辑体系，为植物基因编辑技术的研究和应用提供技术支持。
二、荧光定量PCR技术在基因表达分析中的应用荧光定量PCR技术可以直接检测组织、器官和细胞中基因在数量水平的表达，从而揭示其在生物体内的功能和机制，因此在植物基因表达分析中具有较为广泛的应用。
通过荧光定量PCR技术，可以获得植物不同基因在不同生长时期、不同组织器官、不同环境条件下的表达水平，以及相应基因在不同发育阶段的表达规律，从而进一步研究其在植物发育和生长中的作用和机制。
例如，在植物抗旱、抗逆等研究中，研究相应基因在逆境应激下的表达变化情况，有助于揭示植物的适应性和生理机制，并为改良基因、遗传改良和再造抗旱植物提供理论依据和技术支持。
实时荧光定量PCR的高效应用
实时荧光定量PCR的高效应用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一项广泛应用于生物医学领域的技术，其在科学研究、临床诊断和生物工程等方面都具有重要的应用价值。
本文将探讨实时荧光定量PCR的高效应用，并介绍其原理、方法和应用案例。
一、实时荧光定量PCR的原理和方法实时荧光定量PCR是一种通过测量PCR反应过程中特定的荧光信号强度来定量测定目标DNA或RNA的技术。
其基本原理是在PCR反应过程中，由于酶的DNA合成活性和荧光探针的结合情况，荧光信号强度会发生变化。
通过检测荧光信号的强度变化，可以精确测定模板DNA的数量。
实时荧光定量PCR的方法包括产生荧光信号的方法和检测荧光信号的方法。
产生荧光信号的方法有DNA结合染料法和核酸探针法等。
检测荧光信号的方法则包括热电偶法和光电二极管法等。
不同的方法在不同实验条件下可以选择适合的荧光信号方法和检测方法。
二、实时荧光定量PCR的应用实时荧光定量PCR在实验室和临床研究中被广泛应用。
以下将介绍几个典型的应用案例。
1. 基因表达分析实时荧光定量PCR可以精确测定细胞或组织中目标基因的表达水平。
通过合适的引物和荧光探针设计，可以选择性地检测目标基因的表达。
这对于研究基因功能、疾病发生机理等具有重要意义。
2. 病原体检测实时荧光定量PCR可以快速、准确地检测病原体的存在。
例如，在临床诊断中，可以通过实时荧光定量PCR测定病毒、细菌等感染性病原体的数量，从而判断疾病的严重程度和预后。
3. 肿瘤检测实时荧光定量PCR在肿瘤相关研究中具有重要的应用价值。
通过测定肿瘤标记物的表达水平，可以帮助诊断肿瘤的类型、分期和预后。
同时，实时荧光定量PCR还可以用于检测微小残留肿瘤和监测治疗效果。
4. 环境监测实时荧光定量PCR在环境监测中也得到了广泛应用。
例如，可以使用实时荧光定量PCR测定水体中细菌的数量，判断水质是否达到安全标准。
荧光定量PCR技术及临床应用
肝炎病毒的PCR检测的意义
HBV及HCV的PCR检测确诊对手术相关科室待手术 病人十分重要。
明确术前病人是否具有传染性，对术中医务人 员的自身保护、术后病人敷料及分泌物的正确处理 以防止院内交叉感染，并避免因术前、术后诊断不 明确引起的医疗纠纷都具有直接的指导意义。
因此，建议手术相关科室从以上诸方面考虑， 常规进行HBV、HCV荧光基因杂交定量PCR检测。 也建议其他科室对相关病人进行检测。
而内源性DNA聚合酶法和斑点杂交分析法则可直接 确定临床标本中HBV DNA的存在。尽管比较敏感， 但只能检测到0.1pg的HBV DNA。
而荧光定量PCR方法则可检测到200copy/ml的 HBV DNA，因而是极为有用的方法。
22
肝炎病毒的PCR检测的意义
PCR方法可检出杂交法测定阴性而具有不同 HBV血清学标志的血清标本中的HBV DNA。 PCR方法可检出HBs Ag阳性而Hbe Ag阴性携 带者的HBV DNA。 PCR方法可检出慢性HBV感染 α－干扰素治疗后转阴的患者 血清中残存的HBV DNA。
扩增检测出，其它分支杆菌均否。 2. 敏感性 ★ 可检测1pg DNA，其相当于30个结核杆菌 的染色体DNA量。 3. 临床应用 ★ 快速 ★ 可检测无法培养的结核杆菌
18
临床上，结核性脑膜炎是小儿多发病，病情凶 险，所以早期快速诊断具有重要意义，而荧光 定量PCR方法整个过程才4~5小时，远较细胞 培养法为快，而且准确。
6
荧光基因探针杂交定量PCR技术
随着PCR技术的日臻成熟，已出现的荧光基 因探针杂交定量PCR方法把目的基因扩增、 特异分子杂交和荧光化学融为一体，使PCR 扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件 下进行， 并通过微机控制，实现了对扩增 产物进行实时 动态检测和结果的自动分析。
荧光定量PCR技术原理及应用课件
VS
荧光定量PCR技术在病原体检测和耐药基因研究中具有高灵敏度、高特异性和快速检测的优势，有助于及时诊断和治疗相关疾病。
详细描述
针对不同病原体，荧光定量PCR技术可以设计特异性引物和探针，实现对病毒、细菌、寄生虫等病原体的快速检测。同时，该技术还可以用于耐药基因的检测和研究，为抗生素的合理使用和疾病治疗提供科学依据。
