蛋白质层析技术
蛋白质纯化与层析技术
蛋白质纯化与层析技术蛋白质纯化是生物化学和生物技术领域中至关重要的过程，用于从混合物中分离和纯化目标蛋白质。
层析技术作为蛋白质纯化的关键步骤之一，它不仅可以选择性地将目标蛋白质从混合物中分离出来，还可以去除杂质，获得高纯度的蛋白质样品。
一、蛋白质纯化的基本原理蛋白质纯化的基本原理是根据不同的理化性质，如分子量、极性、电荷等特征，选择合适的纯化方法分离目标蛋白质。
常见的蛋白质纯化方法包括离心、超滤、电泳、沉淀和层析等。
离心法是通过调整离心速度和时间，根据不同蛋白质的分子量和密度差异，将目标蛋白质和非目标蛋白质分层离心，进而实现纯化。
超滤法则是利用滤膜对溶液进行筛选分离，减少蛋白质和其他分子之间的尺寸和质量差异，从而实现蛋白质的纯化。
电泳法是根据蛋白质在电场中不同的电荷和分子量特性，使其在凝胶上移动的速度不同，从而实现纯化和分离。
沉淀法则是通过添加适当的沉淀剂，使蛋白质凝聚成颗粒，经过离心后分离出来。
而层析法是根据蛋白质与层析介质之间的相互作用，通过选择性吸附和洗脱，将目标蛋白质从混合物中纯化出来。
二、层析技术的分类与原理层析技术是在纯化过程中广泛使用的方法，根据不同的工作原理和介质特性，可以将其分为几种不同的类型。
常见的层析技术包括吸附层析、凝胶层析、亲和层析和离子交换层析等。
吸附层析是通过目标蛋白质与特定层析介质之间的亲和力，使目标蛋白质被吸附在介质上，从而实现纯化。
凝胶层析则是利用介质中多孔性凝胶矩阵的分子筛效应，根据蛋白质的分子量和形状特征，通过不同的渗透效应将目标蛋白质分离出来。
亲和层析是利用目标蛋白质与特定配体（如抗体）之间的特异性结合，使目标蛋白质选择性地与介质上的配体结合，从而实现纯化。
离子交换层析则是基于蛋白质表面的电荷特性，通过电荷间的相互作用，使目标蛋白质与介质表面的离子互相吸附和洗脱，实现纯化。
三、层析技术的操作步骤和优化层析技术的操作步骤通常包括前处理、样品加载、洗脱和再生等步骤。
蛋白质层析技术
蛋白质互作分析
利用蛋白质层析技术分析蛋白质之间的相互作用，揭示生命活动 的分子机制。
蛋白质复合物分离
通过蛋白质层析技术分离蛋白质复合物，研究其结构和功能，有 助于深入了解细胞内复杂的生物过程。
药物靶点筛选
在药物研发过程中，蛋白质层析技术用于筛选药物作用的靶点， 为新药研发提供有力支持。
THANKS FOR WATCHING
荧光法需要使用荧光标记物，操作相 对复杂，成本较高。
免疫学检测法
免疫学检测法利用抗原-抗体反应的特异性，通过抗体对目标蛋 白质进行识别和检测。常用的免疫学检测法包括酶联免疫吸附 试验（ELISA）、免疫印迹和免疫沉淀等。
免疫学检测法具有高灵敏度、高特异性的优点，适用于蛋白 质的定性分析和定量分析。但该方法需要制备特异性抗体， 操作相对复杂，成本较高。
蛋白质层析技术的分类
根据固定相的不同
可分为凝胶电泳、滤纸电泳、薄层电 泳等。
根据分离机制
可分为等电点沉淀法、离子交换法、 亲和层析法等。
蛋白质层析技术的应用
01
蛋白质组学研究
用于分离和纯化蛋白质，为蛋白质 组学研究提供基础。
临床诊断
用于检测和分离疾病相关蛋白质， 辅助疾病诊断和治疗。
03
02
生物药物研发
疾病标志物检测
肿瘤标志物检测
蛋白质层析技术用于检测肿瘤标志物，辅助肿瘤的诊断和预后评 估。
感染性疾病标志物检测
通过蛋白质层析技术检测感染性疾病标志物，有助于快速诊断和指 导治疗。
代谢性疾病标志物检测
蛋白质层析技术在代谢性疾病标志物检测中也有广泛应用，如糖尿 病、肥胖症等疾病的标志物检测。
蛋白质相互作用研究
缺点
分离纯化蛋白质的方法
分离纯化蛋白质的方法蛋白质是生命体内最基本的分子，它们参与了生命体内的许多重要生物学过程，如代谢、信号转导、免疫防御等。
因此，对蛋白质的研究具有重要的科学意义。
但是，蛋白质在生物体内的含量很少，且与其他成分相混合，因此需要通过分离纯化的方法来获取纯净的蛋白质样品。
本文将介绍几种常用的分离纯化蛋白质的方法。
1. 溶液层析法溶液层析法是一种常用的蛋白质分离纯化方法。
它基于蛋白质在不同的化学性质和结构特征下在固定相中的不同亲和力，通过不同的溶液组成、pH值、离子强度等条件来分离纯化蛋白质。
溶液层析法的操作简单、效果好，可以分离出高纯度的蛋白质。
但是，它需要对分离材料的性质和蛋白质的性质有深入的了解，以便选择合适的分离条件。
此外，溶液层析法需要大量的分离材料和实验室设备，成本较高。
2. 凝胶层析法凝胶层析法是一种基于蛋白质分子大小、形状和电荷等性质的分离纯化方法。
它利用凝胶作为分离材料，通过分子筛效应、凝胶孔道大小和分子电荷等因素来分离不同大小和电荷的蛋白质。
凝胶层析法具有操作简单、分离效果好、成本低等优点。
但是，它需要长时间的分离过程，而且凝胶的孔径大小和材料的性质会影响分离效果。
此外，凝胶层析法只能分离相对较小的蛋白质，对大分子蛋白质的分离效果较差。
3. 电泳法电泳法是一种通过电场作用将不同电荷的蛋白质分离的方法。
