病毒包装经验总结(病毒包装注意点)
慢病毒包装实验步骤及注意事项
慢病毒包装实验步骤及注意事项当下，基因编辑技术越来越火热，带动慢病毒包装实验越发普遍，但是大家通常在潜意识会觉得病毒载体包装过程太复杂而不敢尝试，确实，除去实验过程本身繁杂之外，做慢病毒包装实还经常容易出现各种状况，比如稳定性很差、滴度低，或者就是根本不出毒等等。
但是，热点可不等人，该来的迟早还是会来的，下面小编就为大家详细介绍一下慢病毒包装实验的基本步骤以及注意事项，希望大家能自己学会，掌握“核心”技术!慢病毒(Lentivirus)是一种逆转录病毒。
慢病毒在感染细胞时，首先会将宿主RNA逆转录为DNA，并将逆转录基因插入到宿主基因中表达。
慢病毒的基因表达系统是目前广泛使用的基因编辑操作工具。
以最常做的质粒共转染293T细胞为例，为了得到高滴度的慢病毒，慢病毒包装方法是利用表达载体与包装质粒共同转染细胞，在细胞中进行包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。
实验流程示意实验材料1)含有目的基因的病毒载体：一个包装质粒混合物(Mix=pMDL:VSVG:REV=5:3:2)和一个慢病毒载体质粒(LentiviralVector)组成;2)指数生长的293T细胞;(培养条件：DMEM+10%PBS，37℃，5%CO2)3) 试剂：胎牛血清、Opti-MEM、转染试剂实验步骤第一步：细胞分盘转染前一天,通过胰消化传代于35mm培养皿上,使细胞贴壁后所古面积达到培养皿总面积的80%以上)。
将细胞置于含5%CO2的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。
第二步：病毒转染1) 转染前1h换液(用1.5mL完全培养基换掉旧的培养基)。
2) 制备包装质粒和目的质粒与转染试剂的混合物：取无菌1.5mL EP管，加入400µl 无血清Opti-MEM，加入1.5µg 核心质粒和1.5µg 病毒包装质粒，及6µl 转染试剂 (转染试剂：质粒=2:1)，充分混匀，静置15-20min。
病毒包装及使用的常见问题
病毒包装及使用的常见问题1、问：关于病毒载体种类的选择的问题。
从载体的毒性对实验的影响来说，是逆转录还是腺病毒好呢，还是其他病毒好？从操作的难度可行性来说是慢病毒要比腺病毒容易很多吗？答：操作难度上慢病毒与腺病毒都差不多,是指重组病毒的制备和纯化角度来说的，AAV的制备就更复杂更难一些。
从载体毒性而言，慢病毒毒性较大，但它相对较少引起受体的免疫原性，而腺病毒则有较大的免疫原性。
腺相关病毒载体是比较理想的基因治疗载体，免疫原性较低，而且对受体伤害较少。
从插入目的基因角度考虑，慢病毒最大插入基因长度是5k，腺病毒最大插入基因长度是8k，腺相关病毒最大插入长度是3k。
对大多数研究者来说病毒仅仅是一个基因转移工具，在自己的研究工作中只代表工作量，并没有值得大写特写的地方。
因此，把这样的工作委托出去，就象把测序、合成引物等工作交给别人做一样。
即便是委托出去，也要明白自己的实验目的和要求是什么，才能很好地选择，同时尽量节省经费。
以腺病毒载体为例，可以这样选择：买穿梭质粒，自己做构建、鉴定和大提，交给公司做出毒、扩增和纯化和检测。
根据自己的实验要求，可以选择精纯化，也可以选择粗纯化；条件好的可以选择自己做一部分检测。
至于你的实验是选择腺病毒好，还是慢病毒或别的病毒载体好，主要还看你的实验目的，其次才是看哪那种病毒载体容易做。
2、问：重组病毒产品如何运输和保存？答：病毒产品一般采取干冰运输。
腺病毒及腺相关病毒也可以采用冰袋运输。
避免重组病毒反复冻融，请酌情分装后于-80℃保存，建议不要在-20℃下长期保存。
在我们提供的保存液中，病毒产品-80℃保存期为半年。
建议保存6~12个月以上的样品，进行实验前，重新测一次滴度。
病毒产品解冻后最好保持在冰浴中，并尽快使用。
如果解冻后的病毒一时用不完，滴度足够高时，4℃可保存1~2周。
但最好尽快用完，根据我们的经验，4℃放置1周，滴度会有4~5倍的下降。
3、问：用于体内试验的重组病毒，是否要求纯化？答：是的，病毒纯化是很必要的。
腺相关病毒（AAV）包装技巧
腺相关病毒（AAV）包装技巧上⽂已经介绍了腺相关病毒的基础知识，具有如此多优点、功能如此强⼤的腺相关病毒是如何⽣产的？本⽂将为⼤家揭开腺相关病毒⽣产的神秘⾯纱。
腺相关病毒⽣产流程⼤致可分为基因克隆、细胞转染、收毒、病毒纯化、滴度检测等步骤，具体步骤我们下⽂分解？怎么可能，下⾯就是腺相关病毒⽣产流程。
腺相关病毒重组克隆载体构建1）根据订单不同选择不同的载体，在此以⼈源基因克隆为例。
2）Vigenebio 公司的 AAV 载体与我们的⼈源 ORF （注：维真⽣物拥有18000⼈源cDNA ORF克隆，可以最快的时间克隆到载体）库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容，通过酶切，连接，转化的⽅式将基因亚克隆进⼊ pAV-FH AAV 载体，得到阳性克隆之后进⾏酶切跑胶验证及测序以确认插曲⽚段的正确性。
