分子信标

分子信标的原理分子信标的原理、、应用及研究进展

李舒艳 200425038

摘要：分子信标是一种设计巧妙的高灵敏度、高特异型的新型荧光标记核酸探针。本文介绍了分子信标的结构、原理、影响分子信标的主要因素、分子信标的标记及其在聚合酶链反应（PCR ）、核酸序列的分析、活细胞内核酸的动态检测、蛋白质(酶)与核酸的相互作用等方面的应用和研究进展。

关键词：分子信标；荧光核酸探针；荧光共振能量转移；聚合酶链反应（PCR ） 1996年Tyagi 和Kramer 报道了一种具有发夹结构的新型荧光核酸探针——分子信标(molecular beacon)[1]，最初目的是能在液相中定量测定靶标的量。自由状态时的分子信标呈发夹结构，此时由于荧光基团与猝灭基团靠得很近，荧光被猝灭；当与靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，荧光恢复。分子信标技术以其操作简单、灵敏度高、特异性强、可对核酸进行实时定量测定、甚至可以用于活体分析等特点不仅在生物学研究中有着广泛的应用，而且在疾病基因检测与诊断等生物医学基础和临床研究中也将充当重要的角色。近来,人们通过改变经典分子信标的结构，设计出许多新型的分子信标，如用ssDNA 链做环、用RNA-DNA 双链做茎的RNA-DNA 嵌合型分子信标，用PNA 链代替ssDNA 形成的PNA 分子信标等。新型分子信标的出现为分子信标的进一步应用拓宽了领域。

1．分子信标的结构

分子信标的设计一般包括三个部分：

（1）环状区：一般为长度15～30碱基的序列，能与目标分子特异结合；

（2）信标茎干区：通常为长度5～8个碱基的互补序列，茎干区与杂交后环状区-目标分子的双链结构之间的热力学平衡关系，使分子信标的杂交特异性明显高于常规的线状探针；

（3）荧光基团和猝灭基团，荧光基团一般联接在信标分子的5端；猝灭基团联接在3’端。图1为经典的分子信标结构，其中1—氨基萘—8—羧酸(EDANS)为荧光素,二甲氨基偶氮苯甲酰(DABSYL)为猝灭剂。分子信标中常用4—(4’— 二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)作为猝灭基团，德克萨斯红(TexasRed)、荧光素(Fluoresein)等作为荧光基团。

图1 经典分子信标结构

2．分子信标的工作原理

自由状态时，发夹结构的两个末端靠近，使荧光分子与猝灭分子靠近(约为7—10nm)。此时发生荧光共振能量转移,使荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。图2为分子信标的工作原理，当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时，信标茎杆互补区被拉开，荧光分子和猝灭分子距离增大。根据Foerster理论, 中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。杂交后，信标分子的荧光几乎100%恢复。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。

分子信标中最常用的猝灭剂是DABSYL，它对多种荧光素都有较强的荧光猝灭效率。近来Dubertret[2]等用金纳米粒子簇代替DABSYL做猝灭剂，人们还可以通过调节金属纳米簇的形状、大小和组成而得到不同的猝灭剂。由于金纳米簇对荧光试剂有着更高的猝灭效率，所以用金纳米粒子代替DABSYL后，大大提高了分子信标的灵敏度和特异性[2]。Demidov[3]等人设计出DNA或PNA无茎分子信标，与经典分子信标结构类似，只是不再含有双链结构的茎杆区。由于DNA戊糖骨架或PNA聚酰胺骨架具有很好的柔韧性，在无靶标存在的情况下，荧光分子与猝灭分子间的疏水作用使得无茎分子信标近似于一个闭环结构。当分子信标与靶标结合后，探针和靶标形成的双链具有刚性结构使荧光分子和猝灭分子分开，荧光恢复。无茎分子信标与经典的分子信标相比，它的优点在于无茎分子信标不含有与靶标无关的序列，在设计和合成上相对简单，另外无茎分子信标还具有响应快，特异性强等特点。但缺点是自由状态时，无茎分子信标的荧光本底较高。