它利用电泳移动速度与蛋白质质量和电荷密度之间的关系，将蛋白质分离纯化。
电泳法具有操作简单、分离效果好、成本低等优点。
但是，它需要专业的电泳设备和实验技能，而且对蛋白质的性质和电泳条件有较高的要求。
此外，电泳法只能分离相对较小的蛋白质，对大分子蛋白质的分离效果较差。
4. 亲和层析法亲和层析法是一种基于蛋白质与其配体之间的亲和作用来分离纯化蛋白质的方法。
它利用配体与蛋白质的特异性结合来分离纯化目标蛋白质。
亲和层析法具有分离效果好、选择性高、可重复使用等优点。
但是，它需要高纯度的配体和专业的实验技能，而且对蛋白质的性质和配体的选择有较高的要求。
蛋白质层析法
蛋白质层析法是一种用于分离和纯化蛋白质的技术，它基于蛋白质在不同条件下在固定相和流动相中的分配系数不同来实现分离。
层析技术的基本原理是将混合物中的各组分根据其物理或化学性质（如分子大小、电荷、亲和性等）在不同相中的不同分布和迁移速率来实现分离。
以下是一些常见的蛋白质层析技术：
1. **凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography）**：
- 也称为分子筛层析，利用凝胶的多孔结构将分子按大小分离。
小分子可以进入凝胶内部的孔隙，而大分子则被排阻在外部，因此迁移速度不同。
2. **离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）**：
- 根据蛋白质的电荷性质（如阴离子或阳离子交换树脂）来分离蛋白质。
带正电的蛋白质可以与阴离子交换树脂结合，而带负电的蛋白质则与阳离子交换树脂结合。
3. **亲和层析（Affinity Chromatography）**：
- 利用蛋白质与特定配体（如金属离子、生物大分子等）的特定相互作用来分离蛋白质。
4. **反相层析（Reverse Phase Chromatography）**：
- 基于蛋白质在不同极性溶剂中的不同保留行为来实现分离。
通常使用非极性固定相（如C-18柱）和极性流动相。
5. **尺寸排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC）**：
- 也称为凝胶渗透层析，分离蛋白质混合物中的不同分子量蛋白质。
6. **疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）**：
- 利用蛋白质与固定相之间的疏水作用来分离蛋白质。
蛋白质分离和纯化的方法和技术
蛋白质分离和纯化的方法和技术蛋白质是生命体中极其重要的一种物质，它是细胞的基本组成单位，参与了多种生物学过程。
研究蛋白质在细胞中的功能与结构，需要对蛋白质进行高效、可靠的分离和纯化。
本文将介绍常用的蛋白质分离和纯化的方法和技术。
一、离子交换层析离子交换层析是分离蛋白质最常用、最成熟的方法之一。
其原理是利用蛋白质的电荷性质与离子交换树脂的对应性质，进行蛋白质的分离。
离子交换树脂可分为正离子交换树脂和负离子交换树脂两种类型。
正离子交换树脂的功能基团有负电荷，故可吸附具有正电荷的物质，例如氨基酸、多肽或蛋白质N端等；负离子交换树脂的功能基团有正电荷，故可吸附具有负电荷的物质，例如天冬氨酸、谷氨酸、磷酸基或蛋白质C端等。
根据目标蛋白质的电荷性质，选择合适的离子交换树脂进行分离。
离子交换层析速度较快，可分离多种电荷性质的蛋白质，但对样品的盐浓度要求较高，易受pH和盐浓度的影响，操作时需谨慎。
二、凝胶过滤层析凝胶过滤层析是利用孔径大小对蛋白质进行分离的方法。
凝胶过滤层析常用的凝胶有玻璃纤维、纤维素等。
玻璃纤维凝胶一般有不同的颗粒大小，大的颗粒孔径大，小的颗粒孔径小。
蛋白质分子较小，可通过大孔径的颗粒进入凝胶孔隙，而较大的物质被挡在颗粒外部无法穿过凝胶。
因此，蛋白质经过凝胶时易出现分子量排阻效应，使得小分子在大分子之前流出，从而实现了蛋白质的分离。
凝胶过滤层析操作简单，无需特殊设备或条件，但分离程度相对较低，不适宜纯化目标蛋白质。
三、亲和层析亲和层析是利用蛋白质与亲和柱中特定配体发生特异性结合，从而对蛋白质进行分离的方法。
亲和层析适用于具有特定结构、功能或序列的蛋白质，例如抗体、标签化蛋白、细胞受体等。
常见的亲和柱配体有融合蛋白、金属离子、细胞色素C等。
蛋白质样品在亲和柱上进行结合，待不结合蛋白质被洗脱后对结合蛋白质进行洗脱。
亲和层析具有选择性强、纯化程度高等优点，但亲和柱的制备成本较高，操作上也需注意其特异性。
蛋白质分离技术-层析
阴离子交换基
强碱性，聚苯乙烯树脂 弱碱性，二乙氨氨乙基纤维素
基质
电荷基团 反离子 商品名
纤维素 —O—CH2——COO- ·Na+
N 纤维素-O-（CH2）2- +H（C2H5）2 ·Cl-
CM-纤维素 DEAE-纤维素
聚苯乙烯—————SO3-· Na+
聚苯乙烯——N+（CH2）4 ·Cl-
732阳离子树 脂
止大分子物与配基 结合 载体的空间障碍