总结词
荧光定量PCR技术在基因表达分析中具有重要作用，能够检测基因在不同条件下的表达水平，有助于深入了解基因的功能和调控机制。
详细描述
通过荧光定量PCR技术，可以设计特异引物，对目的基因进行扩增，并实时监测扩增过程中的荧光信号，从而计算出目的基因的起始拷贝数和相对表达量。这种方法广泛应用于基因表达谱分析、转录因子研究、药物筛选等领域。
荧光定量PCR技术原理及应用课件
荧光定量PCR技术概述 荧光定量PCR技术原理 荧光定量PCR技术的应用 荧光定量PCR技术的优缺点 荧光定量PCR技术的实验操作流程 荧光定量PCR技术的应用案例
contents
目 录
01
荧光定量PCR技术概述
荧光定量PCR技术的定义
荧光定量PCR技术是一种在PCR反应过程中，通过荧光染料或荧光探针标记特异性寡核苷酸，实时监测PCR产物量的变化，实现定性和定量分析的技术。
根据实验需求，准备PCR引物、探针、DNA模板等必要材料。
对采集的样品进行预处理，如DNA提取、纯化等，确保样品质量满足PCR扩增要求。
实验准备和样品处理
样品处理
实验材料准备
按照PCR反应体系的要求，将引物、探针、DNA模板等组分加入到反应液中。
反应液配制
确保反应液中的组分充分混匀，以保证PCR扩增的均匀性。
荧光定量PCR在临床医学中的应用
免疫耐受期：HBV复制活跃 免疫清除期 非活动或低复制期
慢性乙型肝炎
HBeAg阳性慢性乙型肝炎 HBeAg阴性慢性乙型肝炎
乙型肝炎肝硬化
代偿期肝硬化
失代偿期肝硬化
HBsAg与抗HBs
HBsAg在感染HBV两周后即可阳性。只要HBsAg阳
性就可诊断HBV感染，阴性则不能排除HBV感染。
核酸检测在HCV感染的诊断中要比HBV感染的诊断重要得多！
性病相关病原体的检测
性病在我国已成为 一个重要的公共卫生问 题，自99年以来，性病 的发生率居高不下，其 发病率在传染性疾病中 位居第3位，03年我国累 计报道性病病例数（HIV 除外）73万。浙江省为 高发区，位居全国第三。
常见性传播疾病病原体
丙肝病毒
HCV是单链RNA病毒 主要通过血液和血制品传播 感染后易转变为慢性肝炎或发展为肝硬化、肝癌
呈全球性分布，约1%普通人群感染
抗HCV IgM和抗HCV IgG
HCV抗体不是保护性抗体，是存在HCV感染的标志。 抗HCV IgM在发病后即可检测到，一般持续1～3个月。 如果抗HCV IgM持续阳性，提示病毒持续复制，易转 为慢性。 低滴度抗HCV IgG提示病毒处于静止状态，高滴度提 示病毒复制活跃。
HBeAg与抗HBe共存？
处于血清转换过程中 野生株与变异株同时存在
HBeAg水平与HBV DNA的关系
HBeAg阳性标本HBV DNA检出率90％左右 HBeAg与HBV DNA有着良好的相关性
HBeAg阴性/抗HBe阳性/HBV DNA阳性
HBV DNA水平一般较低
实时荧光定量PCR技术在番茄研究中的应用
实时荧光定量PCR技术在番茄研究中的应用自PCR技术问世以来，在生物医学领域得到广泛的应用，并不断衍生出许多新的技术使其应用泛围不断扩大，特异性和敏感性也不断提高。
实时定量PCR (Real-time Polymerase Chain Reaction, Real- time PCR)技术就是基于PCR技术基础上提出的，该技术于1996 年在美国Applied Biosystems公司研究成功。
目前，己广泛应用于植物学研究、医学研究、海关检疫等领域［1-3］o近几年，实时荧光定量PCR技术也有力地提高了番茄各研究领域的水平，而且发挥着越来越重要的作用，笔者将重点在这方面进行综合论述。
1 Realtime PCR技术原理所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
在PCR指数扩增期间，通过连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量［4-5］。
实时荧光定量PCR 的化学原理可分为两大类：探针类和非探针类，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，如TaqMan探针、分子信标等，建立在荧光能量共振转移原理(FRET) ±；非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加，常用的有SYBR Green和LCGreeno前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。
由于实时荧光定量PCR技术能在PCR整个扩增反应过程监的每一步循环中检测扩增产物扩增情况，也可以精确定量起始样品的量, 因此被认为是一项具有革命性的技术。
2实时荧光定量PCR的特点2.1速度快，简单便捷实时荧光定量PCR是在一个封闭的反应体系中进行，不需要电泳、染色的步骤，其操作步骤大大减少。
荧光定量PCR技术在植物研究中的应用
结果分析
荧光定量PCR结果分析方法通常包括以下步骤：
