生物学]蛋白质层析技术共56页

蛋白质纯化与层析技术

蛋白质纯化与层析技术蛋白质纯化是生物化学和生物技术领域中至关重要的过程，用于从混合物中分离和纯化目标蛋白质。

层析技术作为蛋白质纯化的关键步骤之一，它不仅可以选择性地将目标蛋白质从混合物中分离出来，还可以去除杂质，获得高纯度的蛋白质样品。

一、蛋白质纯化的基本原理蛋白质纯化的基本原理是根据不同的理化性质，如分子量、极性、电荷等特征，选择合适的纯化方法分离目标蛋白质。

常见的蛋白质纯化方法包括离心、超滤、电泳、沉淀和层析等。

离心法是通过调整离心速度和时间，根据不同蛋白质的分子量和密度差异，将目标蛋白质和非目标蛋白质分层离心，进而实现纯化。

超滤法则是利用滤膜对溶液进行筛选分离，减少蛋白质和其他分子之间的尺寸和质量差异，从而实现蛋白质的纯化。

电泳法是根据蛋白质在电场中不同的电荷和分子量特性，使其在凝胶上移动的速度不同，从而实现纯化和分离。

沉淀法则是通过添加适当的沉淀剂，使蛋白质凝聚成颗粒，经过离心后分离出来。

而层析法是根据蛋白质与层析介质之间的相互作用，通过选择性吸附和洗脱，将目标蛋白质从混合物中纯化出来。

二、层析技术的分类与原理层析技术是在纯化过程中广泛使用的方法，根据不同的工作原理和介质特性，可以将其分为几种不同的类型。

常见的层析技术包括吸附层析、凝胶层析、亲和层析和离子交换层析等。

吸附层析是通过目标蛋白质与特定层析介质之间的亲和力，使目标蛋白质被吸附在介质上，从而实现纯化。

凝胶层析则是利用介质中多孔性凝胶矩阵的分子筛效应，根据蛋白质的分子量和形状特征，通过不同的渗透效应将目标蛋白质分离出来。

亲和层析是利用目标蛋白质与特定配体（如抗体）之间的特异性结合，使目标蛋白质选择性地与介质上的配体结合，从而实现纯化。

离子交换层析则是基于蛋白质表面的电荷特性，通过电荷间的相互作用，使目标蛋白质与介质表面的离子互相吸附和洗脱，实现纯化。

三、层析技术的操作步骤和优化层析技术的操作步骤通常包括前处理、样品加载、洗脱和再生等步骤。

蛋白质层析技术

蛋白质互作分析
利用蛋白质层析技术分析蛋白质之间的相互作用，揭示生命活动的分子机制。
蛋白质复合物分离
通过蛋白质层析技术分离蛋白质复合物，研究其结构和功能，有助于深入了解细胞内复杂的生物过程。
药物靶点筛选
在药物研发过程中，蛋白质层析技术用于筛选药物作用的靶点，为新药研发提供有力支持。
THANKS FOR WATCHING
荧光法需要使用荧光标记物，操作相对复杂，成本较高。
免疫学检测法
免疫学检测法利用抗原-抗体反应的特异性，通过抗体对目标蛋白质进行识别和检测。常用的免疫学检测法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹和免疫沉淀等。
免疫学检测法具有高灵敏度、高特异性的优点，适用于蛋白质的定性分析和定量分析。但该方法需要制备特异性抗体，操作相对复杂，成本较高。
蛋白质层析技术的分类
根据固定相的不同
可分为凝胶电泳、滤纸电泳、薄层电泳等。
根据分离机制
可分为等电点沉淀法、离子交换法、亲和层析法等。
蛋白质层析技术的应用
01
蛋白质组学研究
用于分离和纯化蛋白质，为蛋白质组学研究提供基础。
临床诊断
用于检测和分离疾病相关蛋白质，辅助疾病诊断和治疗。
03
02
生物药物研发
疾病标志物检测
肿瘤标志物检测
蛋白质层析技术用于检测肿瘤标志物，辅助肿瘤的诊断和预后评估。
感染性疾病标志物检测
通过蛋白质层析技术检测感染性疾病标志物，有助于快速诊断和指导治疗。
代谢性疾病标志物检测
蛋白质层析技术在代谢性疾病标志物检测中也有广泛应用，如糖尿病、肥胖症等疾病的标志物检测。
蛋白质相互作用研究
缺点

