蛋白质层析技术

FDA 关于蛋白质产品的重要规定
• FDA无法认可使用含有便于纯化的标签的 蛋白质用于注射型药物. • FDA新调整 : 1996年提出, 可以对生产工艺 做调整, 只需申请相应变动部分的许可.
谢谢！
平台的操作（软件：知识结构）
• 离子交换后，采用疏水层析，可省去缓冲液交换 步骤（Buffer Exchange）； • 如有必要，浓缩后，Buffer Exchange，进行精制。 • 电导率更能反映影响离子交换的强度。 • 离子交换：平衡液应采用尽量低的离子强度，上 样体积不限；Donnan效应会造成1个pH单位的偏 离，是蛋白质柱上变性的重要原因；缓冲液的离 子强度越低，离子交换介质的电荷密度越大偏移 越大。
结构：典型层析介质的放大观察
孔的结构可分为三种类型
整体柱（monolithic column ）
• 概念：它是由单体、引发剂、致孔剂等混 合物通过原位制备而成一个棒状整体,具有 制备方法简单、内部结构均匀、重现性好、 具有较高的柱效和可进行快速分离等优点, 已在反相色谱、离子交换色谱、疏水作用 色谱、亲和色谱、体积排阻色谱中获得了 应用,并成功分离了肽、蛋白质、类固醇、 芳烃、聚合物、低聚核苷酸、氨基酸等物 质。
蛋白质变性因素
• 自然状态下，细胞中蛋白质浓度：200-400mg/ml 动物血液中蛋白质浓度：50-70mg/ml 。 • 蛋白质在生理条件和进化过程中从来没有单独的 在纯化中那样的低浓度下存在过。 • 多亚基蛋白中，亚基-亚基解离与浓度直接相关， 很多蛋白质分子的不稳定，就是亚基间结合力不 够强造成。 • 表面张力，气泡，振荡，剪切和稀释都会造成蛋 白质失活。
FDA 关于蛋白质产品的重要规定
• FDA认为: 电泳的单一条带还不足以作为蛋 白质纯度的证据 ,要结合其他更灵敏的定量 的方法,比如质谱; • FDA规定: 除了要测定蛋白质的纯度,还要考 虑蛋白质的翻译后修饰及其生物学活性; • FDA规定: 如果有蛋白质中有必要的糖基化, 那就要证明产品蛋白质中确实有这个糖基 化;
平台的操作（软件：知识结构）
• pH：阳离子通常低于pI 一个pH单位 阴离子通常高于pI 一个pH单位 • Sticky protein：40% 在某pH附近，与阳离 子和阴离子层析介质都结合。 • pH 的筛选主要是考虑分离的选择性而非载 量。 • 参数获得≤２.５％上样体积运行离子交换及 疏水，样品不需平衡。
平台的操作（软件：知识结构）
• 实验室规模的层析应采用不大于50 µm的离 子交换或疏水介质，应具有10 cm左右，则 不少于 600个理论塔板。 • 精制：高效预装柱1 - 5 ml，10 µm左右粒 度，如Mono系列等。 • 通常条件下，采用15 µm的 Resource精制 也可以达到较好效果。
IgG样品中蛋白酶的降解作用
阳离子交换与DNA污染
蛋白质分子的柱上失活
• 分离过程可能是蛋白质失去稳定因子，如 辅酶，金属离子等。 • 吸附作用可能降低失活过程的活化能,加快 蛋白的动力学过程。一般蛋白质的变性或 失活过程活化能125kj/mol,高于一般化学反 应的活化能，从而对温度的变化十分敏感。 • 由上，对于易在层析过程中变性或失活的 蛋白质分子，30度的温差会造成5-200倍的 活性回收差别。
整体柱（monolithic column ）
• 目前,商品化的聚合物整体柱有CIMTM,硅 胶整体柱有SilicaRODTM和 PrepRODsTM。 • 默克 整体柱 ChromolithTM
蛋白质纯化平台
纯化平台的硬件结构
• 中心设备：中压至高压层析仪 • 辅助设备：过滤装置，超滤装置，离 心机，蛋白质电泳等
设计合理的方案
• 各种机制交替试用，相互衔接、补充。（3步）
• 分辨率：疏水层析<离子交换层析 • 载量： 疏水层析<离子交换层析 • 选择性：疏水层析>离子交换层析
同样的起始样品不同的纯化方案
通常纯化流程：选择性> 分辨率 >载量
• 目标蛋白为碱性蛋白，在中性附近运用阳离子交 换，选择性好，除核酸多糖； • 目标蛋白为酸性蛋白，则第一步层析采用分子筛， . - . 最好此前将溶液脱盐，并在含０ .２-０.４ M NaCl的缓冲液中运行，缓冲成分视下一步而定。 • 如果介质含聚丙烯酰胺，则应含Tris 等含氮的缓 冲成分，减少 π-π互相作用造成的吸附.
