微生物细胞的破碎及破碎率测定1

细胞破碎的方法很多，归纳起来可分为机械破碎法、物 理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法等。
（1） 研磨法
研磨：将细胞悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速 搅拌或研磨，使细胞破碎。
实验室设备：Mickle高速组织捣碎机和Braun匀浆器， 利用玻璃小珠撞击微生物细胞而破碎。
主要缺点：温度迅速升高，需冷却。 另外，较大量的细胞可用胶质磨来处理。
4. 超声波在液体中起空穴作用，使液体温度会快速 升高，可采用短时间的多次破碎，同时可补加冰 浴冷却。
思考题
1. 细胞破碎的方法有哪些？ 2. 超声波破碎细胞时应注意的问题是什么？ 3. 计算本次实验细胞破碎的破碎率。
实验步骤
1、研磨法
• 细胞培养和收集：将活化菌种接入肉汤液体培养基中， 37℃振荡培养。当到达对数少长期后(约18h)，用离心 机收集细胞，3500rpm离心20min。
• 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破碎 缓冲液中。
• 研磨：在研钵中加入适量石英砂，与菌悬液混合，研 磨10min。
• 超声波破碎： 800W，工作6s，间歇6s，破碎75次。 • 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染1’、
脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。
3、酶解法
• 细胞培养和收集：将活化的巨大芽孢杆菌种接入肉汤 液体培养基中，37℃振荡培养。当到达对数少长期后 (约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心20min。
例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成阴性菌的颜 色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色， 而受损害的酵母细胞呈现亮红色。
（2）测定释放的蛋白质量或酶的活力
测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。 通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中 蛋白质的含量或酶的活力，并与100％破碎所获得的 标准数值比较。
（3） 酶解法
原理：利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊 的键，从而达到破壁目的。
常用的溶酶
溶菌酶： 主要用于细菌类 蛋白酶 甘露糖酶 糖苷酶 肽键内切酶 壳多糖酶
利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择 适当的酶，并确定相应的次序。
如：对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘 露糖结构，使两者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层， 最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破 裂，释出胞内产物。
超声波破碎机的使用步骤
1．功率调整到最小值的位置。 2．设定：工作次数、超声时间（工作时间）、间隙
（间歇）时间。 3．打开开关，开机后电源指示灯亮。 4．保护复位；工作复位。 5．显示屏开始显示工作的设定数据。 6．调节功率至所需数值。 7．工作至总次数为零时候，仪器处于停振状态。如
重复实验，可按工作复位键；否则，关机，并切 断电源。
NaH2PO4•2H2O：Mr=178.05，0.2mol/L溶液为35.61g/L; NaHPO4•12H2O：Mr=358.22，0.2mol/L溶液为71.64g/L; NaH2PO4•2H2O：Mr=156.03，0.2mol/L溶液为31.21g/L; NaH2PO4•H2O：Mr=138.01，0.2mol/L溶液为27.6g/L。
《生物分离工程实验》
微生物细胞破壁及破细胞破碎的方法。 2、 掌握研磨法、超声波、酶解法破碎细
胞的原理、方法。 3、 掌握细胞破碎率的测定方法。
实验原理
1、微生物细胞的破碎
细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含物释放出来。 微生物的细胞外围通常包括细胞壁和细胞膜，它们起着支撑 细胞的作用。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，由于不同 微生物细胞壁的结构的不同，所采用的细胞破碎方法和条件 也有所不同。
（3）测定导电率
导电率的变化是由于细胞内含物被释放到水相 中而引起的。导电率随着破碎率的增加而呈线性增 加。
因为导电率的读数取决于微生物的种类、处 理的条件、细胞浓度、温度和悬浮液中电解质的含 量，因此应预先采用其他方法来进行标化。
材料准备