蛋白质分离技术全ppt课件

第十节
蛋白质的分离与纯化
一、引言
二、蛋白质（酶）分离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
1
一、引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是非常重要的生物大分子。蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉淀。
26
Salting-in
Salting-out
溶解度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质（亲水胶体）
脱水
水化膜碱
酸
等点电时的蛋白质（亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质（亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。

第三章蛋白质的分离纯化-层析技术

第五节层析技术简介蛋白质分离纯化中的层析技术是基本工具⏹层析（chromatography）是最有效的分离手段，也是最重要的蛋白质纯化工具。

层析主要是物理方法，是混合熵减少的过程，必然消耗自由能。

⏹基因工程下游的核心是层析。

⏹层析技术的理论与实践已高度发展和完善。

层析的概念在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中，使样品中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。

根据移动相种类的不同，分为液体层析、气体层析二种。

层析的类型◆分配层析：固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。

◆吸附层系：利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附的能力的差别即吸附系数的差别而实现分离。

如亲和、疏水、金属螯合、离子交换等相关杂质◆目标产物相关杂质：聚集体（抗体）、片段◆过程相关杂质和污染物：宿主细胞蛋白：免疫测定宿主细胞DNA：DNA杂交、QPCR、DNA结合预知分析、荧光测定-picogneen细胞培养基蛋白质：病毒：QPCR、电子显微镜、体内体外分析（逆转录酶）微生物：生菌数实验、内毒素实验◆其他种类杂质或污染物：层析柱、容器的沥出物；可抽提物；细胞培养基组分；纯化中使用的试剂；蛋白质层析介质基体须具备的特性◆生物兼容性：亲水性，大孔径不会使生物大分子失活，没有生物化学毒性--过强吸附，泄漏.◆化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件下是稳定的。

pH,络合物,氧化还原性,巯基化合物……◆必要的机械性能: 流体中的耐压性，弹性化学组成: 亲水多孔高聚物等◆天然高分子多糖:纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖及其共聚物----孔径分布宽、较软◆合成高聚物:聚丙烯酰胺类、聚丙烯酸脂类、聚乙二醇聚、丙烯酸脂共聚物、亲水性处理的聚苯乙烯类（都是交联大孔高聚物）◆无机化合物: 硅胶、羟基磷灰石、氧化锆聚合物基体(matrix)孔的结构◆多孔结构：内表面占整个表面积的95% 以上◆孔径分布: 分配层析要求分布宽、均匀，相应于低交联度◆高交联度导致孔径分布偏向高，介质本身微观不均匀性变大，适合大孔径高硬度吸附层析孔的结构可分为三种类型标志产品:◆SepharoseHP,ToyopearlSepharoseHP,Toyopearl;MacroPrep,UNOSphere,FractogelEMD,SourceMacroPrep,Source ◆UNOQUNOQ，POROSBeads 结构：典型层析介质的放大观察Confocal Microscopy ImagesMonolith 结构示意图方案的特点◆捕获（Capture）：离子交换、疏水、金属螯合、亲和、分配层析◆中间纯化：离子交换、疏水、金属螯合、亲和、分配层析◆精制：离子交换、疏水、金属螯合、亲和、分配层析◆样品中的污染物：核酸、胆固醇、甘油三脂、磷脂、脂肪酸、小分子络合物、金属离子◆层析步骤间的过渡方式：如离子交换接疏水动物组织中蛋白质的例子◆组织匀浆1:4（w/v）◆匀浆后蛋白浓度：5mg/ml （如植物要低）◆目标蛋白浓度：0.001mg/mlE.Coli表达例子◆E.Coli表达蛋白：10菌体/1培养基◆抽提蛋白中目标蛋白为10%◆1:4（w/v）抽提蛋白为30mg/ml◆产量为150mg/ml◆目标蛋白浓度：3mg/ml细胞培养上清的例子◆蛋白质浓度（含血清培养基）：4mg/ml ◆IgG总浓度：0.8mg/ml◆目标IgG浓度：0.03mg/ml电泳分析的样品制备原则◆电泳检测贯穿整个纯化过程◆上样缓冲液对蛋白质的溶解性要高于抽提液，否则拖尾。

