最新3核酸和核仁组织区的组织化学汇总

3核酸和核仁组织区的组织化学

核酸和核仁组织区的组织化学

核酸的分布与组成成分

核酸的分布:

细胞质

细胞核

染色质

核仁

核酸

多核苷酸

单核苷酸┌磷酸

┌戊糖：核糖或脱氧核糖

└核苷

└碱基：A， T， C， G， U

核酸的种类与染色应用

RNA：胞质及核内

戊糖：核糖

腺嘌呤（A），鸟嘌呤（G），胞嘧啶（C），尿嘧啶（U）

DNA：核内

戊糖：脱氧核糖

腺嘌呤（A），鸟嘌呤（G），胞嘧啶（C），胸腺嘧啶（T）

核酸的种类与染色应用

核酸染色应用

免疫性疾病的诊断与研究

免疫缺损

AID

过敏性反应

肿瘤的诊断与研究

淋巴瘤

反应性病变

瘤样病变

核酸的染色方法

1，Feulgen法

2，甲基绿--派洛宁法

Feulgen-Rossenbeck法

原理：

脱氧核糖核酸→→脱氧戊糖与碱基断开，戊糖端形成醛基（CHO-CHO）与Schiff试剂（无色）反应→→紫红色（DNA部位）

PAS法:用过碘酸强氧化剂使六碳糖中的1,2乙二醇基（—CHOH-CHOH—）变成二醛基（—CHO）然后与Schiff试剂反应，形成紫红色的化合物，在有多糖的部位，就会呈现紫红色阳性反应。

原理

Schiff试剂中的酸浓度对两个反应的效果不同

pH在3．0和4．2: 对Feulgen反应染色好

pH2．4: 适宜于作PAS反应

Schiff试剂置于棕色瓶，放冰箱，染色效果好，保存时间长

HCL水解

作用：

嘌呤碱基的去除，醛基暴露，醛基与Schiff试剂以共价键结合，一种特殊的细胞化学反应（染色强度增加）

核内DNA产生游离醛基成为无嘌呤核酸(APA) 和将大分子APA解聚成小片断游离出细胞核，被HCL溶解（染色强度减弱）

注意事项：

1.水解时间 60℃ 1N HCL

固定液Carnoy 8min

Zenker 5min

Formalin 8min

无水乙醇 5min

Bouin 不能用

2.固定液组织块用Carnoy,涂片用甲醇

3.预实验

经典的Feulgen法是用1N HCL 60℃中水解。

改良的方法是5N HCL室温下进行或60℃5分钟。

试剂配制

1.schiff氏试剂：清而透明的浅黄色，0-5℃保存。粉红色的弃之。

2.亚硫酸水(洗涤剂)

3.5N HCl(水解用) (改良法）

4. 1%亮绿

染色步骤

1.切片脱蜡至水、蒸馏水

2.5N HCl 60℃ 5min或室温20-40min

3.蒸馏水洗（使水解停止）

4. Schiff试剂中染色60min 室温

5.用0.5%亚硫酸盐溶液洗3~5次(以洗去多余的非特异性色素及扩

散染料)

6.流水冲洗5 min

7.蒸馏水洗

8.1%亮绿复染2min

9.蒸馏水洗

10.脱水、透明、封片

实验结果

1. 细胞核中的DNA呈鲜亮的紫红色反应

2. 细胞质被亮绿复染成绿色

应用

Feulgen法的产物与DNA的含量呈正相关，主要用来检测产物定量DNA，测细胞的倍体数（多倍体、异倍体）用于肿瘤细胞和精子的定量分析。

甲基绿-派洛宁法

methyl green-pyronin

甲基绿—派洛宁为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。甲基绿与派洛宁作为混合染料

甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；

派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色

甲基绿-派洛宁染色机制

电离作用

电离后甲基绿在五价氮处产生二个正电荷，碱性较强，与细胞核结合，派洛宁电离后仅产生一个正电荷较弱与胞质结合

聚合作用

甲基绿与高聚合的DNA结合，派洛宁与聚合低的RNA结合

甲基绿-派洛宁法

methyl green-pyronin

染色步骤：

1．切片脱蜡如常，水洗

2．0．2M醋酸缓冲液稍洗

3．甲基绿派洛宁液染色1—2小时

4．倾去染液，用滤纸吸干切片上多余水分

5．用正丁醇迅速分化10—20秒

6．经丙酮迅速脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

结果：DNA呈绿色，RNA呈红色。

甲基绿-派洛宁法

methyl green-pyronin

2%甲基绿储存液：

甲基绿 2g， dd H 2 O 100ml

2%派洛宁储存液：

派洛宁2g， dd H 2 O 100ml

甲基绿用氯仿抽提5-6次

分液漏斗，加等量氯仿

充分摇荡数分钟后静置

液体分层，放掉分液漏斗中下层的紫色氯仿

直至氯仿洗不下紫色为止

派洛宁用氯仿抽提5-6次

同上用氯仿抽提数次，待氯仿不显红色为止

工作液：

2%甲基绿储存液（抽提后） 9ml

2%派洛宁储存液 4ml

用0.2M醋酸盐缓冲液（pH 4.8）调PH到4.8

甲基绿-派洛宁法

methyl green-pyronin

注意事项：

1．新鲜组织染色效果较好，应尽早选取新鲜组织固定。

2．以Carnoy氏液固定的组织最为理想。

4℃，2-4小时，超过一天则染色效果不理想