反义技术及其在植物基因工程中的应用

吉林农业大学学报　2004,26(5):515～518

Journal o f Jilin Agricultural Univer sity

反义技术及其在植物基因工程中的应用

Ξ

柴晓杰,王丕武ΞΞ

,关淑艳,徐雅维

(吉林农业大学生物技术学院,长春130118)

摘　要:反义技术是根据核酸杂交原理设计反义核酸来人为控制基因表达的方法,现已成为基因工程中的常用技术。文中就反义技术的作用机制、在植物基因工程中的应用及其前景作简要综述。关键词:反义技术;核酸杂交;基因表达;植物基因工程

中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:100025684(2004)0520515204

Antisense T echnology and Its Application in Plant G enetic Engineering

CH AI X iao 2jie ,W ANG Pi 2wu ,G UAN Shu 2yan ,X U Y a 2wei

(College o f Biotechnology ,Jilin Agricultural Univer sity ,Changchun 130118,China )

Abstracts :Antisense technology has been comm only used in genetic engineering 1It is a method to design antisense nucleic acids based on hybridization in order to regulate gene expression artificially 1In this pa 2per ,we briefly review the mechanism of antisense technology and its application in genetic engineering and look forward to the prospect of this technology 1

K ey w ords :antisense technology ;hybridization ;gene expression ;plant genetic engineering

20世纪80年代初,人们在研究反义核酸对原核和真核基因调控的基础上,发现了反义技术(antisense technique )。反义技术主要是设计一类能有效抑制某一目的基因表达的反义RNA (anti 2sense RNA ,asRNA )、反义DNA (antisense DNA ,as 2

DNA )及核酶(ribozyme )[1]

,将它导入细胞中,达到封闭该基因的表达或者造成新的突变表型。反义技术提供了直接有效地人为控制基因表达的方法,现在已成为基因工程研究中一项重要技术。有人把反义技术的发展称为生物技术的第二次浪潮,因为它将有力推动基因工程及其在医学、医药、农作物育种、畜禽育种等领域的应用和发展。目前已成功地用反义技术抑制一些酶基因的活性。反义RNA 介导后整合到宿主细胞基因组中能产生瞬间的或稳定的遗传表达。这是常规育种所无法达到的,显示了反义技术在植物改良中具

有广阔的应用前景

[2]

。

1　反义技术及其作用机制

1.1　反义RNA

反义RNA 是指与靶RNA 具有互补序列的

RNA 分子,它通过与靶RNA 进行碱基配对结合调节结构基因的表达。反义RNA 根据其作用机制分为3类:Ⅰ类反义RNA 是在翻译水平上调控基因表达的。例如,它可与翻译起始密码前的调控序列AGG A 互补结合,或者与起始密码前后的一整段mRNA 结合从而抑制翻译过程。在已发现的天然反义RNA 中,采用这种方式实现调控作用的占多数。Ⅱ类反义RNA 在转录水平上影响基因表达,已发现大肠杆菌中有一种转录抑制互补RNA ,能与cAMP 受体蛋白mRNA5′端互补结合,形成类似于转录终止的结构,在转录水平上抑制

ΞΞΞ通讯作者

基金项目:“国家转基因植物中试与产业化基地建设”专项基金资助项目(J992132001)

作者简介:柴晓杰(19632),女,博士研究生,副教授,研究方向:植物基因工程。收稿日期:2003211225

基因的表达[324]。Ⅲ类反义RNA在复制水平上作为DNA复制的抑制因子,与引物RNA前体互补结合,抑制DNA的复制,从而控制复制频率。在大肠杆菌某些质粒上已发现了这一类反义RNA。

在真核生物中尚未发现有相应的反义RNA 存在,但根据天然反义RNA的作用机制,人工方法构建反义RNA,已开展了较多的研究工作,具有广阔的前景。这种在细胞内表达反义RNA的原理是将部分或全部正常基因的序列以相反的方向插入到启动子的下游区,使这个“反向基因”可以在启动子的调节下有效地转录。当将这样的一个重组体通过各种方法导入到宿主细胞中去后,就可在细胞内产生反义RNA。反义RNA如果是同mRNA互补,则就抑制了mRNA的有效翻译;反义RNA如果能同特定基因的调控区互补,则就会妨碍其下游基因的正常表达等等。还可以将反义基因插入到时空特异性、细胞组织特异性的启动子下,对具有时空特异性、细胞组织特异性的基因表达调控进行研究和利用[5,9]。