梯度洗脱还是分步洗脱
• 蛋白质层析因为保留值差别很大，比如相差1000 倍，这样能够洗脱的唯一方法就是强度递增的洗 脱——阶段洗脱或连续梯度洗脱
样品通常特点及对后续纯化的影响
• 大多数蛋白将带负电荷，样品会含一定量 核酸； • 运行层析，则蛋白浓度不应大于10 mg/ml。 • (NH4)2SO4 沉淀，通常蛋白浓度1-5mg/ml.
吸附层析造成的失活
• 有些蛋白在柱上存留的时间长后，活 性也易丧失。
蛋白质层析过程中可能的氧化损伤
氧化损伤的直接后果和预防
• 产生部位：蛋白质的金属结合部位。 • 后果：造成蛋白质结构变化，失活，对蛋 白酶更加敏感。 • 预防： 避免金属离子与还原性保护剂同时存在。 掩蔽和消除还原型金属离子物质是最有效 的减轻蛋白质氧化损伤的途径。 （EDTA可把金属络合，但不能阻止金属离子的氧 化作用）
蛋白质纯化平台的结构和组成
• 含量较高的蛋白质纯化，基本可以在 三个层析步骤中实现。 • 用目标蛋白的三个独立的物理化学性 质进行层析分离。
几步完成纯化？
综合考虑样品的各种性质
稳定性（ 值 活性） 稳定性（PH值，活性） 疏水性 分子大小，形状。 分子大小，形状。 关键辅助因子 • • • • • • 关键杂质 产品浓度 引进污染物 产品纯度 单位成本 产量
层析介质
• 生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生
物大分子失活，没有生物化学毒性—过强 吸附、泄露。
• 化学稳定性：在生物大分子存在的化学条
件下是稳定的。
• 必要的机械性能：流体中的耐压性、弹
性。
化学组成：亲水多孔高聚物等
亲水的介质对蛋白有吸附作用，因此要在层析 溶液中加一定浓度的盐。
聚合物机体孔的结构
FDA 关于蛋白质产品的重要规定
• FDA规定: 一个生产程序,每次必须产出相同 数量和品质的产品, 否则不会被认可; • FDA规定: 必须进行蛋白质产品的生物活性 测定 ,测定方法必须证明是规范和有效的,并 且要确保每次生产的产品最后的活性和效 用是一致的; • FDA规定: 产品必须有确切的可以耐受运输 时间和货架时间;
平台的操作（软件：知识结构）
• E.Coli表达产物的抽提以渗透冲击法为宜，没有 特殊原因不要使用超声破碎法。 • 0°C ，20%蔗糖，10mM左右缓冲液，含 2.5mMEDTA 2.5mMEDTA，高渗后，加入低渗液，迅速充分 悬浮。如果必要，应含DTT至2mM左右； • 均浆液组成原则：离子强度尽量低：≤50mM，有 时需DTT，不一定加EDTA，可考虑加PMSF，但 此时不宜用Tris等胺类缓冲剂；
平台的操作（软件：知识结构）
• 经验：具有3000个理论塔板的凝胶过滤可 近似地将分子量相当2倍的蛋白质完全分开； 6000个理论塔板可分开相差1.5倍分子量的 蛋白。 • 通常，要达到3000个理论塔板的分子排阻 层析柱，如用50µm的介质，流速<20cm/h （参照产品说明书）应在80cm以上至 120cm，上样<5%，一般1-2%。
动态载量
动态载量是制备层析的重要概念，也 是制备层析介质的重要性指标。层析 过程是偏离平衡态的，流速越大，偏 离越远，反之亦反。
