遗传学研究方法与技术理论讲义讲解

遗传学研究方法与技术讲义（理论教学部分）王晓雯农学与生物科技学院遗传教研室二O一四年二月第一讲植物染色体的常规制片技术第一节染色体制片技术概述1.染色体制片技术的意义对染色体的观察是细胞遗传学研究的主要内容之一。

可以说，细胞遗传学之所以发展为一门独立的学科，就是通过对染色体行为观察，由些去解释一些遗传现象而发展进来的。

观察染色体的目的有两个：观察染色体的形态、结构和数目的变化；观察同源染色体在减数分裂中的联会行为，了解染色体之间的同源性，判断物种间亲缘关系的远近。

2.染色体制片的技术流程2.1概念染色体的常规制片技术：是指显示染色体的一般形态和结构的技术。

2.2技术类型压片技术和去壁干燥技术是染色体制片的主要类型。

压片法是以人工外加的机械压力而使染色体分散。

去壁低渗法则是以酶分解细胞壁，以低渗液使细胞膜吸胀和火焰干燥及水表面张力而使染色体自行展开。

图1.1染色体常规制片技术流程图压片法的优点是操作快速简便，节省材料。

去壁低渗法，染色体易于展开而不易导致染色体变形，尤其对一些含较多成熟细胞的组织，如芽、愈伤组织等效果较好。

两种技术成功的基础和关健是应获得大量染色体缩短适宜的分裂细胞。

第二节取材一般来说，凡是能进行细胞分裂的植物组织或单个细胞，例如，植物的顶端分生组织(根尖和茎尖)，幼小的花，居间分生组织，愈伤组织，幼胚及胚乳，大、小孢子母细胞的减数分裂时期，以及小孢子发育成雄配子过程中的两次细胞分裂等，都可以作为观察染色体的适宜材料。

在植物的生长发育过程中，各器官的分生组织或细胞的分裂活动，既有其自身发育的阶段性，又受外界环境条件的影响。

只有充分掌握这些组织的一般结构和生长发育的一般规律，了解每个具体植物的生长发育特性，创造适宜的环境条件，才便于取得合适的材料。

而准确的取材，是制作优良的染色体标本的基础。

1．取材部位1.1根尖根尖可以分为根冠、分生区，伸长区和成熟区。

图1.2根尖结构模式图分生区：此部分约1～2mm长，多为等直径的细胞，细胞质浓厚、细胞核较大并约占整个细胞体积的3/4。

分生区细胞均可进行不断的分裂活动，但是，不同部位的细胞分裂的频率是有明显差别的。

此外，细胞分裂也是不同步的。

在植物体细胞染色体的研究中，根尖分生组织为最主要的材料，因为取材方便，分生区易于识别，如以种子萌发取根，则不受季节的影响，这是其他材料所不及的。

根尖材料可以从多种途径而获得，要根据具体情况从优选择。

1.1.1以种子萌发取根这是最常用的主要方法。

为获得良好的种子根，除种子的饱满度和生活力等种子的品质外，种子的萌发条件的选择，以获得生长健壮的根尖材料也很重要。

经验表明，生长健壮的根尖不仅细胞分裂频率较高，而且染色体形态也较平直，而根尖生长势差的材料，不仅分裂频率低，而且染色体形态也多是扭曲的，即所谓的。

1.1.1.1滤纸培养法适用于某些蔬菜作物的小型种子和禾本科植物种子的萌发。

1.1.1.2纱布培养法即将种子用潮湿的新纱布包裹，置于加盖的玻璃容器中萌发，每天用温水洗涤1～2次。

此法很适合多数小型种子的萌发，效果比前者为优。

1.1.1.3锯末或砂土培养法基质消毒后，非常适于容易腐烂的豆类种子萌发。

1.1.1.4水培法即取包装用的硬质泡沫塑料薄片，在其上打出大小适宜的小孔，然后将种子的胚一端朝下植人小孔中，与水面接触，制成培养床，使其飘浮在任一可盛水的大容器的水面上。

