TUNEL法检测细胞凋亡

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL 法检测细胞凋亡的原理。

TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。

针对问题2（TUNEL法的实验原理是什么？）：

基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。

1.TUNEL工作原理：简单说就是——TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。

其原理是；生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3'－OH末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

针对问题3（TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）：

1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；

2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30min，几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。

3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。

4. DAB显色条件的选择。一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min；我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。

5.PBS的充分清洗。我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。

6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。

针对问题5.细胞通透的原理、通透剂的浓度、孵育时间及其配制方法？

1. 蛋白酶K是消化膜蛋白，从而起打孔作用，增加膜通透性，使rTDT酶、抗体易透过细胞膜进入细胞反应；

2. 蛋白酶K一般工作液浓度为20ug/ml,但浓缩液可配制1~10mg/ml，可用PBS配制，也可用蛋白酶K缓冲液（100mM Tris HCl PH8.0+50mM EDTA）；

3. 蛋白酶K反应时间一般为10~30 min，具体时间长短与切片厚薄有关，4um左右的片子可以用10 min，但30 um左右的可用30 min，最终通过摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。

1. 抗原修复的原因是标本在甲醛等固定过程中，因发生蛋白交联和甲醛的封闭作用使抗原性降低，可以通过抗原修复使抗原决定族充分暴露出来；

2. 免疫组化中经常使用抗原修复，因为它的原理主要是抗原和抗体反应，通过抗原修复使更多的抗原与抗体结合，避免假阴性结果；

3. 而TUNEL的原理是dUTP与断裂的DNA上的3‘OH结合，故不需抗原修复；

4. 第一次TUNEL反应只需37度反应1h，或者延长时间即可

1. PROMEGA公司去年是40t要3300元（按100ul/片，实际可根据切片大小，加到30ul/pian）；而roche公司一般10t国内分装1300元（同样也是100/pian）；

2. 两个公司试剂盒内均没有PBS试剂，也不含DNase（以制作标准对照片）；

3. 我一般用4%PFA多聚甲醛，至少浸泡24 h后进行石蜡包埋、制片。此外，Promega公司在操作步骤中加了两步4%PFA以固定组织，试剂盒内无PFA，但提供了配制方法。

再次请教：

1.我做TUNEL复染用苏木素几秒钟，请问还用不用1％盐酸究酒精分化了？

2.我想用罗氏的TUNEL试剂盒做荧光显像，请问用什么封片，配方？

针对你的问题，我分析如下：

1. 盐酸酒精分化的目的：一方面是分色；另一方面是减弱过强的苏木素核染色。所以你若把握好苏木素着色，也可不分化。

2. 分化时间不能过长，否则阳性着色也褪色。

3. 一般荧光成像后可用高纯度甘油封片即可，若需长期保存，也可用无色指甲油片周围封固（必要性不大）。

这是我的操作步骤（Promega公司），看完后就知道了：

1. 脱蜡：用二甲苯浸洗5 min×2次；

2. 水化：用梯度乙醇（100％×5 min、100％×3 min、95％×3 min、85％×3 min、70％×3 min、50％×3 min）；

3. 浸洗：0.85％NaCl×5 min→PBS洗5 min；

4. 固定：浸入4％多聚甲醛15 min；

5. 浸洗：PBS 5 min×2次；

6. 细胞通透：用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K处理组织15（10~30）min RT；

7. 浸洗：PBS洗5 min；

8. 固定: 浸入4％多聚甲醛5 min；