细胞冻存流程1) 按照培养细胞流程，将细胞吹下来加⼊ 50ml 离⼼管中， 800g 离⼼5min。
2) 配制冻存液，90% ⾎清，10% DMSO，混匀。
3) 离⼼后去上清，将配制的冻存液加⼊，将细胞吹匀4) 取上述溶液 1ml 分⾄ 1.5ml 细胞冻存管中，做好标记和⽇期。
5) 放⼊装有异丙醇的冻存盒中，放⼊-80度冰箱过夜。
（冻存盒要提前⼀天从冰箱中拿⾄室温，使异丙醇的温度达到室温，每次冻存前确保异丙醇的加⼊量在刻度线上）。
6) 第⼆天将冻存盒放⼊液氮或-150℃冰箱中。
细胞复苏流程1) 10cm 培养盘中加 10cm 新鲜 DMEM 培养基，放培养箱预热⾄ 37℃。
2) 从液氮中取出冷冻管，迅速投⼊37 ℃～38℃⽔浴中，使其融化（1-2 分钟左右）。
3) 待细胞冻存管中溶液尚未完全融化时加⼊预热的培养盘中。
4) 摇晃均匀，放培养箱培养。
5) 4h后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基（除去冻存液中 DMSO 对细胞的毒害作⽤。
也可在第 3步中 800g 离⼼5min，除去培养基后再悬浮细胞添加⾄新鲜预热的 DMEM 细胞培养⽫中）。
病毒包装载体构建常见问题汇总
病毒包装载体构建常见问题汇总病毒包装、载体构建我们整理了以下几个常见问题。
1、什么是MOI？在微生物学中，MOI是病原体(如噬菌体或病毒、细菌等)与感染目标(如细胞)的比率。
对于病毒，MOI是病毒颗粒数量与特定空间中存在的目标细胞数量的比率。
通常可将某株细胞有80%被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的MOI。
2、如何稀释病毒？您可使用完全培养基、PBS液等将病毒稀释到需要的滴度。
如将滴度为5 x109 2TU/ml的病毒稀释到1 x109 TU/ml，则需取20 µl 病毒液加入到80 µl的完全培养基中。
3、用于病毒感染的细胞接种量是多少？根据细胞增殖的速度调整细胞接种量，以保证在感染后3天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。
针对大部分细胞系：传代周期在2-3天，感染时细胞铺板的密度保持在20-30%左右，则72h后细胞增殖后铺板密度约在90%左右；针对某些原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到50%～ 60%，但要确保在感染后3天时细胞汇合度达到90%～100%；针对非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照80%的汇合度进行接种。
4、如何提高病毒对细胞的感染效率？病毒对细胞的感染效率受细胞自身生长的状态，细胞数量，细胞被病毒感染的难易程度等多个因素影响。
因此保证细胞生长状态良好，轮廓清晰，合适的细胞密度，选择最优的感染条件（如合适的MOI值）可以更好的保证感染效率。
对于悬浮细胞，可采用离心感染方法，减少病毒感染时的体积，从而提高感染效率。
如可以在加入病毒后将细胞培养板密封，用离心机在1000g条件下离心1h，再放回培养箱中正常培养。
5、加入病毒病毒后，细胞死亡很厉害，该如何处理？病毒有一定的细胞毒性，如果培养过程中细胞出现了明显的病变或细胞状态变差，建议将转导时间缩短至5~8小时之间。
或者调整并降低感染的MOI值，并且在感染后4小时、 8 小时、 12小时对细胞进行观察，若发现细胞状态变差时，则需要立刻对细胞进行换液操作，使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液6、细胞能被病毒感染，但为何GFP荧光很弱？GFP病毒感染细胞后，细胞中荧光强度取决于病毒进入到细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类等因素。
病毒包装
质粒构建：（1）将化学合成的shRNA上下游单链DNA稀释至60µM，按下列体系混匀，95℃水浴加热10min后，缓慢冷却至室温。
退火体系：上游引物：1µL下游引物：1µL退火缓冲液：48µL50µL退火缓冲液:100mM K-acetate30mM HEPES-KOH pH 7.42mM Mg-acetate（2）将退火产物连接在pLL3.7质粒的XhoI 和HpaI位点，双酶切鉴定并测序以确认连接正确。
病毒包装培养293T/17细胞（10cm培养皿）至60-70%密度后，用CaCl2沉淀法包装慢病毒。
（1）混合三种转染质粒。
将pSPAX2、pMD2G和pLL3.7-shRNA质粒按以下比例混合。
具体体系为：pSPAX2: 4µgpMD2G: 2µgpLL3.7-shRNA: 4µg2.5M CaCl2: 40µLH2O: X500µL（2）混合HEPES。
