超广谱β-内酰胺酶的基因分型及研究进展

综述超广谱β-内酰胺酶的基因分型及研究进展超广谱β-内酰胺酶（Extended spectrum beta-lactamases, ESBLs）是由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类、单环内酰胺类抗生素的耐药性酶，由于作用底物广泛而称之，并可在菌株间转移和传播[1、2]。

ESBLs主要由革兰氏阴性杆菌产生，尤其以肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌为代表。

肺炎克雷伯菌是呼吸道感染最常见的病原菌，由产ESBLs肺炎克雷伯菌引起的医院感染爆发流行时有发生[3]。

自1983年在德国首次报道分离出SHV-2型ESBLs以来，全世界许多地方不断有新的ESBLs检出[4]。

目前，产ESBLs细菌在临床标本中的分离率有增加的趋势，产ESBLs菌对氨基糖苷类、喹诺酮类和磺胺类交叉耐药也呈逐年上升趋势，这给临床感染的治疗带来了新的难题。

1.ESBLs的定义超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）是由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类、单环酰胺类抗生素的耐药性酶，由于作用底物广泛而称之[5]。

有人将ESBLs 理解为以下几条：主要由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌产生；在体外试验中可使三代头孢菌素和氨曲南的抑菌圈缩小，但并不一定在耐药范围；加入克拉维酸可使其抑菌圈扩大；临床对β-内酰胺类药物（包括青霉素和头孢类）耐药，但对碳青霉素类药物敏感；由质粒介导，往往由普通的β-内酰胺基因（TEM-1、TEM-2、SHV-1）突变而来。

2.ESBLs的耐药机制细菌对抗生素的耐药机制可分为以下几点：细胞膜通透性的改变，使抗生素不能或很少透入细菌体内到达作用靶位;灭活酶或钝化酶的产生，如β-内酰胺酶使抗生素的作用下降；与抗生素结合靶位（亲和力）的改变，使抗生素的作用下降；其他，如主动外排系统等。

对于ESBLs的近年来发现，其多种耐药性的产生与其质粒编码的ESBLs有直接关系。

随着第三代头孢菌素及其他β-内酰胺类抗生素的广泛使用，产ESBLs菌增加很快。

世界上许多国家和地区都有ESBLs菌流行的报道，国内也有许多地区产ESBLs菌的报道[6]。

因此国内外专家一致认为广谱头孢菌素类尤其是第三代头孢菌素的广泛使用产生的选择性压力是导致产生ESBL革兰阴性杆菌增加的主要原因。

由于ESBLs是质粒编码的，能通过接合、转化和转导形式，使耐药基因在菌间扩散，使敏感菌变成耐药菌（可在同种菌间进行或不同菌种间进行），且产生ESBLs菌耐药谱广，表现为多重耐药。

一旦流行暴发，极难控制。

即使感染控制后，携带ESBLs基因的耐药质粒仍可存在很长时间。

成为再次暴发感染的危险因素。

临床上使用抗生素应严格遵守药敏结果，防止高度敏感菌株在抗生素的选择下成高度耐药菌株，给临床治疗带来困难。

3.ESBLs的分型自1983年在德国首次报道分离出SHV-2型超广谱β-内酰胺酶ESBLs以来，全世界许多地方不断有新的ESBLs检出。

目前，ESBLs可分为TEM族、SHV族、CTX-M族、OXA族及一些不属于上述任何一个家族的类型，其中以TEM族和SHV 族种类最多。

近年来，CTX-M族、OXA族ESBLs也在迅速地增多。

3.1 TEM族广谱β-内酰胺酶TEM-1最初是从希腊1名叫Temoniera的病人血培养中分离到的大肠埃希菌中发现，并得以命名。

TEM型ESBLs是在TEM-1型基因序列的基础上由一至数个氨基酸的密码子突变而成，主要变异位点在104位谷氨酸—赖氨酸，164位精氨酸—丝氨酸、组氨酸，238位甘氨酸—丝氨酸，240位谷氨酸—赖氨酸。