1、确定阈值：阈值是荧光定量PCR反应中荧光信号的基线水平，它可以消除 本底噪声对结果的影响。通过选择适当的阈值，可以确定PCR产物的起始点。
2、建立标准曲线：用已知拷贝数的标准品进行荧光定量PCR反应，得出荧光 信号强度与拷贝数之间的关系曲线。这个曲线可以用来确定未知样本的起始拷贝 数或浓度。
谢谢观看
未来发展方向方面，荧光定量PCR技术将进一步优化反应试剂和仪器设备， 提高实验的稳定性和可靠性。此外，随着生物信息学的发展，将会有更多高效的 数据分析方法和软件被应用到荧光定量PCR结果分析中，从而更好地挖掘实验数 据中的信息。在应用领域方面，荧光定量PCR技术将进一步扩展到植物基因表达 和基因突变的精细调控研究领域，为植物分子生物学和遗传学研究提供更深入的 工具和方法。
2、基因突变：荧光定量PCR技术还可以用于检测植物中的基因突变。例如， 通过比较正常植株和突变体植株中特定基因的序列，可以确定是否存在突变以及 突变的类型和位置。此外，荧光定量PCR技术还可以用于基因突变的频率和分布 研究。
实验操作
荧光定量PCR实验操作步骤一般包括以下步骤：
1、样本处理：收集待测样本，进行RNA提取和逆转录反应，得到cDNA模板。
荧光定量PCR技术在植物研究中的 应用
01 引言
03 应用场景 05 结果分析
目录
02 技术原理 04 实验操作 06 结论
引言
植物是地球上最重要的生物之一，它们对于维持生态平衡和人类生存至关重 要。因此，植物研究一直是一个热门领域。在植物研究中，基因表达和基因突变 的研究是非常重要的部分。荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR） 技术是一种非常有效的用于研究基因表达和基因突变的工具。本次演示将介绍荧 光定量PCR技术在植物研究中的应用背景和意义，技术原理，应用场景，实验操 作以及结果分析和结论。
荧光定量PCR原理及应用(科研版)
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104 103
Unknown contains 3108 copies
实时荧光定量PCR原理
阈值的选择
• 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一 个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置 上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
实时荧光定量PCR原理
55oC 65oC
MJR系列实时荧光定量PCR仪之 SYBR Green I 应用范围
起始模板浓度定量 融解曲线分析
---可区分单一产物、变异产物、多种产 物和（或）引物二聚体
基因型分析
MJR系列实时荧光定量PCR仪之 Molecular Beacons
Molecular Beacons
发夹型杂交探针
A
C
SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧
光。
MJR系列实时荧光定量PCR仪之 SYBR Green I 工作原理
PCR
Unbound SYBR Green I
Bound SYBR Green I
• SYBR Green I fluorescence increases upon binding dsDNA
MJR系列实时荧光定量PCR仪之
•实时荧光定量PCR原理
OUTLINE
•荧光定量PCR仪简介
•实时荧光定量PCR在科研上的应用
•实时荧光定量PCR实验设计实例
实时荧光定量PCR原理
OUTLINE
实时荧光定量PCR的原理：
•什么是实时荧光定量PCR •荧光化学 •双通道与内标 •基因分型（SNP）检测
实时荧光定量PCR原理
OUTLINE
实时荧光定量PCR的原理：
荧光定量pcr在动物疫病检测中的应用课件
目录
• 荧光定量PCR技术概述 • 荧光定量PCR技术在动物疫病检
测中的应用 • 荧光定量PCR技术的优势与局限
性 • 荧光定量PCR技术的实际案例分
析 • 未来展望
01
荧光定量PCR技术概述
荧光定量PCR技术的定义
荧光定量PCR技术是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号 的累积来实时监测反应进程，并可对模板进行定量的技术。
目前，荧光定量PCR技术已经广泛应用于医学、生物学、农业等领域，成为病原微 生物检测、基因表达分析、生物个体基因型鉴定等研究的重要手段。
02
荧光定量PCR技术在动物疫 病检测中的应用
在病毒性疾病检测中的应用
禽流感病毒
荧光定量PCR技术可快速、准确 地检测禽流感病毒，帮助及时发 现疫情并采取有效措施控制病毒
通过荧光定量PCR方法，能够实现对口蹄疫病毒的快速检测，有助于及时发现疫情并采取有效措施控制疫情扩散。
细菌性疾病的案例分析
副伤寒沙门氏菌（Salmonella）