将步骤一的混合液缓慢加入2×HEPES缓冲液内，滴加时间持续1min。
将混合液置于室温静置10min。
2×HEPES:NaCl: 140mMNa2HP04·12H2O: 1.5mMHEPES: 50mM用0.5M NaOH调节pH=6.95-7.05。
（3）病毒包装。
将上一步的混合液缓慢加入293T/17细胞培养液中。
培养8h后换液，继续培养48h。
收集病毒，2000rpm离心10min，去除细胞。
分装病毒，-80℃保存。
病毒包装_精品文档
病毒包装病毒包装是一种病毒进化的策略，通过外包装来保护病毒的遗传物质并提高感染效率。
病毒包装可以理解为病毒的“伪装”，使其在宿主细胞内更容易传播和复制。
这篇文档将介绍病毒包装的原理、机制和应用。
1. 病毒包装的原理病毒是一种寄生生物，无法独立进行复制和传播。
为了成功寄生于宿主细胞，病毒必须绕过宿主的免疫系统和其他保护机制。
病毒包装就是病毒利用外包装来达到这一目的。
病毒包装的原理可以分为两个方面：1.1 保护遗传物质病毒的遗传物质通常是DNA或RNA，易受宿主的核酸酶降解。
病毒包装使得病毒的遗传物质被包裹在一个蛋白质的壳体内，从而保护遗传物质免受降解。
这种保护机制使得病毒能够在宿主细胞中长时间存活，并进行复制和传播。
1.2 提高感染效率病毒包装不仅可以保护病毒的遗传物质，还可以提高病毒的感染效率。
病毒包装通常会在病毒的壳体上表面显示宿主细胞受体结构的蛋白质，从而增加病毒与宿主细胞的结合能力。
这种结合能力的增强能够使病毒更容易进入宿主细胞，从而提高感染效率。
2. 病毒包装的机制病毒包装的机制涉及多个步骤，可以简单概括为以下几个过程：2.1 复制和组装病毒通过感染宿主细胞，利用宿主细胞的生物合成机制复制自己的遗传物质，并合成病毒壳体上的蛋白质。
这些蛋白质会进一步组装成病毒的外包装。
2.2 包装遗传物质复制和组装完成后，病毒会将自己的遗传物质包装在壳体内。
这个过程通常由特定的包装信号控制，确保只有病毒的遗传物质被包装进壳体内。
2.3 表面蛋白质的修饰病毒包装还涉及到病毒壳体表面的蛋白质修饰。
这些修饰通常是通过与宿主细胞相互作用而达到的，例如宿主细胞受体与病毒表面蛋白质的结合。
这种修饰能够增强病毒与宿主细胞的结合能力。
3. 病毒包装的应用病毒包装技术不仅在基础研究中有重要作用，还具有许多实际应用。
3.1 基因治疗病毒包装被广泛应用于基因治疗领域。
通过将需要治疗的基因导入病毒壳体内，然后通过感染宿主细胞传递基因，可以达到基因治疗的效果。
如何正确处理新冠肺炎疫情期间的药品包装
如何正确处理新冠肺炎疫情期间的药品包装在新冠肺炎疫情期间，药品包装的处理变得尤为重要。
药品包装是保障药品安全和有效性的重要环节，正确处理药品包装不仅能够保护自身安全，还能确保药品的质量和疗效。
本文将介绍如何正确处理新冠肺炎疫情期间的药品包装，以确保公众的用药安全。
一、注意个人卫生在处理药品包装之前，首先要注意个人卫生。
在接触药品包装时，要洗净双手，或使用洗手液彻底清洁双手。
这样可以避免将细菌或病毒带入药品包装中，进一步保障药品的安全性。
二、正确使用药品包装正确使用药品包装是确保药品质量和疗效的关键。
在打开药品包装时，应遵循以下几点原则：1.按照说明书使用：不同药品有不同的使用方式和用量，应仔细阅读药品说明书并按照要求使用。
避免过量或不足的使用，影响药品的疗效。
2.注意保存条件：一些药品包装上标明了特定的保存条件，如存放于阴凉干燥处、避光等。
要严格按照要求保存药品，避免因保存条件不当而影响药品的质量和疗效。
3.避免交叉污染：不同药品之间可能存在交叉感染的风险，应注意避免药品包装的交叉污染。
在打开药品包装前，要清洁双手，并避免将不同药品包装放在一起，以免交叉感染。
三、合理处理药品包装垃圾在处理药品包装垃圾时，应采取以下措施，以保障环境卫生和公众健康：1.分类处理：将药品包装垃圾与其他生活垃圾进行分类处理，避免交叉感染和环境污染。
一般情况下，药品包装袋、盒、瓶等可回收垃圾的部分可以归类到可回收垃圾中，而药品包装盒上的塑料泡沫等不能回收的部分应归类到其他垃圾中。
2.正确封存：将药品包装垃圾封存在一个密封袋中，避免污染环境或他人接触。
可以选择使用专门的药品包装袋进行封存，或是使用有密封功能的塑料袋。
3.妥善丢弃：正确处理药品包装垃圾，将其投放到指定的垃圾桶中。
一些地区设有专门回收药品包装垃圾的回收点，可以将其投放到指定的回收容器中。
四、倡导环保用药在新冠肺炎疫情期间，倡导环保用药成为一种重要的健康理念。
环保用药不仅关乎个人健康，也直接影响到环境和公众的生活质量。
病毒包装相关知识汇总
病毒包装相关知识汇总应用领域随着分子生物学的理论及技术方法(特别是重组DNA技术)的迅速发展，人们可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因，使疾病深入至分子水平研究，于是诞生了基因诊断、基因治疗技术。