载体影响了配基的空 间，特别是小分子 配基。需加碳氢链 “手臂”，长度需 适中。
二、亲和层析分离过程
1、装柱和平衡 2、上样、亲和吸附 3、洗脱
无效洗脱
吸附效率不高
有效吸附
影响吸附的因素 1、缓冲液离子成份强度、pH、温度等都有影响。 2、流速尽可能慢，<10ml/cm2.小时 3、上柱样品用平衡层析柱缓冲液溶解，浓度约20mg蛋白/ml. 4、上样体积取决于亲和力，低则上样量减少，一般柱床体积的5％。
操作过程： 1.装柱； 2.离子交换； 3.洗脱
三、离子交换剂与缓冲 液的选择
（一）离子交换剂的选择
必须考虑的影响因素 1．阴、阳离子交换剂的选择 2．强、弱离子交换剂的选择 3．不同离子型交换剂的选择 4．不同基质离子交换剂的选择
阴、阳离子交换剂的选择
测定pI 确定稳定pH范围
碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素c 酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、HCG
b．较强时：梯度洗脱，连续改变缓冲液浓度，使 洗脱能力逐渐加强
c、非常强时：强的酸、碱或加入脲、胍等变性剂 使蛋白质变性，而从配体上解离出来。然后再通过 适当的方法使待分离物质恢复活性。
（2）特异性洗脱法： 一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱：
蛋白质层析原理
蛋白质层析原理
蛋白质层析是一种常用的分离和纯化蛋白质的技术。
其原理基于蛋白质在不同条件下与固定相之间的相互作用差异。
层析柱内填充有具有特定性质的固定相，通常为聚合物凝胶或亲和性树脂。
当样品溶液通过层析柱时，蛋白质会根据其相互作用类型和特性与固定相发生不同程度的相互作用，从而实现分离和纯化。
根据蛋白质与固定相的相互作用类型不同，蛋白质层析可分为几种常见的类型，包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和性层析和逆向相层析。
离子交换层析利用蛋白质对固定相上带电离子交换作用的差异进行分离。
凝胶过滤层析则是根据蛋白质的大小选择性通过凝胶网孔的大小进行分离。
亲和性层析则利用蛋白质与特定配体之间的特异性结合作用进行分离。
逆向相层析则是根据蛋白质与固定相之间的亲水或疏水性质差异进行分离。
层析过程中，样品溶液先经过等离子体预处理以去除杂质物质，然后通过进样器加入层析柱。
通过改变流动相（即溶剂体系）、温度和pH等条件，可以调节蛋白质与固定相之间的相互作用，从而实现目标蛋白质的分离和纯化。
蛋白质可以通过梯度洗脱或者洗涤缓慢地从固定相中洗脱出来，不同分子量或特性的蛋白质被分离开来。
蛋白质层析是一种灵活、高效的蛋白质纯化技术，可以根据蛋白质的特性和需求选择不同的层析类型和条件，获得高纯度的蛋白质样品。
同时，与其他蛋白质纯化方法相比，层析技术对
蛋白质产量和质量的影响相对较小，因此广泛应用于生物医学、生物工程和生物化学等领域中的蛋白质研究和工业生产中。
根据分子大小分离蛋白质的层析技术
根据分子大小分离蛋白质的层析技术蛋白质是生命体内重要的组成部分，在生命的各个过程中都发挥着至关重要的作用。
分离和纯化蛋白质，是开展蛋白质相关研究的前提和关键。
分子大小是影响蛋白质结构和功能的一个重要因素，因此，根据分子大小分离蛋白质的层析技术应用广泛。
胶体电泳是一种通过电场驱动带电粒子（涂层蛋白）在胶状介质中运动的技术。
随着电泳时间的推移，蛋白质会在胶体电泳中沿电场方向移动，并在不同位置出现带状。
这些带状代表了不同大小、电荷和形态的蛋白质，从而实现了蛋白质的分离和纯化。
凝胶过滤层析技术是基于蛋白质分子大小的一种分离技术。
它使用别称为Sephadex的高分子树脂作为填料，将蛋白质溶液通过柱子或柱状材料，使大分子蛋白质无法进入树脂孔隙，而小分子蛋白质则可以进入树脂孔隙内，从而实现了分离。
分子量越大的蛋白质会沿着柱子的表面流动，分子量较小的蛋白质会进入树脂颗粒内部，因此可以在凝胶孔隙中分子大小的差异进行分离。
离子交换层析技术是一种通过电荷相互作用分离蛋白质的技术。
该技术使用带正电或负电的固定颗粒，不同电荷的蛋白质会与固定颗粒进行相互作用。
通常情况下，具有相同荷负性的蛋白质将更紧密地结合于离子交换树脂中，并较难从中被洗脱出来。
使用不同盐浓度的溶液，可以通过离子交换层析进一步洗脱蛋白质。
亲和层析是一种利用蛋白质之间的特殊作用力进行分离的技术。
它是一种选择性纯化技术，通过特殊的柱子层析填料，将表面特异性结合的蛋白质吸附在固定颗粒的表面。
在分离过程中，具有特定亲和性的分子可以与填料表面固定的某些物质特异地结合。
与这些物质不结合的分子则在纯化过程中被排除。
亲和层析的优点是可以选择性纯化目标蛋白质。
总之，根据分子大小分离蛋白质的层析技术是一种重要的蛋白质分离和纯化技术。
通过不同的层析技术，可以针对不同的蛋白质特性实现利用分子大小、电荷和特殊作用力进行分离。
这些技术在学术研究、医学诊断和新药开发等领域都有广泛的应用。