1.2　反义DNA

反义DNA是一类能识别DNA双螺旋的寡核苷酸。它能以序列特异性识别双螺旋DNA并形成3股螺旋,从而抑制基因的转录。形成3股螺旋的分子基础是双螺旋DNA的大沟内有可形成氢键的基团,其中一些基团作为氢键供体可以与第3条链(如反基因寡核苷酸链)的某些基团作为氢键受体,通过分子间的H oogsteen氢键形成碱基三联体。这种结合之所以能起到阻止作用,是因为反基因寡聚脱氧核糖核苷酸正好在DNA结合蛋白质的识别点处,与DNA结合形成三股螺旋,从而特异性干扰DNA与蛋白质的结合。因为基因复制、转录起始和转录延伸等均是以基因与相关蛋白质结合而启动反基因寡聚脱氧核糖核苷酸特异地阻止DNA与蛋白质的结合,进而阻止基因的转录和复制,达到“反基因”的目的。三链DNA 这一研究领域得以开拓,成为生物化学、分子生物学新的前沿,是近年来兴起的一种新的基因治疗技术[628]。

1.3　核酶

核酶(ribozyme)是细胞中一类具有生物催化功能的RNA,现已发现核酶广泛存在于从低等到高等多种生物中,参与细胞内多种RNA及其前体的加工和成熟过程。天然核酶可分为:(1)异体催化剪切型,如RNaseP;(2)自体催化剪切型,如植物类病毒、拟病毒和卫星RNA;(3)第一组内含子自我剪接型,如四膜虫核26SrRNA;(4)第二组内含子自我剪接型。利用ribozyme专一水解RNA 的特性,设计ribozyme定点切割基因表达的中间产物mRNA以及病毒RNA与其他RNA,可以阻断基因表达和抑制病毒以及其他RNA的复制。因此,无论是对动、植物细胞还是病毒,ribozyme都具有关闭基因或阻止病毒感染的功能。它的开发应用已成为新药开发中的热门课题,显示出了巨大的应用前景[9]。

2　反义技术在植物改良上的应用

211　植物淀粉合成的控制

1991年Visser等[10]利用反义RNA技术,向马铃薯中导入反向连接的G BSS基因,导致G BSS含量活性下降,进而导致马铃薯块茎中直链淀粉含量锐减。相反,在无直链淀粉的马铃薯块茎中导入G BSS基因,成功地弥补了直链淀粉的缺乏。同样利用反义RNA技术,在木薯、水稻等植物中,也获得了低(或无)直链淀粉的转化体[11212]。可以说,对G BSS的操作是控制直链淀粉的可靠途径。目前,尚无通过调SSS、SB E等基因来改变支链淀粉含量的文献报道,但国际专利W O9722703A2报道了用玉米SB EⅡb转化玉米的研究。把SB EⅡb的cDNA基因或部分片段正向或反向置于玉米ZEI N蛋白启动子(胚乳特异启动子)下构建一系列植物表达载体,转化玉米,成功地获得了转基因植株[13]。

212　植物的抗病性

农作物抗病遗传育种研究中,利用病毒的反义RNA片段封闭病毒基因组上的重要片段,如复制酶结合位点、核糖体结合位点等,从而阻断病毒的复制。也可以用反义RNA序列通过与病毒mRNA互补序列的结合,关闭mRNA的翻译功能。反义RNA的基因常用cp、复制酶基因或病毒基因组的其他成分。目前对T MV、C MV、PVX、TE V等病毒都构建了反义RNA基因,并转化马铃薯、烟草等[14215]。这些转基因植株对病毒表现出不同程度的抗性,但目前此法对付植物病毒还不理想,因为反义RNA表达不够,抗性微弱,设法提高其表达效率是该法成功的关键。也有人利用ribozyme 自我剪切原理,人工合成一种具有核酸酶活性的

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