此法不需换水，取根甚为方便，适合于各种大形种子的萌发。

也适用于某些小鳞茎(例如大蒜)的萌发取根。

1.1.1.5试管培养法某些稀少或珍贵的种子，或种皮含抑制萌发物质的休眠种子，可经消毒，剥去种皮接种在MS琼脂培养基上培养。

此法培养的根尖生长良好，细胞分裂频率也较高，是很有效的方法。

1.1.2鳞茎水培取根此法适用于洋葱、蒜、中国水仙、风信子等。

水培中经常更换新鲜的同温水，是获得良好材料的关键。

1.1.3扦插取根此法适用于扦插繁殖为主的植物，如杨、柳、桑、葡萄、菊花。

1.1.4从植株上直接取根此法适用于大部分禾本科植物，例如，麦类作物在分蘖期长出的大量不定根，比种子萌发的根更健壮，是很好的材料。

1.2茎尖一个营养生长的茎尖的宏观结构，一般包括生长锥和叶原基两部分。

图1.3茎尖结构模式图茎尖的取材，主要适用于一些难以获得种子或种子不易发芽的木本植物。

例如，许多果树、竹类、木本花卉等。

茎尖细胞柔嫩和易于制片，在用于压片法时，是比根尖更为优良的材料。

茎尖取材困难和操作繁复是其主要缺点，其有生长季节的严格限制，休眠芽是不适于取材作细胞学观察的。

其次，是取材时一般需要在放大镜下剥去幼叶，切取生长锥和叶原基部分，常常难免带有一些成熟细胞或是木质分子、结晶等。

所以，许多茎尖材料不适于用压片法，而宜用去壁低渗法制片。

1.3幼叶从叶原基发育至成熟的叶片，其生长发育的早期，主要以细胞分裂活动而增加其体积，所以，在幼叶期也可供作为染色体研究的材料。

顶端分生组织的细胞分裂活动停止较早，居间分生组织较晚，即叶片的成熟过程是由顶向基的。

幼叶的取材，大小因植物而异，总的原则是越小越好。

以麦类植物为例，以0.5～1cm长的幼叶为宜，取其叶片基部制片最好。

1.4幼小子叶在双子叶植物中，子叶极为发达，在胚的发育早期，亦有非常旺盛的细胞分裂活动，是观察染色体的良好材料。

尤其是一些豆科植物，取材也极方便，在开花结实期间，可以获得大量材料。

子叶的取材，以胚发育早期的幼小子叶为宜，越小越好。

作为取材标准，大小则因植物的种子大小不同而异。

例如，蚕豆的幼小子叶长1.5～3mm为宜。

总的来看，从取材之方便和制片之容易两个方面而言，幼小子叶均优于幼叶，是很有应用价值的材料。

1.5愈伤组织这是指在人工培养条件下产生的愈伤组织。

植物组织的培养在理论研究和育种实践中应用时，常常需要检查所培养的愈伤组织的染色体数目或结构的变异。

原则上取材时应注意的两点:其一,以转移到新鲜培养基上3～7d后取材较为合适，此时容易获得较多的分裂细胞;其二，应在解剖镜下仔细辩认正在生长和已老化了的细胞群。

通常，老化的细胞群比较疏松而呈透明状，这是因为细胞体积较大而且高度液泡化之故，而分生细胞群的细胞较小，含较大的细胞核和浓厚的细胞质，故外观上显得致密而折光性较强，所以，应取此类细胞群进行预处理。

1.6胚乳裸子植物最适于用胚乳作观察材料,如松、柏和银杏等。

一般在传粉后3天即可开始取材，其细胞分裂时间持续较长。

除上述5种取材方法以外，还可从居间分生组织、茎形成层和花蕾等部位进行观察。

2.取材时间这里所说的取材时间，系指一天中什么时间取材的问题。

不同的植物，不同的个体之间以及不同的温度条件下，细胞的分裂周期可变的，不恒定的。

大量试验表明，只要植物的分生组织处于良好的活动状态，在一天中什么时间取材均可。

需要加以说明的是，某些低等生物如原生动物和藻类，以及在恒温条件下培养的细胞系，其细胞分裂则往往可以表现出周期的节律性。

但这些特点是不能简单地引伸到高等植物的分生组织细胞分裂活动中去的。

第三节预处理1.预处理的作用在植物体细胞染色体的观察和研究中，一般均以有丝分裂中期的染色体最为合适。

但存在三个困难集中中期染色体：（1）分裂中期持续时间很短，一般只有10～30min；（2）在正常条件下，中期分裂相所占比例很小；（3）分裂中期的染色体很难将其分散开。