蛋白质疏水层析原理
蛋白质疏水层析原理一、蛋白质疏水层析原理嘿，小伙伴们，今天咱们来唠唠蛋白质疏水层析原理这个超有趣的事儿。
蛋白质疏水层析呢，就是利用蛋白质表面的疏水区域和层析介质上的疏水基团之间的相互作用来实现分离的。
想象一下啊，就好像一群小动物，有些特别喜欢干燥的地方，有些就比较亲水。
蛋白质里那些有疏水区域的就像喜欢干燥的小动物，它们和层析介质上的疏水基团就特别容易“看对眼”，然后就结合在一起啦。
那这个原理在实际操作中是怎么体现的呢？咱们先从层析介质说起。
这些介质有各种各样的类型，它们的疏水基团的分布和性质都不太一样。
比如说有些介质的疏水基团比较多，有些就相对少一点。
当我们把含有蛋白质的混合溶液加到这个疏水层析柱里的时候，那些有较多疏水区域的蛋白质就会更快、更牢固地和介质上的疏水基团结合。
而那些疏水区域比较少的蛋白质呢，就没那么容易结合，可能就直接流过去了。
在这个过程中，还有一个很关键的因素就是洗脱液。
洗脱液就像是一个“调皮的小助手”。
我们可以通过改变洗脱液的成分，比如说改变它的盐浓度或者加入一些有机溶剂，来调节蛋白质和介质之间的相互作用。
如果我们增加盐浓度，就可能会让蛋白质和介质之间的结合变得更松散，这样就可以把结合在介质上的蛋白质慢慢地“拉下来”，按照它们和介质结合的紧密程度不同，一个一个地被洗脱下来，这样就实现了不同蛋白质的分离啦。
另外呢，蛋白质的结构也会影响它在疏水层析中的行为。
如果一个蛋白质的疏水区域在表面暴露得比较多，那它就很容易被层析介质捕捉到。
但是如果它的疏水区域被其他结构或者基团给遮盖住了，那它就没那么容易和介质结合啦。
反正就是说呢，蛋白质疏水层析原理就是一个充满了微观世界里各种奇妙相互作用的过程，就像一场小小的生物分子之间的“社交游戏”，通过它们之间的亲疏关系来达到分离的目的。
提取蛋白质的4种方法
提取蛋白质的4种方法
1. 离子交换：离子交换是最常用的蛋白质提取方法，它使用含有
有机硫酸盐的磷酸盐溶液来提取pH4-9之间的膜蛋白。
它使用有机硫
酸盐作为极性试剂，使蛋白质从其离子溶液中沉淀出来并固定到树脂上，从而被提取。
2. 垂直层析：垂直层析是蛋白质提取的另一种方法，它使用流动
相来垂直运动横穿膜，从而把低浓度的蛋白质从其结晶盐溶液中提取
出来。
它是一种有效的后处理方法，能有效地改善提取的蛋白质的细节、稳定性和纯度。
3. 高通量流精密：高通量流精密设备可以将流体和分散体相分离，包括沉淀物和蛋白质。
它使用高压水流将杂质和悬浮物从蛋白质溶液
中清除，然后用不同的层析方法将蛋白质从其分散体中提取出来。
4. 柱单柱层析：柱单柱层析是另一种蛋白质提取技术，它使用多
种不同的树脂来分离蛋白质从其离子溶液中。
它将溶液通过固定式柱，并使用柱中所含的不同类型的树脂来把具有不同电荷性质的蛋白质从
溶液中提取出来。
根据分子大小分离蛋白质的层析技术
根据分子大小分离蛋白质的层析技术
层析技术（chromatography）是一种将混合物分离成单一组分的有效方法。
层析技术被广泛用于生物化学领域，特别是用于分离和纯化蛋白质。
分子大小层析技术是一种基于分子大小和形状差异分离蛋白质
的层析技术。
这种层析技术包括凝胶层析、透析、透析层析和分子筛层析等多种方法。
其中，凝胶层析是最常用的分子大小层析技术之一。
凝胶层析通过让混合物在凝胶柱中流动，根据蛋白质的分子大小和形状差异将蛋白质分离开来。
通常情况下，大分子会在凝胶柱中发现阻碍物，因此速度较慢；而小分子则可以较快地通过凝胶柱。
透析是另一种分子大小层析技术。
透析是通过半透膜将混合物分离开来。
半透膜可以过滤掉较大的蛋白质，但让较小的蛋白质通过。
因此，透析可用于分离较小的蛋白质。
透析层析结合了透析和层析技术。
这种技术既可以用于分离较小的蛋白质，也可以用于分离较大的蛋白质。
分子筛层析是根据分子的大小进行分离的技术。
这种技术使用的是具有特定孔径的分子筛材料。
大分子无法通过筛子而被留下，而小分子则可以通过筛子。
总之，分子大小层析技术是一种有效的蛋白质分离和纯化的方法。
根据需要选择合适的分子大小层析技术可以使其更加高效和准确。
- 1 -。
蛋白层析系统
蛋白层析系统
蛋白层析系统是一种常用的蛋白质分离和纯化技术。
它基于蛋白质在化学或物理条件下的差异而实现分离纯化的目的。
蛋白质层析系统通常包含以下几个主要组成部分：
1. 高效层析柱：蛋白质样品通过柱状填料进行分离。
填料通常是多孔性固体材料，如海洛因、DEAE、Octyl-Sepharose等。
填料的选择和操作条件是根据目标蛋白质的性质和纯化要求来确定的。
2. 缓冲液系统：用于保持适宜的pH值和离子强度，以确保蛋白质在层析柱中具有最佳的亲和性和分离度。
缓冲液系统通常包括运行缓冲液、平衡缓冲液和洗脱缓冲液，其配方也需要根据具体需要进行调整。
3. 层析设备：用于控制流速、压力和温度等操作参数。
常见的层析设备包括高压液相层析仪（HPLC）、低压液相层析系统（FPLC）和手动操作的层析设备。
