基因工程实验技术原理
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1 离心收集菌液（5000-10,000 g），弃上 清，控尽。
2 加溶液 I（菌液体积的1/10），悬浮菌体 NOTE：溶液I 的major role是(1)安全过 渡,保持细胞的完整; (2)维持溶液一定的黏度; (3)维持溶液一定的离子强度.
3 加溶液Ⅱ,混匀 4 加溶液Ⅲ，倒转混匀
质粒的提取和纯化
丰富多彩的PCR
RT-PCR nested PCR XL-PCR 反向PCR touchdown-PCR
NESTED-PCR
• 什么是巢式PCR？巢式PCR如何进行？
• 什么情况下要用巢式PCR？
A）[template DNA]很低，不易得到产物 B）容易出现假阳性时
一种高特异性的TD-PCR
基因工程常用酶特性及其应用
反转录酶（reverse transcriptase，RTase） 特性： 1)商品有两种：来自鼠或鸟反转录病毒; 2)鼠RTase系单一肽链,而鸟RTase组成是αβ;
两者主要区别是前者的RNase活性较低; lab内常用的是后者.
反转录酶
RTase的酶活性包括:
a)RDDP b)DDDP c)RNaseH
基因工程实验技术原理
郑州大学医学院生化及分子生物学教研室 张贵星
基因工程（genetic engineering）
genetic engineering： the technology of preparing recombinant DNA in vitro by cutting up DNA molecules and splicing together fragments from more than one organism
RTase用作DNA聚合酶时,缺乏3’ →5’ 外切 活性,因此它不是高保真酶; RTase用作RNase时, 既有RNA内切酶又有 两种外切酶活性.
反转录酶
反转录酶与klenow酶比较:
酶活性
RTase
DDDP
+
RDDP
+
3’5’DNA外切
-
RNaseH
+
klenow + +
2 进行普通的扩增反应
TD-PCR的改进
Leabharlann Baidu• 缩小降落范围（降低降落的起始温度） • 增加每个降落温度上的循环数
TD-PCR的应用
• 短序列引物； • Mg2+浓度不适当； • Tm（变性温度）值或Ta（退火温度）值
相距较远的一对引物；
• 复杂的模板DNA，如基因组DNA
PCR产物的T-A克隆
为什么要用TD-PCR ？
普通PCR常出现假阳性的非特异带
TD-PCR可以有效地降低PCR的假阳性， 提高PCR特异性
TD-PCR的工作原理
• 引物与模板的退火：
特异的退火，发生在较高的温度 而非特异退火，在较低的温度才开始
• TD-PCR：
• 1 先从高到低逐步降低退火温度，造成特
异产物与非特异产物间量的差别
目的、原理、应用
什么是TD-PCR ？
TD-PCR，touchdown PCR Don 1992 年首次发表文章提出TD-PCR
'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification
Nucleic Acids Res, 1992,19(14):4008
溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH
1% SDS 溶液 Ⅲ： 3 mol/L Kac
11.5% 冰乙酸（glacial acetate） 3 mol/L NaAc （pH5.2） 70% 乙醇 TE液
质粒的提取和纯化
• Procedure for extraction of plasmid DNA:
成β-半乳糖苷酶，从而生成蓝色物质 工程菌基因的基因型应该是lacZ- lacZ’ lacZ’基因一般在质粒载体上
PCR技术初步
1 What is PCR? PCR=polymerase chain reaction PCR 是一种快速、有效的体外(in vitro)DNA合成技术
PCR技术初步
质粒的提取和纯化
7 加1/10体积的3 mol/L NaAc(pH5.2)和2倍体积的 无水乙醇,充分混匀,置-20℃,离心沉淀，弃上 清。 NOTE: roles of 3 mol/L NaAc, 中和,复性DNA, 形成Na+-DNA盐。
8 70% 乙醇洗沉淀,离心,弃上清,自然晾干。 why？To remove some possible salts!