基因治疗从基因角度理解是对缺陷的基因进行修复增补，或将正常功能的基因置换的方法。
从治疗角度理解是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达从而达到治疗或预防疾病的目标的新措施。
当代基因治疗研究的热门方法是将外源DNA或RNA片段导入靶细胞或组织，研究靶基因的上调或抑制情况。
例如，有些异常基因(癌基因、病毒基因)，可通过技术引入外源片段将其抑制；有些基因本身有治疗作用，体外合成该基因导入体内使其表达丰度提高。
故选择合适高效的基因导入介质系统尤为关键。
而病毒载体已成为当前基因治疗载体研究的热点。
病毒载体的优势：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，感染效率高；2、病毒的宿主范围广，可以感染分裂细胞和非分裂细胞；3、病毒基因组的结构简单、分子背景比较清楚，稳定易于改造、易于制备；4、复杂的装配过程由细胞完成；5、不同的病毒载体具有不同的表达特点；6、通过载体改造的方式形成了复制缺陷型结构，安全性高；7、病毒包装技术经历了多年的研究，已趋于成熟，可用于产业化大量生产慢病毒包装技术背景：慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的病毒载体。
具有感染谱广泛、可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，成为导入外源基因的有力工具。
目前慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰等研究以及活体动物实验中。
技术原理：慢病毒载体系统包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，且能提供慢病毒所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
慢病毒包装步骤及经验总结
慢病毒包装步骤及经验总结慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它能够将靶基因导入到一些较难转染的细胞，如原代细胞等，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从而大大增加了转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若干代，可以进行稳转细胞株的筛选。
因为是随机整合，也有不确定因素，有些公司还能提供定点整合技术，将靶基因定点整合到基因组特定的部位，从而保证其高效表达并且对细胞不产生随机整合可能产生的伤害。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。
慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生RNAi干扰。
慢病毒包装系统由一个包装质粒混合物（Mix）和一个慢病毒载体质粒（LentiviralVector）组成，如下图（图片来自MIT）：载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件等。
不同系统包装质粒混合物也不一样，以本实验室的三质粒系统为例，包装质粒混合物中含pMDL，VSVG，pRSV-Rev，比例为5:3:2；其中pMDL含有编码HIV病毒主要结构蛋白的gag基因和编码病毒特异性酶的pol基因，pRSV-Rev含编码调节gag和pol基因表达的调节因子rev基因，VSVG含有提供病毒包装所需要的单纯疱疹病毒来源的VSVG基因。
以下介绍用293T细胞在六孔板（35mm）中包装病毒，其他孔板相应增加或减少体积。
准备试剂篇核心质粒；指数生长的293T细胞；? 病毒包装质粒Mix:1 μg/μl （Mix=pMDL: VSV-G : REV=5:3:2），不同载体系统所用的包装病毒质粒也不一样，此系统可用于包装PBOBi，PLKO， Plv等载体质粒。
【干货】慢病毒包装原理及注意事项
【干货】慢病毒包装原理及注意事项慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1（人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
和一般的逆转录病毒载体不同，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
并且它可以有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，因此具有广阔的应用前景。
目前慢病毒被广泛地应用于RNAi 的研究中。
由于体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达 siRNA的载体, 然后转入细胞内转录 siRNA的策略，不但对基因表达抑制效果不逊色于体外合成siRNA，而且稳定整合表达载体的细胞中，可以发挥长期阻断基因表达的作用。
