酶工程复习

酶工程复习
一、名词解释
1、诱导与阻遏：诱导是加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过程。

阻遏是容易利用的碳源的分解代谢的产物阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。

2、最适生长温度与最适生产温度：最适生长温度是在该温度下，微生物细胞的生长速率最大。

最适产酶温度低于最适生长温度，在较低温度下，提高酶的稳定性，延长细胞产酶时间。

3、生长因子：细胞生长繁殖不可缺少的微量有机化合物，如aa, 嘌呤，嘧啶，激素
4、等电点沉淀
利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为等电点沉淀。

5、盐析沉淀
是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特点，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。

6、酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。

7、分子内交联修饰：含有双功能基团的化合物（双功能试剂）如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法称为分子内交联修饰。

8、酶的有限水解修饰：在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水解修饰。

9、酶的定点突变技术：定点突变技术是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的的操作技术。

10、侧链基团修饰：采用一定的方法(一般为化学法)使酶分子的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。

11、抗体酶（Catalytic antibody) ，又称催化抗体，是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活性反应,是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体
分子。

多克隆抗体中单一抗体的量很小，要把这些不同的抗体分开很困难。

用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限。

如果可以分离到抗体产生细胞的单克隆，然后使所有的抗体均来自同样的克隆，这样制备的抗体称为单克隆抗体。

专题1：工业生物技术的研究现状与发展趋势
什么是工业生物技术，工业生物技术产业的主要形式有哪些，现阶段工业生物技术发展的关键技术是什么？
答：工业生物技术是利用生化反应进行工业品的生产加工技术，是人类模拟生物体系实现自身发展需求的高级自然过程。

工业生物技术不仅仅面对发酵行业，它已经开始进入包括农业化学、有机物、药物和高分子材料在内的很多领域，广泛应用于许多日常用品的生产，如洗涤剂和纺织品等。

以生物催化剂为核心内容的工业生物技术
第一章绪论
1、什么是酶的最适pH，它影响酶反应的机理是什么。

在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性,通常称此pH 为最适pH(optimum pH)。

a.过酸或过碱影响酶蛋白的构象，使酶变性失活。

b.影响酶分子中某些基团的解离状态（活性中心的基团或维持构象的一些基
团）c.影响底物分子的解离状态，故酶反应一般在一定的缓冲液体系中进行。

1、试述磺胺类药物的作用机理（竞争性抑制）
磺胺类药物是对氨基苯磺酰胺或其衍生物，它是对氨基苯甲酸的结构类似物，竞争性抑制二氢叶酸合成酶。

如果动物体内含有大量的对氨基苯磺酰胺，可与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶的活性中心，抑制细菌二氢叶酸合成。

2、简述酶活力测定方法
答：两个阶段：酶在一定条件下与底物反应一段时间然后再测定反应物中底物或产物的浓度变化量。

步骤：
（1）配制底物溶液。

（2）确定反应条件。

（3）反应开始，记时间（4）反应完毕注意终止反应。

（5）测定产物的生产量或底物的减少量。

3、影响酶催化作用的因素是什么
1、底物浓度对酶促反应速度的影响
2、酶浓度对酶反应速度的影响/
3、温度
的影响4、pH的影响5、抑制剂的影响（竞争性抑制剂，非竞争性抑制剂，反竞争性抑制剂）
5、举例说明研究抑制剂对酶的作用的重大意义
（1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发：抗癌药
（2）对生物体的代谢途径进行人为调控，代谢控制发酵
（3）研究酶的活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计农药，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础
6、酶的催化作用专一性与高效性的机理是什么？
酶催化某一反应时，首先在酶的活性中心与底物结合生成酶－底物复合物，此复合物再进行分解而释放出酶，同时生成一种或数种产物。

ES的形成，改变了原来反应的途径，可使底物的活化能大大降低，从而使反应加速。

•酶与底物结合的方式有：锁钥学说:认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。

酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样•诱导契合学说:该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.
•“三点结合”催化理论：认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。

只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。

酶的催化作用可能来自5个方面，即广义的酸碱催化、共价催化、邻近效应及定向效应、变形或张力以及活性中心为疏水区域。

（详细见PPT）
7、酶的发现及研究历史（见PPT）
8、简述酶的可逆抑制作用
抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。

抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。

︴竟争性抑制
可逆抑制作用︴非竟争性抑制
︴反竞争性抑制作用
竞争性抑制剂:某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。

当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。

非竞争性抑制剂：酶可以同时与底物及抑制剂结合，但是，中间产物ESI不能进
一步分解为产物，因此，酶的活性降低。

显然，不能通过增加底物的浓度的办法来
消除非竞争性抑制作用。

反竞争性抑制剂：酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。

9、简述酶的酶组成、结构
（1）酶的组成
酶的组成 辅因子
酶的结构：一级结构是指具有一定氨基酸顺序的多肽链的共价骨架。

二级结构为在一级结构中相近的氨基酸残基间由氢键的相互作用而形成的带有螺旋、折叠、转角、卷曲等细微结构，
三级结构系在二级结构基础上进一步进行分子盘曲以形成包括主侧链的专一性三维排列，
四级结构是指低聚蛋白中各折叠多肽链在空间的专一性三维排列。