PCR技术初步
Taq 酶的特性： a) 耐热 b)缺乏校正活性(3’-5’外切酶活性)，相 对容易错误掺入 c)合成速度:1200bp/min d)在新链3’-端额外加上一个A
PCR技术初步
4 PCR基本原理 4.1 高温变性 4.2 低温退火 4.3 中温聚合
PCR技术初步
5 普通PCR的缺点: 5.1 容易出现假阳性, 可能的原因有 template、引物、酶、 Mg2+等浓度 过高；退火温度太低；PCR程序中 各种参数的影响 5.2 应用有限
T4 DNA 聚合酶
3.3 T4DNA聚合酶
特性：a) 仅有5’→3’合成及3’ →5’外切两种活性; b) 3’ →5’ 外切活性相对较高; c) 它的3’ →5’外切活 性可以切割任何形式的3’ –OH末端; d) 3’ →5’ 外 切 切单链>切双链速度; e) DNA POL I 通过nick translation制备的probe常有hairpin结构(dsDNA末 端呼吸作用+ 5’→3’外切活性和强合成能力),而 T酶4D仅N能A用PO于L5标’-突记出的端pro或be钝无末ha端irp标in记结,构而;Tf4)DkNleAnow P标O记L还ds可DN以A用时于,不3能’-突有出效端标的记标其记中;间g)区T4段D。NA POL
基因工程常用酶特性及其应用
2 DNA 连接酶 2.1 特性:
a)只能连接nick,不能连gap; b)分T4和大肠杆菌两种ligase,前者(需ATP) 可用于粘端和钝端连接,后者(需NAD)只能 用于粘端连接; c) 最适温度37℃
DNA 连接酶
2.2 影响连接反应的因素: a) [ATP], 一般在10μ M~1.0mM, 钝端连 接在[ATP]=0.1mM时,载体自身环化最高 b)温度: 钝端连接在室温,粘端12-16℃ c) [连接酶],钝端连接时[连接酶]=1-2u,粘 端时, [连接酶]=0.1u d) 反应时间:粘端24hr或过夜,钝端3hr e) 片段/载体比例: 3-4/1
显，黏度降低
• 变性Tm，复性Ta
• RNA：
• 单链，核糖，U
• 线性分子，黏度小
• OD260 • 变性后OD260增加不
明显，黏度升高
质粒的提取和纯化
• 质粒提取主要试剂：
溶液 I： 50 m mol/L 葡萄糖 25 m mol/L Tris-HCl（pH8.0） 10 m mol/L EDTA （pH8.0）
Genetic Engineering
• Recombinant DNA Technology • Molecular Cloning • Gene Cloning
• Clone: (in Greek, =klon, twig) • History of cloning
核酸的理化特性
• DNA： • 双链，脱氧核糖，T • 线性分子，黏度大 • 最大紫外吸收 OD260 • 变性后OD260增加明
1 普通Taq酶合成的双链DNA，其3’-末端一 般都有一个悬挂的A
2 T-vector
基因工程常用酶特性及其应用
1 限制酶： 特性：
（1）识别palindrome序列；切割位置固定； （2）酶的活性形式是homodimer； （3）所有RE(II)均需Mg 2 +才有活性； （4）仅有内切活性，无甲基化功能；但对
基因工程一般步骤
5 筛选重组体 蓝白筛选 (α-互补法) 营养缺陷互补法 抗生素抗性互补
DNA的限制性内切酶切割
容易出现的问题 1 酶的选择 (价格) (保证勿将目的基因切断) 2 定向/非定向问题 3 星号活性 (star activity) 4 酶浓度与切割的特异性 5 BSA的应用: 保护酶,防止非特异切割,长
NOTE：溶液 I:Ⅱ:Ⅲ的比例是2:4:3 Ⅱ液:裂解细胞,碱变性DNA、蛋白质等 Ⅲ液：中和液，沉淀基因组DNA及蛋白等。 自Ⅱ液加入后，混匀过程要轻柔，避免基因组DNA 成短碎片而与质粒DNA混在一起。 5 离心（8,000g以上） 6 转移上清至另管, 加等体积平衡酚液(pH8.0),充分 混匀,离心,取上清至另管,酚/氯仿(酚:氯仿:异戊醇 25:24:1)抽提一次,再氯仿抽提一次，上清至另管。