但上述两种方法，一是受到转染试剂转染效率的影响，在一些细胞内无法有效敲低（Knockdown）一些基因；二是传统方法得到稳定细胞株通常需要挑取单克隆，进行克隆化，这样费时费力。
利用慢病毒介导的方法可以解决上述问题，这是因为慢病毒介导的RNAi具有下述优点：● 慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，不存在某些细胞难以转染的问题。
● 慢病毒可以在细胞基因组上稳定整合表达siRNA的元件，siRNA 表达效率比较均一，因此，无需挑取单克隆。
● 慢病毒载体具有嘌罗霉素（Puromycin）抗性基因，Puromycin 可以在 2-3天内杀死细胞，只有整合了病毒载体的细胞能够存活，这样缩短了得到稳定细胞株的时间。
慢病毒表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为 RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当 RNA聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成 1~4个 U。
U6 和 H1RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21nt RNA和～50nt RNA茎环结构（stem loop）。
病毒包装经验总结（病毒包装注意点）
病毒包装经验总结（病毒包装注意点）病毒包装需要注意什么--病毒包装经验总结在做病毒包装实验中，有科研工作者常遇到：用同样一个病毒载体系统进行病毒包装实验，为什么有人做的很好，次次成功，有人却是时常做不出来，稳定性很差，不是滴度低就是根本不出毒? 当然你也可以找公司例如汉恒生物，进行病毒包装。
从我们对不同载体系统病毒包装的多年经验总结，主要以下几个方面心得：第一，病毒包装的几个关键节点就是细胞因素、载体系统(尽量使用成熟的商业化载体系统)、构建重组的质粒正确与否、质粒抽提纯化情况、包装转染控制(24、48 小时的细胞及荧光状态判断)、目的基因对病毒包装影响(基因大小、序列情况、蛋白功能毒性等都会影响到是否能包装成功)。
第二，如果有细胞培养和细胞转染实验的常规经验，细胞因素应该没有什么问题(细胞培养人员一定要关注，包装或转染感染前一定要重视细胞干净细微污染与否、饱满立体感是否好、铺板均匀细胞密度适中否)，细胞产毒出毒期间过程中的活力是包装正常和出来的病毒滴度高低的一个重要环节(正常包装出病毒情况，慢病毒、逆转录病毒包装一个细胞出一个病毒颗粒，腺病毒是1000 个，腺相关病毒是10000 个)，所以实践操作表明，病毒包装转染时细胞的密度要控制，使得收毒(72 小时)时细胞密度在90%-95%左右。
第三，建议使用商品化的成熟毒载体系统(不要用来路不清或基本被淘汰很少人在使用的系统)，从文献和我们多年的实践可以结论，这类系统是稳定的，因而分析原因时尽量少花精力在对载体系统的验证上，这样会白花力气。
第四，至于包装转染时的操作控制细节及其转染试剂因素，只要在操作时按相关使用说明和操作步骤，应该没有大问题，所以也不要白花太多精力在这上面。
第五，另一个需要重点关注和排查的因素就是目的基因的表达载体构建和抽提纯化环节，是否构建时导致质粒载体重组或某个部件缺失，或污染别的质粒或杂物?中抽纯化是否污染?是否抽提的是别的质粒?要养成同时做阴性对照的习惯(是否目的基因载体和阴性对照GFP 载体是同一批，建议同一批，建议每次包装都如此操作)，如果这个环节没有啥问题，在构建中出现重组和缺失、或抽提纯化失败的可能性也不大。
AAV病毒包装实验常见问题的解答
AAV病毒包装实验常见问题的解答腺相关病毒载体介导的感染效率⽐真核表达质粒的要⾼，且⽬的基因表达稳定，⽬前已经被⼴泛应⽤于体外细胞和体内动物实验中⽬的基因的功能研究、模型建⽴和临床试验等。
越来越多实验室的课题都要⽤到AAV病毒包装，不过在实验的过程中会出现很多问题，⽐如载体构建、质粒抽提纯化异常、病毒滴度过低甚⾄出不了毒等等情况。
今天来聊聊这⽅⾯的问题，看看病毒包装⾼质量的交付受到哪些因素影响，怎样能做得更好。
Q1：腺相关病毒是什么？和实验室⽤的A A V载体的区别在哪⾥？答：腺相关病毒，即Adeno-Associated Virus (AAV), 是⾃然界中存在的天然病毒，基因组上有rep基因和cap基因，因此也叫野⽣型腺相关病毒（图⼀），即wide type AAV(wtAAV)；实验室⽤的AAV载体，是在腺相关病毒的基础上经过⼈⼯改造的质粒，基因组上没有rep基因，因此也叫重组腺相关病毒，即recombinant AAV（rAAV）。
没有特别指出的时基因，和cap基因候，简称AAV⼀般是指已经改造过的AAV载体。