蛋白质层析法

蛋白质层析法是一种用于分离和纯化蛋白质的技术，它基于蛋白质在不同条件下在固定相和流动相中的分配系数不同来实现分离。

层析技术的基本原理是将混合物中的各组分根据其物理或化学性质（如分子大小、电荷、亲和性等）在不同相中的不同分布和迁移速率来实现分离。

以下是一些常见的蛋白质层析技术：
1. **凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography）**：
- 也称为分子筛层析，利用凝胶的多孔结构将分子按大小分离。

小分子可以进入凝胶内部的孔隙，而大分子则被排阻在外部，因此迁移速度不同。

2. **离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）**：
- 根据蛋白质的电荷性质（如阴离子或阳离子交换树脂）来分离蛋白质。

带正电的蛋白质可以与阴离子交换树脂结合，而带负电的蛋白质则与阳离子交换树脂结合。

3. **亲和层析（Affinity Chromatography）**：
- 利用蛋白质与特定配体（如金属离子、生物大分子等）的特定相互作用来分离蛋白质。

4. **反相层析（Reverse Phase Chromatography）**：
- 基于蛋白质在不同极性溶剂中的不同保留行为来实现分离。

通常使用非极性固定相（如C-18柱）和极性流动相。

5. **尺寸排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC）**：
- 也称为凝胶渗透层析，分离蛋白质混合物中的不同分子量蛋白质。

6. **疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）**：
- 利用蛋白质与固定相之间的疏水作用来分离蛋白质。

蛋白质分离技术-层析

阴离子交换基
强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨氨乙基纤维素
基质
电荷基团反离子商品名
纤维素 —O—CH2——COO- ·Na+
N 纤维素-O-（CH2）2- +H（C2H5）2 ·Cl-
CM-纤维素 DEAE-纤维素
聚苯乙烯—————SO3-· Na+
聚苯乙烯——N+（CH2）4 ·Cl-
732阳离子树脂
止大分子物与配基结合载体的空间障碍
载体影响了配基的空间，特别是小分子配基。需加碳氢链 “手臂”，长度需适中。
二、亲和层析分离过程
1、装柱和平衡 2、上样、亲和吸附 3、洗脱
无效洗脱
吸附效率不高
有效吸附
影响吸附的因素 1、缓冲液离子成份强度、pH、温度等都有影响。 2、流速尽可能慢，<10ml/cm2.小时 3、上柱样品用平衡层析柱缓冲液溶解，浓度约20mg蛋白/ml. 4、上样体积取决于亲和力，低则上样量减少，一般柱床体积的5％。
操作过程： 1.装柱； 2.离子交换； 3.洗脱
三、离子交换剂与缓冲液的选择
（一）离子交换剂的选择
必须考虑的影响因素 1．阴、阳离子交换剂的选择 2．强、弱离子交换剂的选择 3．不同离子型交换剂的选择 4．不同基质离子交换剂的选择
阴、阳离子交换剂的选择
测定pI 确定稳定pH范围
碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素c 酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、HCG
b．较强时：梯度洗脱，连续改变缓冲液浓度，使洗脱能力逐渐加强
c、非常强时：强的酸、碱或加入脲、胍等变性剂使蛋白质变性，而从配体上解离出来。然后再通过适当的方法使待分离物质恢复活性。
（2）特异性洗脱法：一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱：