4. 蛋白检测系统：用于检测和监测层析柱流出液中的蛋白质含量。
常见的检测方法包括紫外光谱、荧光标记和蛋白质浓度测定等。
蛋白层析系统的操作步骤通常包括样品预处理、层析柱平衡、样品加载、洗脱和回收等。
不同的层析技术还可以结合其他分离方法，如亲和层析、离子交换层析、尺寸排除层析等，来实现更精确的纯化目标。
蛋白层析系统广泛应用于生物医药研究和生产中，可以从复杂的混合物中高效地纯化目标蛋白质，满足药物研发、蛋白质结构分析和生物学功能研究等领域的需求。
蛋白纯化层析技术和工艺放大
原理
离子交换层析基于蛋白质带电性质差 异分离蛋白质。在一定pH值下，蛋白 质带电性质不同，与离子交换剂上的 离子发生交换，从而实现分离。
应用
离子交换层析常用于分离和纯化特定 类型的蛋白质，如酶、激素和抗体等。
疏水层析
原理
疏水层析基于蛋白质疏水性差异分离蛋白质。蛋白质与疏水配体结合后，通过改变流动相的pH值或离子强度， 使蛋白质与配体间的疏水相互作用减弱而分离。
原理
层析技术基于不同物质在固定相和流动相之间的分配平衡差异，从而实现分离。 目标蛋白与固定相的相互作用力较强，随着流动相的流动，逐渐从固定相中解 离并被收集。
常用蛋白纯化层析技术
凝胶过滤层析
利用不同大小的蛋白质分子在凝胶上 的扩散速度不同实现分离。常用凝胶 有Sepharose、Sephacryl等。
蛋白纯化层析技术的应用场景
生物药物研发
用于分离和纯化抗体、酶、蛋白质等生物药 物，提高药物的纯度和质量。
蛋白质组学研究
用于鉴定和分离蛋白质，促进蛋白质结构和 功能的研究。
细胞培养与分离
用于分离和纯化细胞中的蛋白质、细胞器等， 研究细胞内各组分的相互作用。
食品安全与质量控制
用于检测和纯化食品中的蛋白质，确保食品 的安全和质量。
标准化操作程序
制定标准化的操作程序，确保每批次 分离效果的稳定性和一致性。
流速与压力控制
采用先进的流速和压力控制系统，确 保分离过程中的稳定性和层析柱寿命。
放大效应评估
在小规模试验阶段对放大效应进行评 估，以便预测和解决大规模生产中可 能出现的问题。
05
未来展望与研究方向
新技术与新方法的发展
01
03
工艺放大技术
四种蛋白纯化的有效方法
四种蛋白纯化的有效方法四种蛋白纯化的有效方法在进行蛋白质研究和酶工程等领域的实验过程中，常常需要将目标蛋白从复杂的混合物中纯化出来。
蛋白纯化的目的是获取高纯度的目标蛋白样品，以便进一步进行结构和功能研究。
然而，由于蛋白质的复杂性以及其在混合物中的低浓度，蛋白纯化常常面临一系列的挑战。
为了克服这些挑战，科学家们开发了多种蛋白纯化的方法。
在本文中，我们将介绍四种常见而高效的蛋白纯化方法，并探讨其原理和适用性。
1. 亲和层析法：亲和层析法是一种利用目标蛋白与配体之间的特异性结合进行纯化的方法。
这种方法基于目标蛋白与配体之间的亲和力，通过设计具有高亲和性的配体来选择性地结合目标蛋白。
在实验中，我们可以将配体固定于固相材料上，例如琼脂糖或石蜡烃树脂，并将载有目标蛋白的混合物与这些固定化的亲和基质进行接触。
随后，非特异性蛋白质被洗脱，而目标蛋白则被保留下来。
目标蛋白可以通过改变条件（例如改变pH值或添加竞争性配体）来洗脱。
亲和层析法的优点在于具有高选择性和高纯度的优势。
然而，由于亲和剂的设计和合成需要具有相关专业知识，并且选择适当的配体是关键。
亲和层析法在不同的纯化过程中的适用性会有所不同。
2. 凝胶过滤层析法（Gel Filtration Chromatography）：凝胶过滤层析法是通过分子量的差异将混合物中的蛋白质分离的一种方法。
凝胶过滤层析法是利用凝胶材料，例如琼脂糖或琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶，通过分子在凝胶孔隙中的渗透性而将蛋白分离开来。
较大的蛋白分子无法进入凝胶孔隙，因此会在凝胶的表面留下。
较小的蛋白分子则能够渗透进入凝胶孔隙中，因此会相对于较大的蛋白分子更早地溢出。
凝胶过滤层析法的优点在于操作简单、速度快，且可以对蛋白进行某种程度的分离。
然而，该方法的分离效果受到蛋白质在凝胶中的体积效应的限制，因此对于体积较大的蛋白分子，凝胶过滤层析可能无法实现理想的分离效果。
3. 离子交换层析法：离子交换层析法是一种基于蛋白与离子交换材料之间的电荷相互作用进行纯化的方法。
蛋白纯化层析技术和工艺放大
过滤操作方式选择
过滤常见的操作方式包括NFF死端过滤和CFF切 向流过滤
切向流过滤技术的选择
中空纤维柱和平板膜包的优缺点：
切向流过滤技术的选择
中空纤维滤膜具有开放式流道(Open Channel ) ，剪切力低且容尘量高，适合病 毒和蛋白等生物大分子低剪切力的温和超滤 浓缩、可直接处理高固含量高黏度的复杂料 液，如细胞菌体收集、裂解液澄清和硫酸铵 沉淀收集等应用。 平板膜包的筛网流道结构( Screen Channel ) ，适合无固体颗粒的低黏度低浓 度样品的浓缩，如层析柱之间的缓冲液交换 和浓缩等。
蛋白质层析技术和工 艺放大