尤其是染色体较大或数量比较多的材料，很容易产生染色体的严重重叠，不仅不能识别单个的染色体形态，有时甚至连计数也困难。

因此，体细胞染色体制片，一般需要用化学的或物理的方法对材料进行预先处理。

预处理是否适宜，是染色体制片技术申最关键的操作步骤。

预处理的目的在于：（1）阻止或破坏纺锤体微管的形成，有丝分裂过程被阻抑在分裂中期阶段，这样便可以累积比较多的处于分裂中期的染色体；（2）导致染色体高度浓缩，使染色体变短，从而利于染色体的分散。

2．预处理的方法2.1处理方式就植物材料本身而言，处理方法可分为两类，离体处理和非离体处理。

离体处理：是指将所要处理的器官或组织从母体上切除下来，浸没在预处理液中进行处理。

非离体处理：是指不与母体分离，而只把所处理的部分浸入预处理液中进行活体处理。

2.1.1离体处理预处理药物作用迅速、操作比较简单方便，是最常用的处理方法。

通常是把根尖和茎尖等切下，投人有预处理液的指形管中处理。

在离体处理条件下，细胞是处于严重缺氧和有毒害的恶劣环境中。

此外，由于材料较小而又脱离了母体，细胞代谢活动所需的能源被中断。

如果毒害严重或处理时间太长，细胞将死亡。

为了改善这种恶劣条件而利于得到较好的预处理效果，具体操作时应注意以下几点：（1）每一指管中处理的材料切忌过多，一般较大的根尖或茎尖不超过10个，小根尖或茎尖不超过15个为宜。

（2）切取材料宜小，例如，根尖，以2～3mm长为宜。

（3）在处理期间，如能更换一次新鲜溶液更好；并经常振摇，如果可能的话，向溶液中通气将是很有利的。

（4）尽可能在避光下处理。

此外，如果材料较多，改用培养皿作处理容器，可显著改善处理的环境条件，效果良好。

2.1.2非离体处理在这种处理方法中，由干分生组织不与母体分离，故其抗药物毒害的能力比离体者强。

但也正因为如此，药物的作用也相应成缓慢，所以，这类处理的持续时间便随之延长。

如处理得当，非离体处理能比之离体处理累积更多的中期分裂细胞。

但是，如持续处理的时间过长，则又常会导致产生多倍化细胞，在计数染色体时，要考虑到这一特点。

非离体处理方法，很适合处理一些具大染色体的植物材料。

2.2预处理药物2.2.1秋水仙素（colchicine）常用浓度0.05-0.2%水溶液，易溶于冷水，有剧毒；高温与照光易失效，现配现用。

适用于大、中、小染色体。

2.2.2对二氯苯（p-Dichlorobenzene pDB）常用饱和液，溶于乙醇等有机溶剂，难溶于水。

适用于大、中、小染色体，尤其适合染色体计数；使染色体易于分散较好，但显示缢痕较差。

2.2.3 8-羟基喹啉（8-hydroxyquinoline）多用0.002mol/L水溶液，易溶于乙醇，难溶于水，配后于60℃温箱数小时，完全溶解后，冷却即可。

适宜中、小染色体，离体处理好。

优点在于显示缢痕清晰，缺点在于中期分裂相不如其他的多，但总体优于其他药物。

2.2.4α-溴萘（α-Bromonaphthalene ）饱和液现配最好，适于禾本科及水生植物，活体处理。

100ml加2滴即可。

2.2.5放线菌酮（cycloheximide）适宜早中期染色体供核型分析和G-带研究。

20-50ppm，小染色体用低浓度，大染色体用高浓度。

2.2.6混合处理液对二氯苯+α-溴萘，100ml对二氯苯饱和液加1-2滴α-溴萘，对大、中染色体作用迅速。

可在短时间内明显缩短。

秋水仙+8-羟基喹啉，等量混合。