图⼀（来源：参考⽂献1）Q2：腺相关病毒有哪些特点，A A V适合做哪些下游实验？答：腺相关病毒是⼀种⼩型⽆包膜病毒，属于细⼩病毒科，包含⼀个单链线性DNA基因组，长度约为4.7kb，其⾐壳蛋⽩由VP1、VP2和VP3三种蛋⽩构成，在1965年从腺病毒分离株的污染物中⾸次被发现。
Q3.腺相关病毒进⼊宿主细胞之后，其基因组会整合到宿主细胞基因组中吗？答：野⽣型腺相关病毒wtAAV感染⼈体细胞后，由于其rep基因、ITR序列结构和宿主基因组的相互作⽤，可能倾向整合到19号染⾊体短臂上的AAVS1位点，在⼩⿏中是倾向整合到ROSA26基因位点；⽽改造过的重组型腺相关病毒rAAV，由于基因组上已经去除了rep和cap基因，因此失去了整合到宿主基因组的特性。
rAAV在体内组织，特别是在肌⾁组织中，在宿主基因组染⾊体以外以附加⼦（episome）的双链DNA形式存在，持续稳定表达⽬的基因。
慢病毒包装步骤及注意事项
慢病毒包装步骤及注意事项现今常用的制备慢病毒载体的方法为使用3或者4质粒系统转染293T细胞。
此外，也有使用其它几类慢病毒包装细胞系制备慢病毒载体。
瞬时转染制备慢病毒：细胞：慢病毒包装常用人胚肾细胞(HEK, human embryonic kidney)293T，其含有SV40病毒的大T抗原蛋白编码基因，转染效率极高。
但其贴壁性不好，所以需要使用多聚赖氨酸包被的培养皿增加其吸附性。
多聚赖氨酸培养皿可购买，也可自行制备。
转染前，细胞密度控制在40-70%比较好。
DNA：每10 cm培养皿约含5x106 293T细胞，需用30-40 ug 不含内毒素的质粒进行转染。
质粒的纯度对慢病毒载体的包装效率非常关键。
不同的包膜蛋白表达载体，其使用量也不同。
转染：最经济的转染方法是磷酸钙转染法，虽然其溶液配置影响因素多，不易稳定重复得到最佳的转染结果。
其它方法有脂质体法和PEI法。
转染48-60后可以收集上清，通过低速离心，然后滤膜过滤可以去除上清中的细胞碎片。
如果使用VSV-G包膜蛋白的话，可以通过两次超速离心进行浓缩，从而最高可以获得滴度高达1011-1012IU/ml的慢病毒载体。
之后可以将病毒载体溶解在PBS，HBSS或者DMEM中，并置于-800C储存。
储存溶液添加血清会帮助提高病毒冻融时的存活率，然而有些病毒在侵染细胞时，血清会有干扰，所以需要依据具体病毒种类考虑是否添加血清。
病毒滴度：含VSV-G的慢病毒载体，其滴度在浓缩前一般为107IU/ml，浓缩之后可以达到109-107IU/ml 。
含有荧光标记或者其它报告基因的病毒载体，可以通过梯度稀释侵染HeLa或者293，NIH3T3细胞来确定其滴度;不含报告基因的可通过测定病毒颗粒中相关病毒蛋白的活性或者含量来确定其滴度，比如使用p24gag的elisa 试剂盒。
一般来说，每4-60 x 103个病毒载体含1ng p24gag。
然而这种方法测出来的滴度并不准确，不同的病毒载体类型，不同的储存方式，都会导致p24gag和病毒载体颗粒的比值变化较大。
腺病毒包装手册
重组腺病毒构建及包装操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒）附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较附4：实验室病毒操作应急预案腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
4)接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5)如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。
6)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。
7)实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃。
注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。
2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出进行冰浴融解，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳)。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
慢病毒包装知识大全
在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。
以慢病毒为例。
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
一、慢病毒载体构建原理：慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
腺病毒包装注意事项.