第二章 微生物发酵产酶
二、问答
1、在生产实践中，对产酶菌有何要求？
1、发酵周期短，产量高；
2、容易培养和管理；
3、产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染；
4、有利于酶的分离和纯化；
5、安全性可靠，非致病菌。

2、试述酶生物合成模式及各模式的特点
单纯酶
结合酶（全酶）= 酶蛋白 + 辅
因子
辅酶：与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。

辅基：与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。

金属激活剂：金属离子作为辅助因子。

1、同步合成型
1）酶的合成与生长同步进行。

2）酶的生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。

这类酶所对应的mRNA很不稳定。

2、延续合成型
1）酶的合成伴随着细胞的生长而开始，但在细胞生长进入稳定期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。

2）酶的生物合成可以诱导，一般不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。

3）这类酶所对应的mRNA相当稳定，在生长稳定期以后相当长的一段时间内继续用于酶的合成。

3、中期合成型
1）酶合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞进入平衡期后，酶的合成也随着停止。

2）酶的生物合成受到反馈阻遏，而且其所对应的mRNA不稳定。

4、滞后合成型
1）只有当细胞生长进入平衡期后，酶开始
合成并大量积累。

2）酶的生物合成受分解代谢物阻遏作用，
这类酶所对应的mRNA稳定性高
3、在酶的工业生产中，最理想的酶合成模式
是哪一种，对于其它模式为提高酶产率和缩短发酵周期应用取什么措施，为什么？
最理想的酶合成模式是延续合成型；对于其它类型的酶,要在菌种选育和工艺条件上加以调节；对于同步合成型，尽量提高mRNA的稳定性，如降低发酵温度;对于滞后合成型,尽量减少阻遏物；对于中期合成型，要从提高mRNA稳定性和解除阻遏两方面进行
4、固定化细胞发酵有哪些优点？
能提高发酵速率，有利于提高生物反应器内微生物细胞的浓度和纯度，保持高校菌种，有利于反应器的固液分离，也有利于处氮和除去高浓度的有机物或某些难降解的物质。

5、简要介绍原生质体的制备过程。

固定化原生质体有何特点？
制备过程
–收集对数生长期的细胞，将其悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中；
–加入适宜的细胞壁水解酶，在一定条件下作用一段时间，使细胞壁破坏；
–分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞及细胞壁水解酶，得到原生质体
固定化原生质体的特点
–有可能增加细胞膜的通透性，可使较多的胞内物质分泌至细胞外，实现某些胞内产物的生产；
–由于去除了细胞壁这一扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌，从而提高酶产率。

–稳定性好。

—易于分离纯化。

6、打破酶合成调节限制的方法
1、添加诱导物
同一种酶往往能被多种诱导物
同一种诱导物酶也能诱导多种酶
诱导物一般可分为3类：酶的作用底物、酶的反应产物、酶的作用底物的类似物（最有效）
2、控制阻遏物浓度
3、添加表面活性剂
4、添加产酶促进剂
第三章动植物细胞培养生产酶
1、试述植物细胞培养产酶的工艺流程
答：一般工艺流程：外植体→细胞的获取→细胞培养→分离纯化→成品(酶)
2、以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原活化剂为例说明动物细胞培养产酶的工艺过程及控制
♦１、人黑色素瘤细胞培养基
♦2、人黑色素瘤细胞培养
♦3、组织纤溶酶原活化剂的分离纯化
♦用胰蛋白酶消化处理种质细胞→分散成悬浮细胞→接入适宜培养基→置于反应器培养→收集培养液→分离纯化
过程控制：温度控制要严密，允许温度波动范围在±0.25℃之内；pH值的调节要采用较温和的NaHCO3缓冲液；采用氧气、氮气、二氧化碳和空气四
种气体的不同比例来控制培养液中的溶解氧水平，并要严格控制渗透压。

专题2：
1、今欲生产糖化酶液体精制酶产品，试拟出合理的工艺步骤，并说明下游工程
的主要工艺条件。

发酵生产糖化酶工艺流程：
斜面菌种→小三角瓶→孢子悬浮液→种子罐→发酵罐→糖化酶粗酶液
第四章酶的提取与分离纯化
二、问答
1、在酶的提取与分离纯化过程中细胞破碎的方法有哪些？
有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法、酶促破碎法等。

2、生物热敏性材料的干燥方法有哪些？
喷雾干燥、冷冻干燥
第五章酶分子修饰
二、问答
1、对酶进行化学修饰时，应考虑哪些因素？
（1）被修饰酶的性质，包括酶的稳定性，酶活性中心的状况，侧链及基团的性质及反应性
（2）修饰反应的条件，包括酸碱度与离子强度，修饰反应时间和温度，反应体系中酶与修饰剂的比例等。

2、以单甲氧基聚乙二醇(MPEG)对天冬酰胺酶修饰为例阐述大分子结合修饰的方法与步骤
答：MPEG可以采用多种试剂进行活化，制成可以在不同条件下对酶分子上不同基团进行修饰的聚乙二醇衍生物。