荧光定量PCR技术能够特异、灵敏地检测副伤寒沙门氏菌，为食品安全和动物健康提供 保障。
大肠杆菌（Escherichia coli）
利用荧光定量PCR技术检测大肠杆菌，能够及时发现并控制由该细菌引起的动物疾病。
特异性高
自动化程度高
荧光定量PCR技术采用特异性引物和探针， 能够准确地识别目标基因，避免假阳性和 假阴性的发生。
荧光定量PCR技术可以实现自动化操作，提 高检测效率，减少人为误差。
荧光定量PCR技术的局限性
成本较高
荧光定量PCR技术所需的仪器和 试剂成本较高，对于一些资源有
限的地方可能难以普及。
荧光定量PCR应用实例
用TaqMan测CNV原理图
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CNV——TaqMan法（RT-PCR）
流程
Combine and load plate
Run on real-time PCR instrument
Analyze with software
The complete TaqMan® Copy Number Assay workflow takes only 3–4 hours
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SNP研究策略
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SNP——持续不断的热门研究
SNP（单核苷酸多态性） ——是由于单个核苷酸改变而导致基 因组核苷酸水平上的变异引起的DNA 序列多态性，包括单碱基的转换、颠 换、插入、缺失等。 SNP研究意义 ——遗传标记，具有已知性、可遗传 性、可检测性，用于疾病基因的定位 、克隆和鉴定； 基因多态与疾病相关性； 研究SNPs 本身对机体的影响，尤其 是疾病的易感性、个性化医疗；
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PCR芯片——用于信号通路 提供上百种不同信号通路和疾病相关基因功能分类的PCR芯片，种属包 括人、小鼠、大鼠、果蝇、猪、兔、鸡等，格式分为96孔和384孔两种 ,并且还有个性化定制芯片服务。
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PCR芯片——研究方法 实验流程
样品RNA 提取 反转录为 cDNA 配制PCR 反应体系 进行RTPCR反应
测序方法：常规测序，Pyrosequencing（焦磷酸测序），微 测序(SNaPshot) 基于杂交的方法：Taqman 探针法，Microarray 芯片法， 引物延伸：MALDI-Tof，dHPLC（变性高效液相色谱技术） 以构象为基础的方法：RFLP，SSCP，DGGE 溶解曲线：HRM(高分辨率溶解曲线分析技术)
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非编码RNA——生物离不开的“垃圾RNA”
非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA； 包括：rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，microRNA等； 特点：从基因组转录但不翻译成蛋白，在RNA水平行使生物学功能； 研究工作：1，大规模的鉴定新的非编码RNA；2，通过各种方法研 究非编码RNA的功能。 意义：广泛参与生命现象的各个环节，如生长、分化、发育、免疫，甚 至在肿瘤的形成中也具有重要的调控作用；
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SNP研究策略
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SNP——持续不断的热门研究
SNP（单核苷酸多态性） ——是由于单个核苷酸改变而导致基 因组核苷酸水平上的变异引起的DNA 序列多态性，包括单碱基的转换、颠 换、插入、缺失等。 SNP研究意义 ——遗传标记，具有已知性、可遗传 性、可检测性，用于疾病基因的定位 、克隆和鉴定； 基因多态与疾病相关性； 研究SNPs 本身对机体的影响，尤其 是疾病的易感性、个性化医疗；
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SNP——TaqMan (RT-PCR)
Eg. 运用TaqMan探针实时荧光PCR技术检测AKAP10基因2073A/G单核苷 酸多态性* TaqMan探针实时荧光PCR结果
不同的等位基因对应不同的荧光,根据2种荧 光的不同Ct值便可区分出不同的基因型。
如果是纯合子,则其中一种荧光占主导,相对 应Ct值较小;如果是杂合子,则2种荧光都有, 两者Ct值亦相近。由于每个样品扩增效率不 完全相同,所以结果显示同一基因型的个体 聚集成簇,而不是一个点