变异可以发生在1-5个位点。

如今TEM命名已至TEM-199型。

TEM 型ESBLs主要从大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中发现，其他肠杆菌科和铜绿假单胞菌中也有发现。

3.2 SHV族SHV型ESBLs有水解头孢噻吩的巯基作用，SHV是巯基变量（Sulphydryl variable）的缩写。

SHV型ESBLs是在广谱酶SHV-1型基因序列的基础上由一至数个氨基酸的密码子突变而成，238位甘氨酸—丝氨酸，240位谷氨酸-赖氨酸是SHV型ESBLs最常见的情况。

值得注意的是，这两类突变也见于TEM型ESBLs 中，Ser[238]及Lys[240]分别是有效水解头孢噻肟和头孢他啶的关键位点。

如今SHV 命名已至SHV-45型。

SHV型ESBLs的产生菌以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌最常见，异型柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌也可产生SHV型ESBLs。

3.3 CTX-M族CTX-M型ESBLs主要对头孢噻肟（CTX）有高度的水解活性，我国有较高的检出率。

种系发生研究表明，CTX-M族β-内酰胺酶可以分为四组：第一组包括CTX-M-1和CTX-M-3；第二组包括CTX-M-2、CTX-M-4、CTX-M-5、CTX-M-6、CTX-M-7和Toho-1；第三组为Toho-2和CTX-M-9；第四组为CTX-M-8[7]。

CTX-M型酶对头孢噻肟、头孢他啶的水解能力比对青霉素强，相对头孢他啶来说，更优先水解头孢噻肟[8]。

除了能迅速水解头孢噻肟之外，CTX-M族还有一独特特征，即三唑巴坦比舒巴坦和克拉维酸能更好地抑制其活性。

所有的CTX-M族酶都有Ser237，提示该位点对其超广谱酶活性起重要作用。

3.4 OXA族OXA型酶是另一数量迅速增加的ESBLs，OXA型β-内酰胺酶主要水解苯唑西林（OXA），已发现的40余种OXA型β-内酰胺酶中有14种属于ESBLs。

OXA 型ESBLs主要发现于铜绿假单胞菌中，大肠埃希菌也有发现。

OXA家族最近出现一些不具有ESBLs活性的衍生物，它们包括OXA-20、OXA-22、OXA-24、OXA-25、OXA-26、OXA-27 及OXA-30。

3.5 其他ESBLs随着对ESBLs研究的不断深入，越来越多的新型ESBLs被发现，如：PER、VEB、CME、SFO、TLA等，这些酶的序列有一定的相关性，但同源性只有40%—50%。

这些酶都能赋予细菌对氧亚胺β-内酰胺类抗生素特别是头孢他啶和氨曲南耐药的能力，他们与类杆菌属某些种的染色体头孢菌素酶也有一定程度的相似，并有可能来源于该属[9]。

4.ESBLs的流行分布产ESBLs的细菌的检出率在不同的国家和不同的医院是不一样的，检出率的高低代表ESBLs细菌的流行状况。

肺炎克雷伯菌产ESBLs率在拉丁美洲最多（45.0%），欧洲23.0%，美国8.0%，加拿大5.0%，法国北部地区11.4%。

我国今年来对ESBLs产生株的阳性率流行病学调查显示：浙江省肺炎克雷伯菌ESBLs 阳性率为38.3%，大肠埃希菌为34.0%，上海华山医院分离的大肠埃希菌ESBLs 阳性率为23.6%，肺炎克雷伯菌高达51.0%，广州地区分离的大肠埃希菌ESBLs 阳性率为36.4%，肺炎克雷伯菌为31.7%[10]，北京医院肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌产ESBLs阳性率分别为18.9%和29.1%[11]。

抗生素尤其是三代头孢菌素的应用与ESBLs的感染流行有相关性。

由于细菌培养、药敏结果需要时间，临床不合理用药较为普遍，抗生素的广泛应用，且临床医师为减少风险多选用三代头孢菌素或联合使用抗生素，促进了有质粒介导ESBLs细菌的扩散，敏感菌因抗生素的选择性压力而被大量杀灭后，耐药菌得以大量繁殖而成为优势菌，同时抗生素的选择性压力也加快了细菌突变的速度，有报道ESBLs的爆发，流行与头孢他啶消耗量成正相关，而限制头孢他啶的使用则可减少ESBLs菌的流行[12]。