曹杰
2013.05.11
一、离子交换层析技术 二、亲和层析技术 三、切向流过滤技术 四、工艺放大
一、
阴离子交换
阳离子交换
分辨率: 1 选择性: 填料的性质及所带功能基团的数目、 pH值、离子强度、洗脱条件 2 柱效： 填料颗粒大小、层析柱装填效果 3 样品： 能应用的样品量即样品各成分性质
二、
亲和层析原理
亲和层析的策略
配基与目标蛋白的特异性
尽可能简单 设计洗脱方案
抗体纯化
——基于G蛋白/A蛋白的IgG的纯化
1. LMW Markers
2. Mouse cell culture, nonredued,diluted 1:10
3. PoolⅠ,unbound material,nonredued,diluted
了解相关法律、法规、验证计划、QA和QC等
如何保证质量？确定分析方法、检测方法、如何保证工 艺稳定性。
工艺放大（以蛋白纯化为例）
要考虑的问题：
蛋白质纯化与层析技术
蛋白质纯化与层析技术在生物化学研究中，蛋白质是非常重要的一种生物大分子，其结构和功能对于细胞的正常运作以及生物体内各种代谢过程都起着至关重要的作用。
而蛋白质的纯化和层析技术则是研究这些生物大分子时必不可少的手段，它们能够帮助科研人员准确、高效地分离和提纯目标蛋白质，为后续研究和应用奠定基础。
蛋白质纯化是指将混合体系中的目标蛋白质从其他非目标蛋白质和杂质中分离出来的过程。
在纯化过程中，常常需要利用物理性质（如分子大小、电荷、疏水性等）或化学性质（如亲和性、特异结合等）的差异对蛋白质进行分离。
蛋白质纯化技术主要包括离心、沉淀、过滤、电泳、层析等多种方法。
而其中，层析技术则是纯化蛋白质中最常用、最有效的手段之一。
层析技术是利用介质的亲和性、分配系数或对蛋白质的特异亲和性对蛋白质进行纯化和分离的方法。
根据不同的原理和介质，层析技术又可分为凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水性层析、金属螯合层析等多种类型。
这些不同类型的层析技术可根据实际需要进行选择和组合，以实现目标蛋白质的高效纯化。
凝胶过滤层析技术是一种根据蛋白质分子大小进行分离的方法。
在凝胶介质中，较大的蛋白质分子无法穿透凝胶颗粒，因此会停留在柱子上部；而较小的蛋白质则能够穿透凝胶颗粒，最终在柱子底部被收集。
通过这种方式，可实现对混合蛋白质溶液的有效分离和纯化。
离子交换层析技术则是基于蛋白质的电荷性质进行分离的一种方法。
在带有离子基团的介质中，蛋白质分子与介质之间会发生静电作用，从而使带有相反电荷的蛋白质分子被吸附在介质表面，而带有相同电荷的蛋白质分子则被洗脱。
通过不同离子强度和pH值的调节，可以实现对不同电荷性质蛋白质的选择性吸附和分离。
疏水性层析技术则是通过蛋白质的疏水性质进行分离的方法。
在疏水性层析介质中，具有较高疏水性的蛋白质会与介质表面相互吸附，而具有较低疏水性的蛋白质则会流经整个柱子被洗脱。
通过这种方式，可以实现对具有不同疏水性质的蛋白质的有效分离。
蛋白质层析技术在生命科学中的应用
蛋白质层析技术在生命科学中的应用生命科学是一个广阔的领域，涵盖了生物学、医学、制药等多个方面。
在这个领域中，蛋白质是一个非常重要的研究对象。
蛋白质作为生命的基本组成部分和生物体内许多生化过程的驱动者，其结构和功能的研究对于我们了解生命的本质和发现新药物具有非常重要的意义。
而蛋白质层析技术作为一种重要的蛋白质分离纯化方法，在生命科学领域得到了广泛应用。
蛋白质层析技术是基于蛋白质分子在某种特定条件下与层析材料的相互作用而实现分离纯化的技术。
该技术是在许多不同领域里被广泛使用，例如药物研发、蛋白质纯化和生物化学等。
它是目前蛋白质纯化领域中最常用的方法之一，因为它可以有效、快速和高效分离纯化不同种类的蛋白质，同时保持其活性和功能。
以下是蛋白质层析技术在生命科学中的应用。
1、药物研发药物研发是蛋白质层析技术的一个主要应用领域之一。
在药物研发中，蛋白质层析技术可以用于分离和纯化药物靶点蛋白和候选药物分子。
该技术可以帮助研究人员了解每个蛋白质在药物研发中的作用机制，同时它也为研究人员提供了大量有关候选药物分子的信息。
蛋白质层析技术在药物研发中的应用还包括了药物毒性测试。
蛋白质层析技术可以检测和分离药物靶点蛋白和候选药物分子之间的交互作用，并可以评估药物分子对蛋白质的影响。
这使得科学家能够更加精确地评估候选药物分子的毒性，并可以更好地进行药物筛选。
2、蛋白质纯化蛋白质纯化是蛋白质层析技术最常见的应用之一，目的是纯化蛋白质并使其保持其原来的结构和功能。
在生命科学领域，蛋白质纯化可以用于制备高纯度的蛋白质样品，以进行后续的仔细结构分析、药物筛选、抗体生产等研究。
在蛋白质分離的过程中，层析介質分成很多種，像是陽離子交換層析、陰離子交換層析、尺寸排除層析等。
3、生物化学生物化学也是一个广泛应用蛋白质层析技术的领域。
在生物化学中，研究人员利用该技术来纯化酶、蛋白质复合物、蛋白质配体等生物分子。