时间切割
DNA片段的连接
1 DNA ligase的选择 T4-DNA ligase 可用于各种连接(ATP) 大肠杆菌DNA ligase ,仅用于C-C连接
(NAD) 2 连接温度的选择
黏端连接: 12-16℃ , 过夜 平端连接: 室温 , 3 hour
蓝白筛选(α-互补)原理
关键基因: lacZ (β-半乳糖苷酶基因) LAC Z 催化底物Xgal生成蓝色产物 lacZ’ 是lacZ 的一小部分，产物是α-肽 α-肽在细胞内和lacZ- lacZ’ 的基因产物组
9 TE（Ph8.0）溶解DNA, -20℃保存。
基因工程一般步骤
1 分离目的基因
化学合成 制备cDNA文库 制备基因组文库 PCR
基因工程一般步骤
2 DNA切割 限制性内切酶vector和目的基因片段
基因工程一般步骤
3 连接
B-B连接(blunt end-blunt end)(非定向) C-C连接(cohesive end- cohesive end) (非定向/ 定向) B-C连接(定向)
基因工程常用酶特性及其应用
3 DNA聚合酶
3.1 DNA POL I
特性: a) 3种酶活性; b) 3’ → 5’外切活性 相对较弱; c) 5’ → 3’ 外切主要产物是5’ – 单核苷酸,还有少量具5’ –P的寡核苷酸 (n<10个); 5’ → 3’ 外切时, 5’ –end须有磷 酸; 5’ → 3’ 外切活性随5’ → 3’ 合成活性 的↑而↑ 。
甲基化的palindrome，未必都可以识别、 切割。
限制酶重要概念及应用
1 isoschizomers： 识别序列相同，但切割位点不同， 如 XmaI 和 SmaI： CXCCSGGG
2 isocaudamers： 识别序列不同，但切割后产生相同的ends 如 BamHI G↓ GATCC,Bgl II A↓ GATCT Sau3AI ↓ GATC
T4 DNA 聚合酶
应用：
1）标记各种DNA末端 (5’-突出粘端, 3’-突 出粘端,平末端) (klenow只能用于5’-突出 粘端和平末端的标记)
2）变5’-突出粘端或3’-突出粘端为平末端 （高浓度dNTPs时， 3’ →5’外切反应止 于双链区）
3） 举例：T4DNA聚合酶标记EcoRI末端
2 PCR在现代分子生物学中的重要性 a) 临床(遗传)疾病的检测 b) 法医学鉴定 (基因身份证,嫌犯认证,亲 子鉴定) c)基础医学研究
PCR技术初步
3 PCR的组成体系: 3.1模版DNA (template DNA) 3.2 (至少)一对引物 3.3 Taq酶(耐热DNA聚合酶) (Thermus aquaticus) 3.4 四种底物dNTPs 3.5 buffer (包括Mg2+)
基因工程一般步骤
4 转化 E.Coli细胞转化:CaCl2法制备感受态细菌 真核细胞转化: micro-injection (微注射) (细胞核大) 磷酸钙共沉淀法 (贴壁细胞) electroporation (电穿孔,电激,电击)(悬浮细胞) 基因枪(贴壁细胞/组织块) liposome (脂质体)
应用：通过nick translation制备probe
DNA聚合酶
3.2 klenow酶 特性：系DNA POL I的大片段，无5’ → 3’ 外切活性，且3’ → 5’外切活性相对较弱。 应用： a）补平5’-突出的粘端; b)标记DNA 末端(5’-突出端); c) cDNA克隆中用于cDNA第二链的合成; d) DNA测序
2 加溶液 I（菌液体积的1/10），悬浮菌体 NOTE：溶液I 的major role是(1)安全过 渡,保持细胞的完整; (2)维持溶液一定的黏度; (3)维持溶液一定的离子强度.