ESBLs的发生率常以医院中ICU、神经内科、老干部病房及呼吸科为高[7]，小儿ESBLs感染也处于较高水平[13、14]。

究其原因，与这些病房患者病情较重、免疫力低下、合并基础疾病、侵袭性操作以及免疫抑制剂的应用等因素有关。

由于产ESBLs的细菌β-内酰胺酶基因位于质粒上，可以通过转化、转导、转座、接合转移和整合等方式将耐药性在不同细菌中传递，从而造成严重的医院交叉感染和院外耐药菌的扩散。

尤其重症监护病房是ESBLs菌的主要来源[5]。

产ESBLs的细菌呈世界性分布，但不同地区流行的ESBLs基因型不同。

如：美国主要流行TEM、SHV型ESBLs；阿根廷以CTX-M型ESBLs为主[15]；西班牙主要流行CTX-M-10，其次是SHV-2和TEM-4；希腊以SHV-5为主，其次为CTX-M 型的ESBLs；日本流行Toho-1和SHV-12；我国也有CTX-M型和SHV型ESBLs流行的报道，但主要流行基因型为CTX-M[16、17]。

5.ESBLs的检测方法传统的ESBLs检测方法很多：如单纸片法、双纸片协同法、圆环估计法、琼脂稀释法、抑制剂增强扩散法等。

一般来说，ESBLs的检测主要分筛选法和确诊2个层次。

随着现代分子生物学的快速发展，分子生物学分型技术已用于流行临床研究，旨在直接分析菌株基因的相互关系，脉冲场凝胶电泳（PFGE）是目前公认的细菌基因分型的“金标准”，但是需要昂贵的仪器和内切酶，而且操作起来比较繁琐，所需时间较长。

琼脂糖凝胶电泳研究细菌基因分型是目前流行病学调查研究的热点[18]。

5.1双纸片协同试验此试验是法国研究者Jarlier等建立的。

其原理是产ESBLs细菌对头孢菌素耐药，但能被酶抑制剂如克拉维酸所抑制，因此在M-H平皿中央放置含酶抑制剂的药敏纸片（如氨美汀），在其周围以一定间距放置头孢他啶、头孢曲松、氨曲南等抗生素药敏纸片，若两种纸片间产生葫芦状增大的抑菌圈，则为ESBLs 阳性。

此法对产ESBLs细菌的检出率为98.1%，且经济实用，但不能检出TEM-12类ESBLs。

此外Philip E.Coudron等还建议，因在肠杆菌科的同一种属的细菌中，可能既包括产酶株又包括非产酶株，故应检测多个菌落。

5.2仪器鉴定可用法国Biomeriux的Vitek仪器及其药敏卡，通过测定头孢噻肟、头孢他啶及它们与酶抑制剂棒酸的联合制剂对待检菌的抑制作用而进行测定，此法对产ESBLs细菌的检出率为99.5%。

5.3等电聚焦电泳细菌培养后，用超声波破碎提取细菌中的β-内酰胺酶，离心后去除未破碎的细胞及细胞膜，然后在一定pH值梯度的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，以已知等电点的β-内酰胺酶作标准，即可测得某一等电点的超广谱β-内酰胺酶。

Chanal等研究表明，用IEF法鉴别ESBLs非常有效，但只有酶的耐药模式符合酶的典型特征时才适用。

5.4 质粒DNA的PCR检测首先提取细菌的质粒DNA，在用合适的引物在体外特征性扩增超广谱β-内酰胺酶基因片段，然后用琼脂糖凝胶电泳或Southern印迹法检测扩增产物，即可以确定ESBLs的类型。

另外，利用寡核苷酸探针还可以检测超广谱β-内酰胺酶基因的点突变。