《蛋白质聚焦层析》课件

蛋白质聚焦层析的步骤
1
样品准备
将待测蛋白质样品进行准备，包括去除杂质和调节pH。
2
层析介质制备
准备好具有一定pH梯度的层析介质，以便蛋白质的分离。
3
层析操作
将样品加入层析柱，通过施加电场，使蛋白质在介质中移动，实现分离。
实验条件和要点
样品pH值调节
选择合适的缓冲液和调节剂，确保样品在所需pH范围内。
电场设置
根据样品特性和目标分离效果，合理设置层析过程中的电场强度。
层析介质选择
根据样品特性和分离目的，选择适合的层析介质。
结果分析
对层析结果进行分析和解读，评估分离效果和样品纯度。
结果与讨论
通过蛋白质聚焦层析，我们成功实现了对待测样品中不同pH值蛋白质的高效分离和富集。分析结果表明，该技术具有良好的分离效果和重复性，可广泛应用于蛋白质组学研究和生物药物开发。
《蛋白质聚焦层析》PPT 课件
欢迎各位参加今天的分享会！在本次课件中，我们将聚焦介绍蛋白质聚焦层析技术，探讨其原理、步骤、实验条件和要点，以及应用领域和结论。
技术背景
蛋白质聚焦层析是一种高效分离和富集蛋白质的技术，通过利用蛋白质在不同pH值下的电荷差异，实现精质聚焦层析的原理基于蛋白质在不同pH环境下的电荷变化，从而使蛋白质在层析介质中产生电荷迁移，达到精确的分离效果。
应用领域
蛋白质聚焦层析技术在生物医药、食品安全、环境监测等领域具有广泛的应用前景和潜力。它可用于富集和分离特定蛋白质，从而为后续分析和研究提供有力支持。
结论
蛋白质聚焦层析作为一种高效的分离技术，能够实现对样品中不同pH值蛋白质的精确分离和富集。它在蛋白质组学研究、生物药物开发等领域具有重要的应用价值。

《生物学层析法》课件

实际应用案例
食物颜料分离
层析法可用于鉴定和分离食物中的色素。
药物分析
层析法可以分离和测定药物中的不同成分。
环境分析
层析法可用于环境样品中污染物的分离和检测。
优势和局限性
1 优势
简单易操作，分离效果好，广泛应用度较慢，分离效率受到样品性质和实验条件的限制。
常见错误和注意事项
《生物学层析法》PPT课件
层析法是一种在生物学研究中常用的分离和分析技术。本课件将介绍层析法的概念与原理，基本步骤，不同类型的层析法，实际应用案例，优势和局限性，常见错误和注意事项，最后进行总结。
概念与原理
层析法是一种分离和分析技术，通过不同物质在固定相和流动相中的分配系数差异，实现混合物的分离。
基本步骤
1
样品加载
将待分离的混合物加载到层析柱或层析纸上。
2
流动相流动
通过柱床或层析纸，使流动相在不同组分间逐渐分离。
3
收集分离物
按照需要，逐段收集分离得到的组分。
不同类型的层析法
薄层层析法
将样品涂抹在薄层介质上进行分离。
柱层析法
通过柱床进行样品的分离。
气相层析法
通过气相站和液相站将混合物分离。
错误
1. 选择错误的固定相和流动相。 2. 加载样品过多或过少。 3. 不仔细观察分离结果。
注意事项
• 准备好合适的实验器材。 • 注意实验室安全。 • 根据需要进行进一步分析和确认。
总结与结束语
层析法是一种重要的生物学实验技术，通过分离混合物的不同成分，为生物学研究提供了有力工具。掌握层析法的原理和操作技巧，将可以更好地实施生物学实验和开展科学研究。