层析介质颗粒度与动态载量
吸附动力学与动态载量
从动态载量看上样条件
吸附蛋白的大小与动态载量
吸附等温线
• 概念：一定温度下溶质分子在两相界面上进行的 吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关 系曲线。
停留时间
流速
• 影响介质载量
流速
• 影响分辨率
FDA 关于蛋白质产品的重要规定
FDA要求: 对于用于注射用的蛋白质产品， 纯度至少要达到99.99%,而且要保证产品纯 度和活性的重现性; FDA要求: 如果原材料中有不寻常的物质 (unusualmaterial ),则生产者必须建立相应 的检测方法来特异的检测这个物质;
整体柱（monolithic column ）
• 高流速 整体化色谱柱的总孔率约80％，填料具有优越的 渗透性，即便使用高流速进行色谱分离，柱压也 很低 ；基本不会因脏的样品而受堵，寿命长。 • 高柱效 整体化色谱柱的柱效和3.5µm粒径的颗粒型色谱 柱相当，而大大优于5µm粒径的色谱柱。并且， 整体化色谱柱在流速升高时，柱效下降程度低。
蛋白质结构组计划
• 目标：用十年的时间获得一万种蛋白的三 维结构。 • 但是只有57%被克隆的蛋白能够成功表达。 • 而且在这些表达的蛋白中，只有 28% 的重 组蛋白能够被纯化出来。 • 最终，只有2%-10%的最初的目标蛋白被成 功的建立。
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蛋白质层析分离纯化机制
• • • • 电荷不同：离子交换层析 大小、形状：凝胶过滤层析 疏水区域：疏水层析 特异性：亲和层析 （选择性是最优秀 的）
整体柱（monolithic column ）
• 大孔结构 平均孔径为2µm的大孔网络，允许流动相 快速通过，反压极低，从而大大降低了分 离时间。 • 中孔结构 大量孔径为13nm的“中孔”，保证了目标 分子在色谱分离过程中吸附/解吸附作用所 需的表面积，因此，整体化色谱柱可以在 高流速时保持高柱效。
平台的操作（软件：知识结构）
• 样品处理及准备工作 • 用SDS-PAGE监测整个流程 • 富含目标蛋白的提取物的获得：应采用尽 量低强度的抽提方法。 • 通常PBS或TBS抽提能力过强，没有必要. 低渗更有利于破碎，甚至可用水进行抽提 （如1：4左右）；
平台的操作（软件：知识结构）
• 无特殊理由，pH应准确控制在中性附近， 尽量用酸性buffer； • 缓冲容量：在pKa附近 缓冲容量正比于缓 冲溶液的总浓度； • 最好运用(NH4)2SO4沉淀，缩小体积，便 于保存。终止生化代谢反应，除糖、脂类。 个别情形中会造成不可逆沉淀；
蛋白质层析技术
导言
• 生物技术有三大部分：生化分离技术； DNA重组及基因转移技术；免疫检测技术。 其中生化分离技术是生物技术的基础和支 柱。 • 层析是最有效的分离手段，也是最重要的 蛋白质纯化工具。层析主要是物理方法， 是混合熵减少的过程，必然消耗自由能。 • 基因工程下游的核心是层析。 • 层析技术的理论和实践已高度发展和完善。