蛋白质层析技术可以帮助研究人员确定不同蛋白质分子特征，并了解这些分子在生物学上的作用机制。
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结构：典型层析介质的放大观察
孔的结构可分为三种类型
整体柱（monolithic column ）
• 概念：它是由单体、引发剂、致孔剂等混 合物通过原位制备而成一个棒状整体,具有 制备方法简单、内部结构均匀、重现性好、 具有较高的柱效和可进行快速分离等优点, 已在反相色谱、离子交换色谱、疏水作用 色谱、亲和色谱、体积排阻色谱中获得了 应用,并成功分离了肽、蛋白质、类固醇、 芳烃、聚合物、低聚核苷酸、氨基酸等物 质。
平台的操作（软件：知识结构）
• E.Coli表达产物的抽提以渗透冲击法为宜，没有 特殊原因不要使用超声破碎法。 • 0°C ，20%蔗糖，10mM左右缓冲液，含 2.5mMEDTA 2.5mMEDTA，高渗后，加入低渗液，迅速充分 悬浮。如果必要，应含DTT至2mM左右； • 均浆液组成原则：离子强度尽量低：≤50mM，有 时需DTT，不一定加EDTA，可考虑加PMSF，但 此时不宜用Tris等胺类缓冲剂；
整体柱（monolithic column ）
• 目前,商品化的聚合物整体柱有CIMTM,硅 胶整体柱有SilicaRODTM和 PrepRODsTM。 • 默克 整体柱 ChromolithTM
蛋白质纯化平台
纯化平台的硬件结构
• 中心设备：中压至高压层析仪 • 辅助设备：过滤装置，超滤装置，离 心机，蛋白质电泳等
FDA 关于蛋白质产品的重要规定
• FDA无法认可使用含有便于纯化的标签的 蛋白质用于注射型药物. • FDA新调整 : 1996年提出, 可以对生产工艺 做调整, 只需申请相应变动部分的许可.
谢谢！
蛋白质纯化平台的结构和组成
• 含量较高的蛋白质纯化，基本可以在 三个层析步骤中实现。 • 用目标蛋白的三个独立的物理化学性 质进行层析分离。
几步完成纯化？
综合考虑样品的各种性质
稳定性（ 值 活性） 稳定性（PH值，活性） 疏水性 分子大小，形状。 分子大小，形状。 关键辅助因子 • • • • • • 关键杂质 产品浓度 引进污染物 产品纯度 单位成本 产量
平台的操作（软件：知识结构）
• 离子交换后，采用疏水层析，可省去缓冲液交换 步骤（Buffer Exchange）； • 如有必要，浓缩后，Buffer Exchange，进行精制。 • 电导率更能反映影响离子交换的强度。 • 离子交换：平衡液应采用尽量低的离子强度，上 样体积不限；Donnan效应会造成1个pH单位的偏 离，是蛋白质柱上变性的重要原因；缓冲液的离 子强度越低，离子交换介质的电荷密度越大偏移 越大。
蛋白质结构组计划
• 目标：用十年的时间获得一万种蛋白的三 维结构。 • 但是只有57%被克隆的蛋白能够成功表达。 • 而且在这些表达的蛋白中，只有 28% 的重 组蛋白能够被纯化出来。 • 最终，只有2%-10%的最初的目标蛋白被成 功的建立。
蛋白质层析分离纯化机制
• • • • 电荷不同：离子交换层析 大小、形状：凝胶过滤层析 疏水区域：疏水层析 特异性：亲和层析 （选择性是最优秀 的）
层析介质
• 生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生
物大分子失活，没有生物化学毒性—过强 吸附、泄露。
• 化学稳定性：在生物大分子存在的化学条
件下是稳定的。• 必Fra bibliotek的机械性能：流体中的耐压性、弹
性。
化学组成：亲水多孔高聚物等
亲水的介质对蛋白有吸附作用，因此要在层析 溶液中加一定浓度的盐。
聚合物机体孔的结构
平台的操作（软件：知识结构）
• 经验：具有3000个理论塔板的凝胶过滤可 近似地将分子量相当2倍的蛋白质完全分开； 6000个理论塔板可分开相差1.5倍分子量的 蛋白。 • 通常，要达到3000个理论塔板的分子排阻 层析柱，如用50µm的介质，流速<20cm/h （参照产品说明书）应在80cm以上至 120cm，上样<5%，一般1-2%。
吸附层析造成的失活
• 有些蛋白在柱上存留的时间长后，活 性也易丧失。
蛋白质层析过程中可能的氧化损伤
氧化损伤的直接后果和预防
• 产生部位：蛋白质的金属结合部位。 • 后果：造成蛋白质结构变化，失活，对蛋 白酶更加敏感。 • 预防： 避免金属离子与还原性保护剂同时存在。 掩蔽和消除还原型金属离子物质是最有效 的减轻蛋白质氧化损伤的途径。 （EDTA可把金属络合，但不能阻止金属离子的氧 化作用）
平台的操作（软件：知识结构）
• pH：阳离子通常低于pI 一个pH单位 阴离子通常高于pI 一个pH单位 • Sticky protein：40% 在某pH附近，与阳离 子和阴离子层析介质都结合。 • pH 的筛选主要是考虑分离的选择性而非载 量。 • 参数获得≤２.５％上样体积运行离子交换及 疏水，样品不需平衡。
FDA 关于蛋白质产品的重要规定