蛋白质常规层析技术

结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识
别。常用的生物亲和关系有酶-底物、抗体-抗原、外源凝集
素-糖蛋白等。
Affinity.swf
填料选择：重点：选择合适的配基应用：
离子交换层析
原理：
以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离。通过静电相互作用而使带正电荷的样品结合到阳离子交换介质上，而带负电荷的介质则可结合到阴离子交换介质上，再采用改变盐浓度或者缓冲液的pH值的方法进行洗脱。
1.层析的原理
层析技术是一组相关分离方法的总称。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。
疏水层析
原理：
根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。
Hydrophobic Interaction.swf
除多聚体或降解产物，根据分子量不同常选择Superdex 200 或其他介质，其最大上样量仅为2%。超过上样量会降低分辨率，导致目的蛋白和聚体等不能彻底分开。

填料选择：

重点：选择分离范围精度：分子量差别一倍以上类型：Sephadex、Superdex、Sephacryl、Sepharose、 Superose 介质优点缺点

蛋白质层析技术.

化流程 ➢ 流程优化 ➢ 放大 ➢ Polishing(精细纯化)
精品PPT
样品(yàngpǐn)制备
➢ 一般性处理 ➢ 去处颗粒物——5 µm、2 µm、0.45
µm分级过滤，0.2 µm除菌 ➢ 蛋白样品的富集和浓缩 ➢ 脱气 ➢ 纯化过程(guòchéng)中样品处理 ➢ 脱盐和缓冲液交换 ➢ 去污剂的去除 ➢ 离子污染物的去除 ➢ 其它的处理和浓缩
➢对层析仪有与小分子(fēnzǐ)物质液相层析不同的要求
➢液相层析仪已是非常成熟的设备
精品PPT
液相层析仪的基本(jīběn)结构
精品PPT
输液泵——注射(zhùshè)泵
精品PPT
输液泵——恒压泵
精品PPT
输液泵——双柱塞泵
精品PPT
不同泵的输液(shūyè)特性
➢ 单柱塞泵
➢
输液脉冲
Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)
Thiol Groups (cys)
Covalent Chromatography
精品PPT
蛋白质层析介质基体须具备(jùbèi)的特性
生物兼容性：亲水性，大孔径.不会使生物大分子失活，没有生物化学毒性：过强吸附，泄漏，氧化还原性
➢ 动态载量是制备层析介质的重要性能指标，更快更高是人类活动(huó dòng)的重要目标
精品PPT
层析介质颗粒(kēlì)度与动态载量
➢ 小颗粒传质更迅速，动态载量更高
➢ IgG1在不同颗粒度的BioRad陶瓷(táocí)性羟基磷灰石上的动态载量比较
➢ Buffer-0.05M MES,pH6.5; ➢ Flow rate: 600cm/hr

实验一凝胶过滤层析分离蛋白质PPT课件

7
（1）层析系统的基本组成
固定相 + 流动相
固体物质 / 固定于固体物质的成分
可以流动的物质：如水和各种溶媒
8
待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相
由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同
与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时受到的阻滞作用小，移动速度快
23
3. 凝胶装柱
①柱固定于架子上，垂直放置，关住出口 ②自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使G-50 开始下沉，
至1 ~2cm时，打开出口 ③凝胶逐层上升，至顶部 2-3cm时，关闭出口
24
注意点：
垂直放置防止气泡产生防止柱的分层
25
4. 平衡
放置一段时间，约40分钟（使凝胶更好的压实）
14
15
（2）凝胶的特点
属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要
有机溶剂，对于高分胶
16
（3）凝胶的选择多孔网孔结构
A. 葡聚糖凝胶 (商品名: Sephadex， Dextran) 型号: G-10 – G-200
CuSO4 碱性
肽键
紫红色
29
四、实验结果
绘制洗脱结果示意图，并分析所得结果
五、讨论
下次实验：
《碱性磷酸酶的提取及其比活性的测定》时间：4月18日上午9：00开始
30
2019/12/14
.
31
适用：
杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析
13
3. 凝胶过滤层析法（gel filtration chromatography）（1）原理：