1. 酵母、巨大芽孢杆菌等。 2. 超声波破碎机、离心机、紫外分光光度计、研钵。 3. 烧杯（250ml）、塑料管（80ml）。 4. 无菌水、冰水、0.2mol/l磷酸盐缓冲液。 5. 显微镜（油镜）。 6. 载玻片、接种环、吸水纸、酒精灯及火柴。 7. 结晶紫染液、Lugol’s碘液、95％乙醇、番红染液。 8.溶菌酶
超声波破碎机使用注意事项
1. 按样品的多少选择适当的容器（试管或各种烧杯 及离心管），固定好，调节好振动系统的位置。
2. 变幅杆末端插入样品液面10～15mm，并使其在容 器的中心位置，不得让变幅杆与容器相接触。变 幅杆末端离容器一般应大于30mm，量小时，功率 开小情况下可大于10mm。
3. 设定：工作时间不宜开的过长，1～10秒内选用； 间隙时间应大于工作时间。
缺点及适用范围：
超声波振荡容易引起温度的剧烈上升，操作时可以在 细胞悬液中投入冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。
对于不同菌种，超声波处理的效果不同，杆菌比球菌 易破碎，革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌易破碎，对酵母 菌的效果差。
影响超声波破碎效率的参数:
① 振幅 • 振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度 k。 ② 细胞悬浮液的粘度 • 粘度影响能耗并会抑制空穴现象。
特点：
（2） 超声波法
超声波破碎是应用较多的一种破碎方法。其特点是简便、快捷、 效果好，特别适用于微生物细胞的破碎。
原理：
超声波破碎机通常在15-25 kHz的频率下操作，细胞是由于超声 波的空穴作用而破碎。空穴泡受到超声波的冲击而产生很强的 冲击波压力，引起粘滞性旋涡，在介质中悬浮细胞上造成了剪 切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。超声波 破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系，同时受细胞浓 度、溶液粘度、pH值、温度以及离子强度等因素有关。
Y(%)＝[(N0- N)/N0]× 100 由于N0(原始细胞数量)和N (经t时间操作后保留下 来的未损害完整细胞数量)不能很清楚的确定，因此 破碎率的评价非常困难。 目前N。和N主要通过下面的方法获得。
（1）直接测定法
利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞 数，所以可用于破碎前的细胞计量。可是破碎过程中 所释放的物质如DNA和其他聚合物组分会干扰计数， 此时可采用染色法把破碎的细胞从未损害的完整细胞 中区别开，以便于计数。
优点: • 产品释放的选择性高; • 抽提的速率和收率高; • 产品的破坏最少; • 对pH值和温度等外界条件要求低; • 不残留细胞碎片。
缺点：
溶酶价格高，通用性差（不同菌种需选择不同的酶）， 产物抑制的存在。
如在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖 抑制葡聚糖酶。
2、破碎率的测定
破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量 的百分比数，即:
• 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞破 碎缓冲液中。
• 酶解：称取适量酶，加入菌悬液中，使酶最终浓度为 4mg/ml，37℃条件下反应1h。
• 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染1’、 脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。
附录
缓冲液配制
pH 7.5， 0.2mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的配制： 0（.2m1o6l./0LmNLa2）HP混O匀4溶液（ 84.0 mL）0.2mol/LNaH2PO4溶液
③ 表面张力 ④ 被处理悬浮液的体积
大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。 ⑤ 珠粒的体积和直径
添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴的形 成有帮助，而且产生辅助 “研磨”效应，从而提高破 碎效率。
⑥ 探头的形状和材料
⑦ 细胞悬浮液的流速
在连续操作中，流速取决于细胞在反应器中的停留时 间，并影响破碎的总收率。 声波破碎在实验室广泛应用，但在工业范围中还未采 用这种方法，因为要向大量细胞悬浮液中通入足够 的能量是很困难的。
• 破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染1’、 脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。
2、超声波破碎
• 细胞培养和收集：将活化巨大芽孢杆菌种接入肉汤 液体培养基中，37℃振荡培养。当到达对数少长期 后(约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心 20min。
• 菌体悬液的制备；取湿细胞5-10g悬浮于30ml细胞 破碎缓冲液中。