植物染色体显带技术

细胞遗传学实验

实验一植物染色体去壁、低渗、火焰干燥制片技术

一、实验原理：

用此法可以显著提高染色体的分散程度和平衡性，可以减少染色体的变形、断裂等现象，也可以减轻细胞质对染色体的覆盖。使染色体各组成部分—长臂、短臂、着丝粒、随体、染色单体等都显示得比较清楚，有利于染色体测量和显带的分析。此法也很简单，首先用酶解法去除植物细胞壁，再利用热胀冷缩的原理，将植物细胞在冰片上用火焰烧烤，用力甩片能使细胞膜破裂，不需要特殊设备，同时也省去了繁杂的压片手续，显著提高了制片的效率。

二、实验目的：

学习植物染色体标本制备去臂、低渗法的技术，为染色体显带实验提供了优良的标本。

三、实验步骤：

1材料的制备：

黑麦根尖(2n=14)

根尖材料的制备：

1. 发根：将材料放入具有团粒结构条件的土壤中培养（锯木屑、土壤、砾石、麦杆、谷草)；最适温度(23~32℃)；培养24h 再放入0~4℃冰处理1~7天。目的:(1)使分裂速度减慢，根尖长度整齐一致；(2)调节工作时间。再将材料从冰箱中取出又放回最适温度条件下培养1~2天；待根尖长度为1.5~2cm即可处理。

2 预处理：化学和物理两种

(1) 化学方法：(适合所有生物)

a. 秋水仙素0.05~0.2﹪(白色粉末，易溶于水的巨毒药品)；

b. 0.002M 8-羟基喹啉(淡黄色晶体，用少量的乙醇溶解再稀释，对禾本科植物的随体

很清楚)；

C.а-溴萘饱和液(淡黄色的乳浊液，易溶于乙醇和苯；难溶于水，100ml水中倒入1~2

滴剧烈的振动5分钟)；

（以上abc三种药剂在15~18℃温度下处理3~5h）

d. 对二氯苯饱和液(淡黄色的晶体，难溶于水；具有强烈的腐蚀性，只能处理1~1.5h)。

(2) 物理方法：(适合禾本科作物，本次实验所采用)

冰水混合物在0~4℃温度下处理24h。

预处理的目的破坏或抑制纺锤体形成；增加中期图象，改变细胞质的粘度，使染色体缩短变粗，易于染色体的显带及研究。

3 固定：

卡诺氏Ⅰ 3︰1 (乙醇︰醋酸);

固定的目的利用药剂迅速杀死正在分裂的细胞，使之保持细胞中的染色体处于被固定前的原有状态。

4 保存：

冲洗置换，从95﹪~70﹪的乙醇梯度置换；每次置换需停留20~30min,目的是将固定液中的醋酸从材料中置换掉，最后将材料保存在70﹪的乙醇中备用。

5 解离：将根放在0.2MHCI中，在25℃下浸泡1h。作用：以软化细胞壁，去除细胞壁之间的果胶质。

解离的目的使胞间层的果胶类物质解体，利于细胞分散，有助于压片；同时解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。

6前低渗：用自来水冲洗材料，再用25℃的蒸馏水浸泡0.5h。作用：可置换出细胞内的HCI，使细胞充分吸水。染色体在细胞内处于游离状态，在制片时便于染色体分散。

7 酶解去壁：倒掉蒸馏水，加入2％的纤维素酶与2％果胶酶的混合液，在35-37℃下处理2h。作用：对细胞壁所含的纤维素、半纤维素和果胶质进行消化。

8 后低渗：用镊子夹住根部抖落分生区，将其它部分丢弃，收集分生区组织，转入指形管，沉淀10min后吸出酶液，加蒸馏水浸泡0.5h。作用：可置换出酶液。使细胞充分吸水膨胀，染色体游离在细胞质中，制片时便于染色体分散，是关键步骤。

9 固定：吸去蒸馏水，加3︰1的甲醇固定液，静置15min。作用：置换出细胞内的水分，便于燃烧。(甲醇固定液作用有：①具有一定的脆性，甩片时容易使细胞膜破裂。②能改善染色，有助于以后实验时的吉姆萨染色)。

10 制备悬浮液：吸去上清液，以1︰10的比例加入新鲜的固定液(即一份细胞，10份固定液)，用吸管不停的吸放以捣碎组织，制成均匀的细胞悬液。

11 标本片制备：将冷冻的载玻片斜放30-45°角，点上酒精灯，吸2-3滴细胞悬液在该片上，加热烧烤，此时用力甩片，制作10张标本片。

实验二植物染色体Giemsa—C带技术

一、实验原理：

染色体显带技术是借助于特殊的处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数目、部位、宽窄与浓淡具有相对的稳定性。从而在以往染色体形态特征（长度、着丝粒位置、臂比、随体等）以外又增添了一类新的标志。染色体分带技术能有效地鉴别染色体，研究染色体的结构与功能。C一带是植物吉姆萨分带的一种类型，是染色体经过C 一带程序处理，使染色体着丝粒两侧出现带纹，故名C一带。

二、实验目的：

掌握植物染色体吉姆萨分带技术和方法。

三、实验步骤：

1、制片：选取前两次实验(压片法、去壁低渗法)制备的片子各10张。

2、干燥：两种方法⑴自然干燥松树、洋葱15天，(不超过3过月)；禾本科作物2—15天。⑵无水乙醇干燥只需要1—12小时即可。(目的：①染色体具有后熟的作用；②去除染色体上的蛋白质；③使材料凝固在片子上)。本实验采用自然干燥方法。

3、酸处理：两种方法⑴用45%醋酸在室温下处理1—1.5 h；⑵用0.2MHCl，在25℃下处理1—1.5 h；（处理完毕用，用30℃的蒸馏水过一次）作用：①去除制片上的杂质和染色体上的蛋白质；②破坏细胞质；③使第一次染色褪色。④与染色体上的DNA或某些碱基结合，使染色体上不同程度碱基脱落，有助于程度不同的显带。应选用⑵种方法。(酸处理是变性的过程。应注意控制时间，如果处理恰倒好处感觉染色体饱满，带纹丰富；如果处理不够，染色体上的色差不明显，观察不到带纹；如果处理过度，染色体很薄，带纹也不丰富)。

4、碱处理：两种方法⑴强碱NaOH、KOH；室温处理，不得超过20秒；(大约15秒) ⑵弱碱 Ba(OH)

2

饱和溶液，在25℃下处理15min。碱处理也是使染色体变性的过程，作用是与

染色体上的DNA碱基结合，消化DNA。处理完毕不能直接倒去碱液，以防止Ba(OH)

2

与空气

中CO

2

结合生成的碳酸钡薄膜覆盖在制片材料的表面，影响后续工作的正常进行，所以必须用流动的自来水冲洗，以去除表面的薄膜以及水中的沉淀物,冲洗完毕用30℃蒸馏水漂洗浸泡几分钟，置换出碱液。

5、盐处理：用2×SSC盐溶液(0.3MNaCl+0.03MNaC

6H

5

O

7

2H

2

O)，在60℃下处理1.5h。盐处

理是使染色体复性的过程，作用(1)调节PH值；(2)修饰DNA上的碱性基团和酸性基团。

1.5h后倒去盐溶液，加入30℃蒸馏水浸泡5分钟，置换出盐溶液。

6、染色：取吉姆萨母液(1％浓度)10-15ml,用磷酸缓冲液(PH6.8-7.2)稀释至1000ml（比