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CNV研究策略
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CNV——人类基因组变异研究新热点 拷贝数变异(Copy number variation, CNV) 是一种大小介于1kb到3Mb之 间的DNA片段的 缺失、重复、 倒位和易位，广泛存在于基因 组中，被认为个体间基因差异 的重要来源。 特点： 每个人都有CNV，自然发生的基因敲除和增加 突变率高，比SNP高100-1万倍 致病性，CNV和疾病间大都为因果关系（而非易感性）
另一种常用方法HRM，在后面章节有说明；
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PCR芯片研究策略
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PCR芯片——概念 运用高通量荧光定量PCR方法,在一张96孔或384孔板上同时对某个 信号通路相关的84个或372个基因的表达量变化进行检测。
96孔板
384孔板
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PCR芯片——优势及功能
数据分析
RNA质量 检测(分光 光度计检测 ，琼脂糖凝 胶电泳测 RNA浓度 和纯度)
按照逆转录 酶使用说明 将RNA逆 转录为 cDNA
需使用与 PCR Array 配套的RT² SYBR Green Master mixes
参数设置， 向含有基因 特异性引物 的96孔/384 孔加入等量 的反应液
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DNA甲基化——生物学功能
DNA 甲基化是基因 表达调控中一种常 见而又重要的机制 ，参与细胞分化与 增殖、生物体老化 、肿瘤发生等多种 重要生命活动。
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荧光定量PCR技术一般应用
核酸的定量 （RNA、DNA的定量） 核酸定性分析，如SNP分析
基因型分析
RNA变异分析 溶解曲线分析 （HRM）
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定性分析：杂合或纯合子鉴定， SNP分析，与疾病相关的等位基因 点突变检测 绝对定量：病毒和病原菌定量分析 ，基因拷贝数定量，GMO定量检 测等，基因表达研究， 转基因食 品检测 相对定量：miRNA表达量分析， 基因在不同样本中的表达差异药物 疗效考核
优势
免去引物设计和实验条件的摸索过程； 可以直接了解某信号通路或某疾病中的关键基因，不需要再检索大量 文献和进行前期实验验证； 实验结果可进行在线分析，得出准确的数据分析图； 可提供准确而可靠的实验数据，节约大量的时间和精力。
生物学功能
用于检测某信号通路或某生物学功能相关的一系列重要基因的表达量变 化，即信号通路
测序方法：常规测序，Pyrosequencing（焦磷酸测序），微 测序(SNaPshot) 基于杂交的方法：Taqman 探针法，Microarray 芯片法， 引物延伸：MALDI-Tof，dHPLC（变性高效液相色谱技术） 以构象为基础的方法：RFLP，SSCP，DGGE 溶解曲线：HRM(高分辨率溶解曲线分析技术)
计算PCR 芯片各个基 因的Ct值， 采用公认的 ΔΔCt
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DNA甲基化研究策略
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DNA甲基化——概念及特点
何为DNA甲基化？ 是在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(Sadenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二 核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基 的共价修饰过程。 DNA甲基化特点 不改变DNA的一级结构，但能引起染色质结构、 DNA 构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用 方式的改变； 因此在基因的表达及其调控、DNA的复制、细胞 的生长发育、X染色体失活、衰老以及许多人类疾 病发生过程中发挥重要作用。
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SNP——研究思路