分子信标靶序列猝灭基团杂交荧光基团

图2 分子信标工作原理

3．影响分子信标的主要因素

分子信标中荧光—猝灭基团间的距离是影响分子信标性质的最主要因素。根据荧光能量转移效率与荧光—猝灭基团间距离的6次方成反比。杂交后，荧光基团受激产生的荧光无法继续被猝灭基团吸收，分子信标荧光恢复。有文献报道，杂交后分子信标的荧光强度一般可增加数十倍甚至百倍[1,4]。

温度是影响分子信标行为的另一个重要因素。信标分子在较低温度时可以保持稳定的发夹结构，但较高的温度会破坏其稳定的发夹结构，甚至使其伸展为随机线状，此时荧光基团与猝灭基团分开，从而发射出荧光。其熔链温度取决于茎干区的长度、G-C含量以及缓冲液的离子强度。Bonnet等在有完全匹配靶序列存在的条件下考察了温度对分子信标性质的影响[4]，结果表明,研究体系的荧光强度表现为一个先减弱后增强的过程,其原理可从图3得到解释：

图3 温度对分子信标稳定性的影响

较低温度下，分子信标与匹配靶序列形成稳定的二元杂交结合状态(S1)，因而具有强的荧光信号。当温度逐渐升高时，由于完全互补序列变性分解成线性靶序列以及闭合的分子信标(状态S2)，荧光变弱；继续升高温度，分子信标发夹结构被破坏，其构像变

为线性结构(状态S3)，猝灭基团与荧光基团分开，荧光恢复。

信标分子的构象还受到环境pH的影响。pH过高时，茎干区碱基对之间的稳定结合被破坏，分子信标变性，荧光基团与猝灭基团分开产生荧光[1]。

由上可见，在进行分子信标的研究和应用时，茎干区和环状区的序列设计是关键所在。这种设计不仅决定了其构象，使在杂交后猝灭基团与荧光基团之间的距离达到足够大，而且决定了其合适的使用温度。就序列长度来看，通常探针序列比茎干区序列长两倍以上，可确保杂交引起结构的改变，杂交后荧光基团与猝灭基团间隔距离足够远而不再发生猝灭[1]。过长的茎干会使发夹结构过于稳定而给出假阴性结果，过短则发卡结构不稳定，容易给出假阳性结果。就序列碱基来说，应该使茎干区稳定状态适当，而环状区则应该避免任何可能的二级结构,否则分子信标茎—环结构将受到影响。

4．分子信标的标记

分子信标通常都是修饰一个单一的发光基团。在一个均相体系中，通过杂交后荧光信号的变化，一种分子信标即可检测一种靶序列。为了实现在一个均相体系中同时检测多种靶序列的目的，可将不同的分子信标修饰以不同的荧光基团。例如，Tyagi等利用四种不同的分子信标进行等位基因检测[5]。这四个信标分子环状区同一位置的一个碱基组成不同，所连接的荧光基团则分别具有不同的激发波长和发射波长。将四种分子信标等量混合放入四个试管中，并分别加入靶序列。只有与靶序列完全匹配的分子信标才能发生特异性结合，并在相应激发波长下发射出荧光。而且完全匹配序列的稳定性明显高于单碱基错配的序列。显然，应用这种方法，需要根据具体的荧光基团采用不同波长的激发光源和在不同的特定波长处采集相应的荧光信号。

为了采用单一激发光源,Tyagi等还报道了一种称之为波长移动分子信标(wavelength shift molecular beacon)的分子信标标记方法，在这种分子信标中，吸收激发光能量和将所吸收的能量以荧光发射出去的是两个独立的荧光基团，即荧光吸收基团和荧光发射基团。其结构如图4所示。在单一光源激发下，荧光发射基团可在可见光谱区发出不同波长的荧光。他们采用DABCYL作为猝灭基团联结在分子信标探针的3’端,荧光素分子作为荧光吸收基团联结在5’端中间相应位置，5’末端联结Texasred等荧光发射基团。分子信标中荧光基团与猝灭基团紧密结合，彼此共用电子，形成一个暂时的无荧光复合体，并将吸收的荧光以热能的形式散发出去。在这种复合体中，能量从荧光吸收分子传递到猝灭基团的速度远远高于由于荧光共振能量转移而引起的能量传递速度。在与目标