• FDA认为: 电泳的单一条带还不足以作为蛋 白质纯度的证据 ,要结合其他更灵敏的定量 的方法,比如质谱; • FDA规定: 除了要测定蛋白质的纯度,还要考 虑蛋白质的翻译后修饰及其生物学活性; • FDA规定: 如果有蛋白质中有必要的糖基化, 那就要证明产品蛋白质中确实有这个糖基 化;
IgG样品中蛋白酶的降解作用
阳离子交换与DNA污染
蛋白质分子的柱上失活
• 分离过程可能是蛋白质失去稳定因子，如 辅酶，金属离子等。 • 吸附作用可能降低失活过程的活化能,加快 蛋白的动力学过程。一般蛋白质的变性或 失活过程活化能125kj/mol,高于一般化学反 应的活化能，从而对温度的变化十分敏感。 • 由上，对于易在层析过程中变性或失活的 蛋白质分子，30度的温差会造成5-200倍的 活性回收差别。
蛋白质层析技术
导言
• 生物技术有三大部分：生化分离技术； DNA重组及基因转移技术；免疫检测技术。 其中生化分离技术是生物技术的基础和支 柱。 • 层析是最有效的分离手段，也是最重要的 蛋白质纯化工具。层析主要是物理方法， 是混合熵减少的过程，必然消耗自由能。 • 基因工程下游的核心是层析。 • 层析技术的理论和实践已高度发展和完善。
蛋白质变性因素
• 自然状态下，细胞中蛋白质浓度：200-400mg/ml 动物血液中蛋白质浓度：50-70mg/ml 。 • 蛋白质在生理条件和进化过程中从来没有单独的 在纯化中那样的低浓度下存在过。 • 多亚基蛋白中，亚基-亚基解离与浓度直接相关， 很多蛋白质分子的不稳定，就是亚基间结合力不 够强造成。 • 表面张力，气泡，振荡，剪切和稀释都会造成蛋 白质失活。
停留时间
流速
• 影响介质载量
流速
• 影响分辨率
FDA 关于蛋白质产品的重要规定
FDA要求: 对于用于注射用的蛋白质产品， 纯度至少要达到99.99%,而且要保证产品纯 度和活性的重现性; FDA要求: 如果原材料中有不寻常的物质 (unusualmaterial ),则生产者必须建立相应 的检测方法来特异的检测这个物质;
平台的操作（软件：知识结构）
• 样品处理及准备工作 • 用SDS-PAGE监测整个流程 • 富含目标蛋白的提取物的获得：应采用尽 量低强度的抽提方法。 • 通常PBS或TBS抽提能力过强，没有必要. 低渗更有利于破碎，甚至可用水进行抽提 （如1：4左右）；
平台的操作（软件：知识结构）
• 无特殊理由，pH应准确控制在中性附近， 尽量用酸性buffer； • 缓冲容量：在pKa附近 缓冲容量正比于缓 冲溶液的总浓度； • 最好运用(NH4)2SO4沉淀，缩小体积，便 于保存。终止生化代谢反应，除糖、脂类。 个别情形中会造成不可逆沉淀；
FDA 关于蛋白质产品的重要规定
• FDA规定: 一个生产程序,每次必须产出相同 数量和品质的产品, 否则不会被认可; • FDA规定: 必须进行蛋白质产品的生物活性 测定 ,测定方法必须证明是规范和有效的,并 且要确保每次生产的产品最后的活性和效 用是一致的; • FDA规定: 产品必须有确切的可以耐受运输 时间和货架时间;
梯度洗脱还是分步洗脱
• 蛋白质层析因为保留值差别很大，比如相差1000 倍，这样能够洗脱的唯一方法就是强度递增的洗 脱——阶段洗脱或连续梯度洗脱
样品通常特点及对后续纯化的影响
• 大多数蛋白将带负电荷，样品会含一定量 核酸； • 运行层析，则蛋白浓度不应大于10 mg/ml。 • (NH4)2SO4 沉淀，通常蛋白浓度1-5mg/ml.
平台的操作（软件：知识结构）
• 实验室规模的层析应采用不大于50 µm的离 子交换或疏水介质，应具有10 cm左右，则 不少于 600个理论塔板。 • 精制：高效预装柱1 - 5 ml，10 µm左右粒 度，如Mono系列等。 • 通常条件下，采用15 µm的 Resource精制 也可以达到较好效果。
动态载量
动态载量是制备层析的重要概念，也 是制备层析介质的重要性指标。层析 过程是偏离平衡态的，流速越大，偏 离越远，反之亦反。
层析介质颗粒度与动态载量
吸附动力学与动态载量
从动态载量看上样条件
吸附蛋白的大小与动态载量
吸附等温线
• 概念：一定温度下溶质分子在两相界面上进行的 吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关 系曲线。
整体柱（monolithic column ）
• 高流速 整体化色谱柱的总孔率约80％，填料具有优越的 渗透性，即便使用高流速进行色谱分离，柱压也 很低 ；基本不会因脏的样品而受堵，寿命长。 • 高柱效 整体化色谱柱的柱效和3.5µm粒径的颗粒型色谱 柱相当，而大大优于5µm粒径的色谱柱。并且， 整体化色谱柱在流速升高时，柱效下降程度低。
设计合理的方案
• 各种机制交替试用，相互衔接、补充。（3步）
• 分辨率：疏水层析<离子交换层析 • 载量： 疏水层析<离子交换层析 • 选择性：疏水层析>离子交换层析
同样的起始样品不同的纯化方案
通常纯化流程：选择性> 分辨率 >载量