在293细胞中大量扩增腺病毒一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在293 细胞中进行大量扩增。
本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法，按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011～3×1012。
由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000～10000，因此1L 培养细胞可得到约5×1012病毒颗粒。
如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化，则必须至少3×108的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。
对于蛋白表达，则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提(根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)。
为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。
如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。
注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。
每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。
操作步骤：1 在100mm 培养皿或75cm2培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106293 细胞。
2 取0.5ul 首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释得到的MOI 值约为5。
3 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3 次，37℃CO2 孵箱中培养90 分钟。
4 加入9ml DMEM5%。
5 再培养72 小时，这时在10ml 溶液中大约有5×109～5×1010个病毒颗粒，进行MOI 测定以估计病毒颗粒。
注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。
收集细胞，600×g 离心 5 分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积(一般为原始体积的1/10 即1ml)病毒保存溶液重悬细胞。
-200C /370C 冻融3 次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。
22-2017软文 病毒包装的操作及相关问题解答
病毒包装的操作及相关问题解答一、操作安全性（1）可在生物安全柜、常规超净工作台（不开启排风机）中进行慢病毒使用操作；（2）操作者须穿着实验服，戴口罩、一次性手套，谨防毒液直接接触眼耳鼻口或皮肤伤口；（3）操作过程注意避免毒液飞散、滴洒，注意勿被锐利器材、针头等划破皮肤；（4）不慎直接接触毒液的操作台、需回收器材，可通过0.25% SDS、70%乙醇、1%次氯酸钠等溶液灭活病毒；（5）使用过的工作台面、显微镜载物台等经70%乙醇擦拭；（6）培养器皿、枪头等废弃物应84消毒液(1:9稀释)浸泡，或121℃高温消毒，方可丢弃。
二、慢病毒的保存（1）慢病毒载体经过干冰运输，在-80℃可保存6个月，保存超过6个月时需重新摸索工作滴度。
（2）冻存的毒液在使用前置于冰上或4℃融化，最好于当天用完，未用完的毒液可暂时保存于4℃，不超过2天。
（3）反复冻融会严重降低慢病毒滴度，每次冻融可降低20%以上，建议在初次使用时按用量进一步小量分装冻存。
慢病毒包装三、慢病毒包装常见问题及预防1、不宜使用polybrene的常见细胞系Polybrene可以通过中和细胞表面糖蛋白唾液酸残基所带电荷起到增加慢病毒感染效率的作用。
但对一些细胞具有明显细胞毒性，若使用反而影响实验效果。
这些细胞有例如：HSC-T6（大鼠肝星型细胞），Raw264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞），MCF-7（人乳腺癌细胞），H929（人多发性骨髓瘤细胞），GBC-SD（人胆囊癌细胞株），NB4（人白血病细胞株），kasumi （人白血病细胞株），Jurkat（人白血病细胞株），等。
建议在开始实验前查阅相应文献报道，以及参考的polybrene工作浓度。
2、过表达不成功的可能原因（1）质粒构建有一定的问题。
（2）由于序列具有特殊结构导致转录困难、mRNA十分不稳定等情况下，可导致mRNA水平无法显著过表达。
在排除质粒构建问题之后，先通过q-PCR验证目的基因在mRNA水平的过表达，可以同时使用293T等易表达细胞作为对照。
