实验一葡聚糖凝胶柱层析分离核黄素和牛血清蛋白

四、实验步骤
凝胶的溶胀
装柱
上样
洗脱、收集及测定
四、实验步骤
（一）凝胶的准备 称取Sephadex G-50 3g，臵于锥形瓶中， 加PBS约50ml，在沸水浴中加热2h溶胀 凝胶，用PBS漂洗，去除飘浮的细小颗 粒，冷却到室温后再装柱。
（二）装柱
1. 取层析柱，洗净，检查出口； 将层析柱固定在支架上，调 整层析柱与水平面垂直。 2. 关层析柱出口，先用约 10ml PBS预洗柱子，放出 洗液；再加PBS至2cm高， 然后关闭层析柱的出口。
（三）上样
1. 先将柱的出口打开，让PBS逐渐流出，待 液面与凝胶床面平齐时，关闭出口（注意： 不可使凝胶柱表面干涸）。 2. 用刻度吸管取样品混合液0.5ml，沿管壁小 心加于柱床表面，打开层析柱出口端，待 样品完全渗入胶内，开始收集流出液，同 时小心加洗脱液（PBS），
控制流速：1滴/5-6秒。（注意柱床上要不 断加PBS，保持1cm高水层）
五、实验注意事项
装柱时需保持柱体垂直于水平面，不可随意 晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。
加样时吸管伸入柱内，接近液面处沿管壁加 入，动作要轻柔，不要将床面冲起。 实验过程中需密切注意保持层析柱中的凝胶 始终处于PBS中，防止PBS排空。
凝胶层析柱洗脱曲线示意图
Ⅰ 完全排阻的大分子
Ⅱ 中等分子 Ⅲ 完全渗透的小分子
☻葡聚糖凝胶（Sephadex） ☻琼脂糖凝胶（Sepharose）
☻聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）
G型（G-X: X数字代表 交联度与吸水量） LH型
Sephadex的常见规格（分级范围）
型号 分离范围 (G-X) (分子量Da)
G10 G15 G25 G-50 G-75 G100 G150 G200 <700 <1,500
层析的分类
（一）按两相所处的状态分类
气-固层析
气相层析
层析
液相层析
气-液层析 液-固层析
液-液层析
层析的分类
（二）按操作方式分类
1 1 2 2
柱层析
纸层析
薄层层析
3 4
层析的分类
柱层析（column chromatography） 将固定相装在层析柱中，使样品 朝着一个方向移动，通过各组分随 流动相流动而得到分离的方法。
物理 化学 性质
固定相
流动相
层 析
固定相(Stationary phase ) ：是色谱的基质， 可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子 交换剂等），也可以是液体物质（如固定 在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能 与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、 交换等作用。
流动相(Mobile phase ) ：在色谱分离过程 中，推动固定相上待分离的物质朝着一个 方向移动的液体、气体等。
2cm 砂芯
3. 将凝胶悬液（约40ml）沿玻璃棒小 心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉 积2cm高时，再打开出口，继续加入 凝胶悬液至凝胶沉积约8cm的高度即 可，关闭出口（要求凝胶床无气泡、 无断层、表面平整）。 4. 新柱装好后，加3-5倍体积PBS流过 柱床，然后平衡10min。（注意：始 终层析柱与水平面垂直）
1,000 ~ 5,000
应用
脱盐、短肽、小分子的分离
1,500~30,000
低分子量蛋白、多肽的分离
3,000~70,000 中低分子量蛋白、多肽的分离 4,000 ~150,000 中高分子量蛋白的分离 5,000 ~400,000 高分子量蛋白的分离 5,000 ~800,000
Hale Waihona Puke Baidu 重点
二、凝胶层析的原理
（四）洗脱、收集与检测
1、流速1滴/5-6秒不变，2ml/管收集 流出液，收集至流出液为无色。 2、用分光光度计，在280nm波长处， 以PBS调零，测定无色管吸光度；在 在450nm波长处，以PBS调零，测定有 色管吸光度。（每管收集液稀释1倍 后测定） 3、以管号为横坐标，吸光度为纵坐 标，绘制洗脱曲线。
分子筛效应
比孔径大的分子不能扩散到孔穴内部， 完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外 的空间随流动相向下流动，它们经历的 流程短，流动速度快，首先流出。
较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内 部，然后再扩散出来，经历的流程长， 流动速度慢，后流出。
三、试剂、器材：
3.1 层析介质：Sephadex G-50； 3.2 样品（包含2个组分）： ①核黄素（黄色）， ②牛血清白蛋白， 上样量：0.5ml/柱。 3.3 洗脱液： 0.1mol/L,Ph7.2的磷酸盐缓冲液（PBS） 3.4 层析柱、分光光度计等。
六、思考题
1、凝胶层析的原理是什么？ 2、用凝胶柱层析分离不同蛋白质，怎样才能
得到较好的分离效果？
实验一 葡聚糖凝胶柱层析法 分离核黄素和牛血清白蛋白
夏芳
2011-8-30
一、实验目的
了解：
层析技术的基本原理。
熟悉：
凝胶层析的操作过程。
掌握：
组分的洗脱与鉴定。
层析技术的基本原理
利用混合物中各组分的物理、化学性质 的差别，使各组分以不同程度分布在两相(固 定相、流动相)中达到分离。
溶解度 分子极性 分子大小 两相 分子形状 吸附能力 分子亲合力等
层析的分类
（三）按层析的分离机制分类
1. 吸附层析 2. 分配层析 3. 离子交换层析 4. 亲和层析 5. 凝胶层析
凝胶层析 (分子筛过滤、排阻层析)
混合物随流动相经固定相(网状孔径)的
层析柱时，混合物中各组份按其分子大
小不同而被分离的技术。
固定相（凝胶）
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔 网状结构的高分子聚合物，每个颗粒的细 微结构及筛孔的直径均匀一致。