聚乙二醇均三嗪衍生物的形成及其对天冬酰胺酶的修饰：单甲氧基聚乙二醇与均三嗪在不同的反应条件下反应，制得活化的聚乙二醇均三嗪衍生物MPEG1和MPEG2。

通过这些衍生物分子上的活泼的氯原子，可以对天冬酰胺酶等酶分子上的氨基进行修饰。

（详解见PPT）
3、什么是酶的定点突变技术，方法与步骤怎样？
答:定点突变技术是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的的操作技术。

(1)新的酶分子结构的设计,根据已知的酶RNA或酶蛋白的化学结构和空间
结构及其特性，设计出欲获得的新的酶RNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，确定欲置换的核苷酸或氨基酸及其位置。

(2)突变基因碱基序列的确定(核酸类酶、蛋白类酶)对于核酸类酶，根据欲获得的
酶RNA的核苷酸排列次序，依照互补原则，确定其对应的突变基因上的碱基序列，确定需要置换的碱基及位置。

对于蛋白类酶，首先根据欲获得的酶蛋白的氨基酸排列次序，对照遗传密码，确定其对应的mRNA上的核苷酸序列，再依据碱基互补原则，确定此mRNA 所对应的突变基因上的碱基序列，并确定需要置换的碱基及其位置。

(3)突变基因的获得：根据欲获得的基因和碱基序列及其需要置换的位置，首先
合成有1~2个碱基被置换了的寡核苷酸，再用此寡核苷酸为引物，通过定点突变技术获得所需的大量突变基因。

利用定点突变技术进行酶分子修饰，突变基因中所需置换的碱基数目一般只有1~2个，就能达到修饰目的。

(4)新酶的获得将获得的突变基因进行体外重组,插入到适宜的基因载体中,然后通过转
化、转导、介导、基因枪、显微注射等技术，转入到适宜的宿主细胞，再在适宜的条件下表达，就可获得经过修饰的酶
4、简述金属离子置换修饰的步骤
(1) 酶的分离纯化
(2) 除去原有的金属离子
(3) 加入一种金属离子置换
专题四
什么是抗体酶？试述应用单克隆抗体法制备抗体酶的机理。

抗体酶（Catalytic antibody) ，又称催化抗体，是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活性反应,是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子。

多克隆抗体中单一抗体的量很小，要把这些不同的抗体分开很困难。

用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限。

如果可以分离到抗体产生细胞的单克隆，然后使所有的抗体均来自同样的克隆，这样制备的抗体称为单克隆抗体。

另附填空
1、日本称为“酵素”的东西，中文称为酶,英文则为Enzyme,是库尼（Kuhne）于1878年首先使用的。

其实它存在于生物体的细胞内与细胞外。

2、1926年，萨姆纳（Sumner）首先制得脲酶结晶，并指出酶的本质是蛋白质。

他因这一杰出贡献，获1947年度诺贝尔化学奖。

3、目前我国广泛使用的高产糖比酶优良菌株菌号为As3.4309,高产液化酶优良菌株菌号为BF7.658。

在微生物分类上，前者属于霉菌，后者属于细菌。

4、1960年，查柯柏（Jacob）和莫洛德（Monod）提出了操纵子学说，认为DNA 分子中，与酶生物合成有关的基因有四种，即操纵基因、调节基因、启动基因和结构基因。

5、1961年，国际酶委会规定的酶活力单位为：在特定的条件下（25oC，PH及底物浓度为最适宜）每1分钟内,催化1μmol的底物转化为产物的酶量为一个国际单位，即1IU。

6、酶分子修饰的主要目的是改进酶的性能，即提高酶的活力、减少抗原性，增加稳定性。

7、酶的生产方法有提取法，发酵法和化学合成法。

8、借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。

9、酶的分离纯化方法中，根据目的酶与杂质分子大小差别有凝胶过滤法，超滤法和超离心法三种。

11、评价酶分离提纯方法好坏的指标有两个：一是总活力的回收率；二是比活力提高的倍数。

12、酶的常见发酵生产方式有两种：一种是深层液体发酵产酶；一种是固体培养发酵产酶
13、酶非水相催化中，必需水是维持酶分子完整的空间构象所必需的的最低水量。

14、载体对固定化酶的影响主要体现在______分配效应、_____扩散限制效应_、_______空间障碍效应_________。

15、1969年，首个应用于工业生产的固定化酶氨基酰化酶，它是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡聚糖凝胶固定化的。

16、常用的酶或细胞固定化的方法分载体结合法、交联法、包埋法等三类。

17、载体结合法固定化酶，根据结合形式不同，可分为物理吸附法、离子结合法、
共价结合法等三种。

18、共价结合固定酶时活化载体的方法有重氮法、叠氮法、烷化法、硅烷化法、溴化氢法。

19、通常体系中的水分广泛用卡尔-费休法进行测定，以刚出现微弱的黄棕色为滴定终点。

20、利用大分子修饰剂聚乙二醇修饰超氧化物歧化酶（SOD），多用单甲氧基PEG（mPEG）进行修饰以减少分离产物的难度，降低成本。

11。