3 加溶液Ⅱ,混匀 4 加溶液Ⅲ，倒转混匀
质粒的提取和纯化
丰富多彩的PCR
RT-PCR nested PCR XL-PCR 反向PCR touchdown-PCR
NESTED-PCR
• 什么是巢式PCR？巢式PCR如何进行？
• 什么情况下要用巢式PCR？
A）[template DNA]很低，不易得到产物 B）容易出现假阳性时
一种高特异性的TD-PCR
基因工程常用酶特性及其应用
反转录酶（reverse transcriptase，RTase） 特性： 1)商品有两种：来自鼠或鸟反转录病毒; 2)鼠RTase系单一肽链,而鸟RTase组成是αβ;
两者主要区别是前者的RNase活性较低; lab内常用的是后者.
反转录酶
RTase的酶活性包括:
a)RDDP b)DDDP c)RNaseH
基因工程实验技术原理
郑州大学医学院生化及分子生物学教研室 张贵星
基因工程（genetic engineering）
genetic engineering： the technology of preparing recombinant DNA in vitro by cutting up DNA molecules and splicing together fragments from more than one organism
RTase用作DNA聚合酶时,缺乏3’ →5’ 外切 活性,因此它不是高保真酶; RTase用作RNase时, 既有RNA内切酶又有 两种外切酶活性.
反转录酶
反转录酶与klenow酶比较:
酶活性
RTase
DDDP
+
RDDP
+
3’5’DNA外切
-
RNaseH
+
klenow + +
2 进行普通的扩增反应
TD-PCR的改进
Leabharlann Baidu• 缩小降落范围（降低降落的起始温度） • 增加每个降落温度上的循环数
TD-PCR的应用
• 短序列引物； • Mg2+浓度不适当； • Tm（变性温度）值或Ta（退火温度）值
相距较远的一对引物；
• 复杂的模板DNA，如基因组DNA
PCR产物的T-A克隆
为什么要用TD-PCR ？
普通PCR常出现假阳性的非特异带
TD-PCR可以有效地降低PCR的假阳性， 提高PCR特异性
TD-PCR的工作原理
• 引物与模板的退火：
特异的退火，发生在较高的温度 而非特异退火，在较低的温度才开始
• TD-PCR：
• 1 先从高到低逐步降低退火温度，造成特
异产物与非特异产物间量的差别
目的、原理、应用
什么是TD-PCR ？
TD-PCR，touchdown PCR Don 1992 年首次发表文章提出TD-PCR
'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification
Nucleic Acids Res, 1992,19(14):4008
溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH
1% SDS 溶液 Ⅲ： 3 mol/L Kac
11.5% 冰乙酸（glacial acetate） 3 mol/L NaAc （pH5.2） 70% 乙醇 TE液
质粒的提取和纯化
• Procedure for extraction of plasmid DNA:
成β-半乳糖苷酶，从而生成蓝色物质 工程菌基因的基因型应该是lacZ- lacZ’ lacZ’基因一般在质粒载体上
PCR技术初步
1 What is PCR? PCR=polymerase chain reaction PCR 是一种快速、有效的体外(in vitro)DNA合成技术
PCR技术初步
质粒的提取和纯化
7 加1/10体积的3 mol/L NaAc(pH5.2)和2倍体积的 无水乙醇,充分混匀,置-20℃,离心沉淀，弃上 清。 NOTE: roles of 3 mol/L NaAc, 中和,复性DNA, 形成Na+-DNA盐。
8 70% 乙醇洗沉淀,离心,弃上清,自然晾干。 why？To remove some possible salts!