1.寻找研究相关的SNP位点 1) 通过参考资料锁定研究相关的基因，通过数据库查到基因内部的SNP位点； 若数据库没有查到相关基因的SNP位点，需要提供实验组样本进行外显子测序比 对，找到SNP位点； 2) SNP芯片、二代测序检测找到相关SNP位点； 3) 查找相关的参考文献，找到研究相关的SNP位点。
3种荧光定量PCR技术检测microRNA原理图
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microRNA检测流程
提取总 RNA 加尾、反 转录 RT-PCR 扩增
引物设计
数据分析
运用SYBR Green荧光染料以及RT-PCR中,Poly聚合酶加尾法，我 们可对低至100ul的血清/血浆样本进行非编码RNA片段的高特异性定 量检测,并且还对517种miRNA进行了优化。
荧光定量PCR应用实例
上海启因生物科技有限公司
Http：//
1.概述
荧光定量PCR技术产生并成熟于上世纪90年代，由于该技术实现了PCR 从定性到定量的飞跃，能够对PCR反应的全过程进行实时监控，并且自 动化程度高，所以该技术从产生到现在短短的十几年时间，在科研及 检验领域获得了广泛的应用，成为分子生物学领域不可或缺的一项重 要技术。 原理：荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通过分析软件 对PCR的反应进行检测分析的技术。
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microRNA——热点研究
• 1993年在线虫内首次发现 RNA：lin-4 / • 其前体大概是70~100 nt左 右，形成标准的stem结构， 加工后成为21~23 nt的单链 RNA / • microRNA的作用机制是与 mRNA 互补，让 mRNA 沉 默或者降解。
Page 9
其他应用 microRNA分析 基因拷贝数分析（CNV） 表观遗传学（甲基化） 蛋白质分析 肿瘤稀有突变检测
……
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micro RNA HRM
PCR芯 片
荧光定量PCR在miRNA， PCR芯片等方面均有较广应 用；
CNV SNP DNA甲 基化
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microRNA研究策略
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PCR芯片——用于信号通路 提供上百种不同信号通路和疾病相关基因功能分类的PCR芯片，种属包 括人、小鼠、大鼠、果蝇、猪、兔、鸡等，格式分为96孔和384孔两种 ,并且还有个性化定制芯片服务。
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PCR芯片——研究方法 实验流程
样品RNA 提取 反转录为 cDNA 配制PCR 反应体系 进行RTPCR反应
全基因组测序
利用ABI7900/7300的绝对定量实时PCR系统,对检测样本的目标基因 (具有拷贝数多态)以及参照基因(没有拷贝数多态,通常每个基因组只有1 个拷贝)进行绝对定量,通过比较这两个检测值的比值可以估计检测样本 候选基因的拷贝数。Pag 17荧光定量实时PCR
CNV——TaqMan法（RT-PCR）
CNV——检测方法
比较基因组杂交（aCGH）
覆盖整个基因组，为高通量分析法，aCGH一般包括了两方面的杂交: 细菌人工染色体和寡核苷酸探针；
通过比较测试样本的信号强度与其他个体的强度,而确定每个位点 的相对基因组拷贝数；
SNP芯片
最直接，当一个地方有片段缺失，或者片段增多的时候，测序的 覆盖深度会马上显示出片段的增多或缺失，成本最贵；
用TaqMan测CNV原理图
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CNV——TaqMan法（RT-PCR）
流程
Combine and load plate
Run on real-time PCR instrument
Analyze with software
The complete TaqMan® Copy Number Assay workflow takes only 3–4 hours
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microRNA——常用研究方法
Northern Blot 初始样本量 敏感度 特异性 动态范围 5-10ug 低 低 2logs Microarray 5ug 中等 中等 4logs qRT-PCR 1-10ng 高 高 7logs
通量
实验时间
低
几天
高
几天
中等、高
几小时
是否区分前体与 是，少数无法 成熟miRNA
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CNV——研究意义
CNVs广泛存在于正常人群基因组；