单克隆抗体的制备及应用

单克隆抗体的制备及应用 The latest revision on November 22, 2020

单克隆抗体的制备及应用

单克隆是由杂交瘤产生的、只针对复合上某一单个。技术(monoclonalantibodytechnique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。1单克隆抗体的优点与局限性：

1.1单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA 等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。

总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。

1.2单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。

2单克隆抗体的制备：

单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。

单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与、细胞融合、选择杂交瘤细胞及检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。

2.1抗原准备

抗原，是指能够刺激产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。

2.2动物的选择与

2.2.1动物的选择纯BALB/c小鼠，较温顺，离窝的范围小，体弱，食量及排污较小，一般洁净的实验室均能饲养成活目开展杂交瘤技术的实验室多选用BALA/c小鼠。

2.2.2免疫方案选择合适的免疫方案对于杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据的特性不同而定。

（1）可溶性抗原性较弱，一般要加，应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml，0.2ml/点），3周后第二次免疫，剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml），3周后第三次免疫，剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后测其），2～3周加强免疫，剂量50～500μg宜，ip或iv（内

注射)，3天后取脾融合。

（2）颗粒抗原强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。初次免疫1×107/0.5mlip，2～3周后，第二次免疫1×107/0.5mlip，3周后加强免疫（融合前三天）

1×107/0.5mlip或iv，取脾融合。

2.3细胞融合

2.3.1细胞融合前准备

（1）的选择：瘤细胞应和属于同一，样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生量McAb。骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如DMEM。小清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～

5×105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对的时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有，应定期用进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。

（2）饲养细胞：在中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠细胞或细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。

2.3.2细胞融合的步骤

①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm，8min；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。

②90s内加入37℃预温的1ml45%PEG（量4000），边加边轻微摇动。37℃水浴90s。

③加37。C预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

④离心，800rpm,6min。

⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。

⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。

⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。

2.4选择杂交瘤细胞及检测

2.4.1HAT选择杂交瘤细胞脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏或核糖，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。

在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。

2.4.2抗体的检测检测抗体的应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。（2）酶联免疫试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和等McAb的检测。（3）免疫试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测。