病毒感染实验诊断名师编辑PPT课件

第二节 病毒分离与鉴定
一、病毒的分离方法
1.组织细胞培养 根据细胞的来源、 特性和传代次数分为： (1)原代细胞培养：将细胞悬液。 加入营养液培养。形成的单 层细胞，称之为原代细胞。
(2)二倍体细胞株：仍保持二倍体 特性。寿命一般为40～50代， 如人胚肺细胞。广泛用于病毒 分离和疫苗制备。
(3)传代细胞系：来于肿瘤细胞， 染色体特征类似肿瘤细胞。 常用的有人宫颈癌细胞(Hela)、 人喉上皮癌细胞(Hep-2)。
必须通过全面了解其特性才能 得到鉴定。 1.根据临床特点，流行病学资 料，标本来源，大致了解病 毒的一些特性，有助于确认 病毒的种类。
2.动物感染范围及特点 病毒感 染动物的范围、发病的潜伏期。 3.细胞培养特点。 综合上述资料作出鉴定。
病毒鉴定的方法
1.细胞培养的结果观察
病毒增殖后导致细胞发生:①细胞病 变效应(CPE)。细胞肿大，变圆堆积 成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞 融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内 出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；
第四章病毒感染实验诊断
一般原则是特异敏感、快速和简 便。首先根据流行病学和临床特 点，初步判断可能感染的病毒。
然后根据可疑病毒的生物学特点、 机体免疫应答和临床过程，以及 病人当前所处的时机，确定实验 诊断方法。
1.对潜伏期短，发病时尚无抗体产 生，可选择测定病毒颗粒、病毒 抗原或核酸。
2.对潜伏期超过十天的感染，可 检测特异性的IgM抗体来进行早 期快速诊断，及区别初次和再 次感染。
(3)宫颈或阴道拭子：采取病灶部 位分泌物，或将拭子伸人宫颈 约lcm停留5秒取出，冰浴立即 送检。用于分离 HSV、CMV。
(4)粪便标本：取2～4ｇ粪便加 10ml运送液立即送检，用于 分离腺病毒、肠道病毒和轮 状病毒。
(5)含漱液：用无菌生理盐水让 患者含漱。用于分离流感病 毒、副流感病毒、鼻病毒、 RSV等。
+ + + + + + +
脑脊液 唾液
+ + +
组织心 脑膜Fra bibliotek柯萨奇A和B组 +
精液
3．常见标本的采集方法
(1)血液：以无菌取抗凝血10ml。 抗凝选用100n／ml肝素钠。 用于分离CMV、HSV，、黄病 毒、EBV、HIV-1及新生儿肠 道病毒。
(2)脑脊液：以无菌取脑脊液 1～2ml，冰浴立即送检。 在4℃可存放72h。用于分 离柯萨奇病毒、ECHO病毒、 肠道病毒、腮腺炎病毒。
2．鸡胚接种 鸡胚是用于分离粘 病毒科、疱疹病毒、痘类病毒 的较为理想的材料。
3．动物接种 动物对病毒的敏感 性是不同的，选择合适动物十 分重要。小鼠、乳鼠、家兔、 豚鼠、猴等常用于分离病毒。
常用于病毒分离的细胞
细胞种类 可分离的病毒 HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、风疹病毒 HIV、HTLV、HHV-6 腮腺炎病毒、腺病毒 ECHO、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A、B组、RSV
(6)喉拭子：用压舌板避免唾液 污染，用拭子采取咽喉部表 面。用于分离腺病毒、CMV、 肠道病毒、HSV、流感病毒等。
(7)尿道拭子及尿液标本：尿道拭 子伸人尿道4cm转动3次，以获 得较多的上皮细胞，用于分离 CMV和HSV。 (8)尸检标本：死亡后尽早采集各 种器官，分别使用器械和容器。
二、标本的运送和保存
病毒抵抗力弱，室温中容易灭活， 用于分离培养的标本要尽快送检， 4℃下数ｈ或-70℃。 冻存液中加入甘油或二甲基亚砜 (DMSO)等作保护。
病毒传送培养基以Hanks液为基础加 灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加 青霉素100U／ml和链霉素100μg／ml， 为了抑制真菌的生长加入2．5μg／ml 二性霉素B或40μg／ml制霉菌素。
②不出现细胞病变现象。 ③细胞培养液pH的变化。
2.中和试验
病毒与特异性抗体进行免疫反应， 使病毒失去感染性，在细胞培养 和活的机体内不出现病变的试验。 常用细胞培养进行中和试验。如 果特异性抗体能中和病毒，使之 失去感染性，不出现细胞病变效 应，则该病毒为特异性抗体的同 型病毒，
用于病毒的分型诊断最具敏感和 准确性。也可用于检查患者病后 或人工免疫后，机体血清中抗体 增加情况。
原代细胞
非洲绿猴肾细胞 人单核细胞 人胚肾、肺细胞 恒河猴猕猴肾细胞 二倍体细胞株
人胚肺成纤维细胞株 WI-38、MRC—5 传代细胞系
Hela Hep-2
CMV、VZV、鼻病毒 腮腺炎病毒、腺病毒
Vero
柯萨奇A、B组、RSV 腺病毒、RSV HSV、RSV、风疹病毒 、轮状病毒、麻疹病毒
三、病毒的鉴定
第一节标本采集与运送
一、标本的采集
1.采样时间 尽可能在发病的初期， 急性期或患者人院的当天进行。
2.标本种类的选择 根据临床感染 的症状及流行病学资料，判断可 能感染病毒种类，选择相应部位 采取标本。
常见分离病毒标本的选择
病毒
单纯疱疹病毒 腮腺炎病毒 流感病毒 轮状病毒 HAV HIV
咽拭子 粪便 血液
3.空斑或蚀斑形成试验 空斑是指在单层细胞中被病毒感染引 起死亡的细胞区域，周围被活细胞包 围。一般而言，一个空斑是由一个感染 性病毒颗粒感染所引起的。不同的病毒 引起的空斑形态和大小不同。可进行病 毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可 进行病毒的鉴定。
4.干扰现象
某些病毒间存在着干扰现象， 如某些型别的鼻病毒能干扰 以后进入的副流感病毒的增 殖，从而阻抑后者的红细胞 吸附作用。
5.红细胞吸附及吸附抑制试验
正粘病毒，副粘病毒感染的宿主 细胞，病毒增殖后产生细胞病变， 但在细胞表面含有病毒某些抗原 成分(血凝素)，能吸附鸡、豚鼠 或猴红细胞。
可作为初步鉴定。如果在培养瓶 中加入相应的血凝素抗血清后， 不出现红细胞吸附现象，是为红 细胞吸附抑制试验阳性，可作为 病毒鉴定的依据。
3.对可在体内形成持续感染或潜伏 感染的病毒，可检测急性期和恢 复期双份血清的IgG抗体有无4倍 以上升高，或直接检测病毒核酸。
4.对原因不明或有新病毒感染时， 应采集标本进行病毒分离，同 时应采取双份血清以确认分离 的病毒为病原体。
5.对同一症状可有多种病毒引起的 情况，应同时检测几种相关病毒 的病毒颗粒、抗原或抗体， 6.对由多个型别组成的病毒可测定 它们的共同抗原。