PCR技术初步
Taq 酶的特性： a) 耐热 b)缺乏校正活性(3’-5’外切酶活性)，相 对容易错误掺入 c)合成速度:1200bp/min d)在新链3’-端额外加上一个A
PCR技术初步
4 PCR基本原理 4.1 高温变性 4.2 低温退火 4.3 中温聚合
PCR技术初步
5 普通PCR的缺点: 5.1 容易出现假阳性, 可能的原因有 template、引物、酶、 Mg2+等浓度 过高；退火温度太低；PCR程序中 各种参数的影响 5.2 应用有限
T4 DNA 聚合酶
3.3 T4DNA聚合酶
特性：a) 仅有5’→3’合成及3’ →5’外切两种活性; b) 3’ →5’ 外切活性相对较高; c) 它的3’ →5’外切活 性可以切割任何形式的3’ –OH末端; d) 3’ →5’ 外 切 切单链>切双链速度; e) DNA POL I 通过nick translation制备的probe常有hairpin结构(dsDNA末 端呼吸作用+ 5’→3’外切活性和强合成能力),而 T酶4D仅N能A用PO于L5标’-突记出的端pro或be钝无末ha端irp标in记结,构而;Tf4)DkNleAnow P标O记L还ds可DN以A用时于,不3能’-突有出效端标的记标其记中;间g)区T4段D。NA POL
基因工程常用酶特性及其应用
2 DNA 连接酶 2.1 特性:
a)只能连接nick,不能连gap; b)分T4和大肠杆菌两种ligase,前者(需ATP) 可用于粘端和钝端连接,后者(需NAD)只能 用于粘端连接; c) 最适温度37℃
DNA 连接酶
2.2 影响连接反应的因素: a) [ATP], 一般在10μ M~1.0mM, 钝端连 接在[ATP]=0.1mM时,载体自身环化最高 b)温度: 钝端连接在室温,粘端12-16℃ c) [连接酶],钝端连接时[连接酶]=1-2u,粘 端时, [连接酶]=0.1u d) 反应时间:粘端24hr或过夜,钝端3hr e) 片段/载体比例: 3-4/1
显，黏度降低
• 变性Tm，复性Ta
• RNA：
• 单链，核糖，U
• 线性分子，黏度小
• OD260 • 变性后OD260增加不
明显，黏度升高
质粒的提取和纯化
• 质粒提取主要试剂：
溶液 I： 50 m mol/L 葡萄糖 25 m mol/L Tris-HCl（pH8.0） 10 m mol/L EDTA （pH8.0）
Genetic Engineering
• Recombinant DNA Technology • Molecular Cloning • Gene Cloning
• Clone: (in Greek, =klon, twig) • History of cloning
核酸的理化特性
• DNA： • 双链，脱氧核糖，T • 线性分子，黏度大 • 最大紫外吸收 OD260 • 变性后OD260增加明
1 普通Taq酶合成的双链DNA，其3’-末端一 般都有一个悬挂的A
2 T-vector
基因工程常用酶特性及其应用
1 限制酶： 特性：
（1）识别palindrome序列；切割位置固定； （2）酶的活性形式是homodimer； （3）所有RE(II)均需Mg 2 +才有活性； （4）仅有内切活性，无甲基化功能；但对
基因工程一般步骤
5 筛选重组体 蓝白筛选 (α-互补法) 营养缺陷互补法 抗生素抗性互补
DNA的限制性内切酶切割
容易出现的问题 1 酶的选择 (价格) (保证勿将目的基因切断) 2 定向/非定向问题 3 星号活性 (star activity) 4 酶浓度与切割的特异性 5 BSA的应用: 保护酶,防止非特异切割,长
