第五章 酶的提取与分离纯化

温控和能耗
• 采用夹套冷却的方式实现温控,效果较好; • 能耗与细胞破碎率成正比;
超声破碎
• 机理：声频高于15～20kHz的超声波在高强度声 能输入时可以进行细胞破碎，破碎机理尚未清楚， 可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。 • 破碎效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及 菌种类型等因素有关。
• 优点：操作简便，液量损失少 • 存在问题：使敏感物质变性失活，噪声大，大容 量时效率低，应用潜力有限。
• 空化现象：在强声波作用下，引起气泡 形成，胀大和破碎的现象。
看得到的空化现象
锡箔纸测试空化强度与空化密度
超声波破碎的适用范围
超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物 的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对 酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物 质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实 验室小规模细胞破碎中常用。
路线一A
不同类型的细胞分泌目标产物的类型：
动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌在 培养液中。 植物细胞：多为胞内产物。 微生物：大多数小分子代谢产物分泌在胞外；大多 数大分子产物和基因重组产物为胞内产 物，如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2 等均为胞内产物。
对于胞内产物，首先必须将细胞破碎，使产物得以 释放，才能进一步提取。

放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖 为主要成分，所以也能采用溶菌酶，
酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、 几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。 植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和 半纤维素酶裂解。


酶解法的特点
利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构 和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。 优点： 发生酶解的条件温和 能选择性地释放产物 胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整
细胞壁的组成与结构
• 微生物细胞的外围通常包括细胞壁和细胞膜。 细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞免受 机械损伤的功能； 细胞膜（内壁）：具有高度选择性的半透膜，控制胞 内外一些物质的交换渗透作用。 • 细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生 物其细胞壁的结构特性是不同的，取决于遗传和环境 因素。
6mol/L HCl。
• 碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞
内渗漏出来。
成本低，反应激烈，不具选择性。
不适用于酶工程！！
2、表面活性剂
无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子 型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用， 能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通 透性增加或溶解
细胞破碎常用的表面活性剂：
仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用 酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗 生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。
细胞破碎
渗透压
2、冻结-融化法（温度差破碎法）
将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。 一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增 加细胞的亲水性能， 另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞 膨胀而破裂。
四、酶解（酶溶法 Enymatic lysis)
酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受 到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。 溶菌酶、 溶菌酶主要用于细菌类
β-1，3-葡聚糖酶、 酵母类
β-1，6-葡聚糖酶、
常用的酶
蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、
肽键内切酶、
壳多糖酶等

溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分 子的β -1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂 解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生 溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无 效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。
细胞破碎方法及其原理
机械破碎 物理破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。 通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
捣碎法 研磨法 匀浆法 超声法 温度差破碎法 压力差破碎法 有机溶剂： 表面活性剂： 酸碱 自溶法 外加酶制剂法
第五章 酶的提取与分离纯化
第一节 细胞破碎技术
生物分离过程的一般流程
原料液 原料液 细胞分离 ( 细胞分离 ( 离心，过滤 离心，过滤 )) 细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离 粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳 层析、电泳 ) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 凝胶过滤、超过滤 ) 浓缩( 超过滤 超过滤) 精制( 结晶、干燥 结晶、干燥 ) 路线一 路线二 清液－胞外产物
优点
对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽 和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提 取。
缺点
通用性差；
对酶工程适用性较差！！！
时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒。 化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产 物纯度
化学破碎
酶促破碎
一、机械破碎法
• 通过机械运动所产生的剪切力的作用，使 细胞破碎的方法
• 捣碎法：利用捣碎机的高速旋转叶片产生 的剪切力将组织细胞破碎
– 常用于破碎动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的 组织细胞
• 研磨法：利用研体、石磨、细菌磨、球磨 等研磨器械产生剪切力，将组织细胞破碎 的方法。
– 必要时可加入精制石英砂、小玻璃珠、玻璃粉 等作为助磨剂，以提高研磨效果。
革兰氏 革兰氏 植物细 酵 母 霉 菌 阳性细菌 阴性细菌 胞 壁厚(nm) 20~80 10~13 100~30 2~7μ m 0 100~250 层次 单层 多层 多层 多层 多层
主要组成 葡聚糖 甘露聚 糖 蛋白 质 脂 类 破碎 较难破 较难破碎 较易破碎 难易程度 碎 肽聚糖 多 糖 磷壁酸 蛋白质 脂多糖 肽聚糖 脂蛋白 脂多糖 磷 脂 蛋白质 多聚糖 纤维素 脂 类 半纤维素 蛋白质 果胶物质 木质素 蛋白质 难破碎 很难破碎
十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；
非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等 对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏 内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。
3、有机溶剂
能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞 内物质被释放出来。
有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲 苯等
三、化学法（Chemical permeation）
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞 壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质 有选择地渗透出来。
该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。
1、酸、碱处理法
• 酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用
悬浊液，通过1至3分钟的剧烈 搅拌，能使细胞彻底的破裂， 甚至一些骨头、微生物的孢子 通过玻璃珠的研磨也能有效的 磨碎。
• 玻璃珠适用性：
细菌用0.1mm的玻璃珠
酵母、藻类和组织培养细胞用 0.5mm的玻璃珠 动植物的组织用1mm的玻璃珠
WS K 卧 式 高 效 全 能 珠 磨 机
ZM 系 列 卧 式 密 闭 珠 (砂) 磨 机
适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，需 反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些 蛋白质变性。
3、压力差破碎法
通过压力突然的变化，达到细胞破碎的目的。
a.高压冲击法：结实容器中装入冰晶、石英砂等。 用活塞或冲击锤施以高压冲击。P=50~500MPa b.突然降压法：悬浮液装进高压容器，加压至 30MPa，打开出口阀使悬液迅速流出。 要点： 瞬间可达爆炸的 •压力差：3MPa以上 效果 •降压速度：速度越快越好 •细胞种类和生长期：革兰氏阴性菌生长期
细胞破碎
• 定义：通过各种方法使细胞结构破坏的技术过程 • 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的酶的基础。 有效的细胞破碎对分离和纯化胞内酶是必要的。 • 细胞破碎过程中必须考虑的因素
细胞壁的坚韧程度 、目标产品的性质 、破碎 的规模、方法 、费用等 .
细胞壁结构对破碎的影响
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
缺点：
溶酶价格高，
溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)
产物抑制的存在。
机械破碎法与非机械破碎法的比较
比较项目 机械法 非机械法
破碎机理 切碎细胞 溶解局部壁膜 碎片大小 碎片细小 细胞碎片较大 内含物释放 全部 部分 黏度 高（核酸多） 低（核酸少） 时间，效率 时间短，效率高 时间长，效率低 设备 需专用设备 不需专用设备 通用性 强 差 经济 成本低 成本高 应用范围 实验室，工业范围 实验室范围
实验室连续破碎池结构示意图
超声波破碎仪
大功率 超声波破碎仪
二、物理破碎法
• 通过温度、压力、声波等物理因素的作用 使组织细胞破碎的方法，多用于微生物细 胞破碎
1、渗透压变化法
渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，
将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的 甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞 内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平 衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓 冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅 速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。