慢病毒包装的方法、步骤详细教程分享
慢病毒包装的⽅法、步骤详细教程分享本⽂梳理了慢病毒包装的全部流程，并结合具体实例介绍了慢病毒包装的⽅法、步骤，并对包装过程中的关键点进⾏了细致的分析。
使初学者也能握毫⽆障碍地⾃主完成病毒包装、纯化、滴度测定等实验。
以293T细胞为例：慢病毒感染293T细胞 - 合肥知恩⽣物慢病毒感染293T细胞1.293T细胞分盘转染前⼀天，将已经长好的细胞以合适的⽐例传代到10cm培养⽫中，当细胞长到80%时准备转染，步骤如下：1）弃去培养液，加⼊5 mL 灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞⽣长⾯，然后弃去 PBS 溶液。
2）⽤2 mL 胰蛋⽩酶消化对数⽣长期的293T细胞。
3）以含10%⾎清的培养基调整细胞密度为5 ×106个/10 mL，重新接种于10cm细胞培养⽫中，37 ℃，5% CO2 培养箱继续培养，转染前细胞密度80%左右。
注意：293T细胞的状态⾮常重要，⼀般建议购买新的细胞株后分批多次冻存，以保证每次包装病毒时细胞的代数不会超过10代。
同时尽量不要使⽤国产⾎清。
复苏后的细胞需要传2代后才能进⾏病毒的包装，并且传达后18-24h 需要密度达到80%左右。
2.转染前换液转染前1~2h 将需要转染的细胞换新鲜的培养基，8mL/10cm⽫。
注意：293T细胞贴壁性不是很好，换液时应⼩⼼滴加尽量避免冲起细胞。
3.转染（1）以⼀个10cm平⽫为例，取2个EP管，分别加⼊500 µl⽣理盐⽔，标记为A、B；（2）A管加⼊60µg PEI，并充分涡旋混匀，B管加⼊过表达质粒和两个辅助质粒pSPAX2、pMD2.G，三质粒⽐例为4：3：1，共24µg；（3）将A管PEI加⼊到B管中,轻轻混匀，静置20min；将混合液加⼊细胞中，过夜培养。
注意：质粒提取的质量，包括浓度和纯度。
浓度⾄少要超过500ng/ul，因为浓度低，加⼊的体积就会相应增⼤，会增加细胞污染的风险。
纯度可以使⽤核酸测定仪进⾏检测，260/280在1.8-2.0之间。
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病毒包装需要注意什么--病毒包装经验总结
在做病毒包装实验中，有科研工作者常遇到：用同样一个病毒载体系统进行病毒包装实验，为什么有人做的很好，次次成功，有人却是时常做不出来，稳定性很差，不是滴度低就是根本不出毒? 当然你也可以找公司例如汉恒生物，进行病毒包装。
从我们对不同载体系统病毒包装的多年经验总结，主要以下几个方面心得：
第一，病毒包装的几个关键节点就是细胞因素、载体系统(尽量使用成熟的商业化载体系统)、构建重组的质粒正确与否、质粒抽提纯化情况、包装转染控制(24、48 小时的细胞及荧光状态判断)、目的基因对病毒包装影响(基因大小、序列情况、蛋白功能毒性等都会影响到是否能包装成功)。
第二，如果有细胞培养和细胞转染实验的常规经验，细胞因素应该没有什么问题(细胞培养人员一定要关注，包装或转染感染前一定要重视细胞干净细微污染与否、饱满立体感是否好、铺板均匀细胞密度适中否)，细胞产毒出毒期间过程中的活力是包装正常和出来的病毒滴度高低的一个重要环节(正常包装出病毒情况，慢病毒、逆转录病毒包装一个细胞出一个病毒颗粒，腺病毒是1000 个，腺相关病毒是10000 个)，所以实践操作表明，病毒包装转染时细胞的密度要控制，使得收毒(72 小时)时细胞密度在90%-95%左右。
第三，建议使用商品化的成熟毒载体系统(不要用来路不清或基本被淘汰很少人在使用的系统)，从文献和我们多年的实践可以结论，这类系统是稳定的，因而分析原因时尽量少花精力在对载体系统的验证上，这样会白花力气。
第四，至于包装转染时的操作控制细节及其转染试剂因素，只要在操作时按相关使用说明和操作步骤，应该没有大问题，所以也不要白花太多精力在这上面。
第五，另一个需要重点关注和排查的因素就是目的基因的表达载体构建和抽提纯化环节，是否构建时导致质粒载体重组或某个部件缺失，或污染别的质粒或杂物?中抽纯化是否污染?是否抽提的是别的质粒?要养成同时做阴性对照的习惯(是否目的基因载体和阴性对照GFP 载体是同一批，建议同一批，建议每次包装都如此操作)，如果这个环节没有啥问题，在构建中出现重组和缺失、或抽提纯化失败的可能性也不大。
第六，落实了上面那些因素，那就是最后一个原因。
目的基因的大小、序列情况、该目的蛋白的功能毒性等导致无法包装成功(实践中，这种情况是有的，我们偶尔会遇到，可能原因是一些基因表达翻译后对包装细胞产生毒性，导致细胞状态异常)，那么我们能做的就是换病毒包装载体系统，尝试其他载体系统能否包装出来。
不过这种情况出现的几率非常低，你做上100 个基因，也可能碰不上一个。
因而总的来说，我们进行病毒包装实验时要重视包装材料——细胞及表达质粒(对拿过来的细胞和载体系统要验证，常出现包装细胞、空表达载体质粒就有问题，我们要定期纯化生产包装细胞、空表达载体质粒)，细胞培养时让它“白白胖胖、活力充沛”，目的基因的表达载体构建纯化良好，质粒间比例得当，病毒包装实验还是能有较好的结果。