NOTE：溶液 I:Ⅱ:Ⅲ的比例是2:4:3 Ⅱ液:裂解细胞,碱变性DNA、蛋白质等 Ⅲ液：中和液，沉淀基因组DNA及蛋白等。 自Ⅱ液加入后，混匀过程要轻柔，避免基因组DNA 成短碎片而与质粒DNA混在一起。 5 离心（8,000g以上） 6 转移上清至另管, 加等体积平衡酚液(pH8.0),充分 混匀,离心,取上清至另管,酚/氯仿(酚:氯仿:异戊醇 25:24:1)抽提一次,再氯仿抽提一次，上清至另管。
时间切割
DNA片段的连接
1 DNA ligase的选择 T4-DNA ligase 可用于各种连接(ATP) 大肠杆菌DNA ligase ,仅用于C-C连接
(NAD) 2 连接温度的选择
黏端连接: 12-16℃ , 过夜 平端连接: 室温 , 3 hour
蓝白筛选(α-互补)原理
关键基因: lacZ (β-半乳糖苷酶基因) LAC Z 催化底物Xgal生成蓝色产物 lacZ’ 是lacZ 的一小部分，产物是α-肽 α-肽在细胞内和lacZ- lacZ’ 的基因产物组
9 TE（Ph8.0）溶解DNA, -20℃保存。
基因工程一般步骤
1 分离目的基因
化学合成 制备cDNA文库 制备基因组文库 PCR
基因工程一般步骤
2 DNA切割 限制性内切酶vector和目的基因片段
基因工程一般步骤
3 连接
B-B连接(blunt end-blunt end)(非定向) C-C连接(cohesive end- cohesive end) (非定向/ 定向) B-C连接(定向)
基因工程常用酶特性及其应用
3 DNA聚合酶
3.1 DNA POL I
特性: a) 3种酶活性; b) 3’ → 5’外切活性 相对较弱; c) 5’ → 3’ 外切主要产物是5’ – 单核苷酸,还有少量具5’ –P的寡核苷酸 (n<10个); 5’ → 3’ 外切时, 5’ –end须有磷 酸; 5’ → 3’ 外切活性随5’ → 3’ 合成活性 的↑而↑ 。
甲基化的palindrome，未必都可以识别、 切割。
限制酶重要概念及应用
1 isoschizomers： 识别序列相同，但切割位点不同， 如 XmaI 和 SmaI： CXCCSGGG
2 isocaudamers： 识别序列不同，但切割后产生相同的ends 如 BamHI G↓ GATCC,Bgl II A↓ GATCT Sau3AI ↓ GATC
T4 DNA 聚合酶
应用：
1）标记各种DNA末端 (5’-突出粘端, 3’-突 出粘端,平末端) (klenow只能用于5’-突出 粘端和平末端的标记)
2）变5’-突出粘端或3’-突出粘端为平末端 （高浓度dNTPs时， 3’ →5’外切反应止 于双链区）
3） 举例：T4DNA聚合酶标记EcoRI末端
2 PCR在现代分子生物学中的重要性 a) 临床(遗传)疾病的检测 b) 法医学鉴定 (基因身份证,嫌犯认证,亲 子鉴定) c)基础医学研究
PCR技术初步
3 PCR的组成体系: 3.1模版DNA (template DNA) 3.2 (至少)一对引物 3.3 Taq酶(耐热DNA聚合酶) (Thermus aquaticus) 3.4 四种底物dNTPs 3.5 buffer (包括Mg2+)
基因工程一般步骤
4 转化 E.Coli细胞转化:CaCl2法制备感受态细菌 真核细胞转化: micro-injection (微注射) (细胞核大) 磷酸钙共沉淀法 (贴壁细胞) electroporation (电穿孔,电激,电击)(悬浮细胞) 基因枪(贴壁细胞/组织块) liposome (脂质体)
应用：通过nick translation制备probe
DNA聚合酶
3.2 klenow酶 特性：系DNA POL I的大片段，无5’ → 3’ 外切活性，且3’ → 5’外切活性相对较弱。 应用： a）补平5’-突出的粘端; b)标记DNA 末端(5’-突出端); c) cDNA克隆中用于cDNA第二链的合成; d) DNA测序