分子生物学技术PPT课件
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分子生物学实验技术ppt课件
质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建
分子生物学技术ppt课件
• 核酸研究中的应用十分广泛。
探针技术
• 探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的 序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此 可用于检测核酸样品中的基因。
• 标记物：同位素、生物素或荧光染 Nhomakorabea • 核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、
cDNA、RNA • 探针种类：DNA、RNA
印迹技术(Blotting): 将在凝胶中分离的 生物大分子转移(印迹)在固相化介质上 并加以检测分析的技术。
(1) DNA 印迹: Southern blotting (2) RNA 印迹: Northern blotting (3) 蛋白质印迹: Western blotting
印迹技术基本原理
凝胶电泳
转移
杂交
放射自显影 或化学显色
Southern blotting（DNA印迹技术）
组织或细胞中基因组DNA经限制性内切酶消 化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝 胶放入变性溶液变性后，使胶中的DNA分子转移 到NC膜上。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜 上，用于杂交反应可进行DNA印渍。
三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作 为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次） 后即可达到扩增DNA片段的目的。
PCR的主要用途
目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法
基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因 的嵌合、缺失、点突变等改造。
DNA和RNA的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR 的检测需要。
DNA序列分析 基因突变分析
PCR衍生技术
反转录PCR技术
mRNA反转录生成cDNA, cDNA 为模板PCR扩增
探针技术
• 探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的 序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此 可用于检测核酸样品中的基因。
• 标记物：同位素、生物素或荧光染 Nhomakorabea • 核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、
cDNA、RNA • 探针种类：DNA、RNA
印迹技术(Blotting): 将在凝胶中分离的 生物大分子转移(印迹)在固相化介质上 并加以检测分析的技术。
(1) DNA 印迹: Southern blotting (2) RNA 印迹: Northern blotting (3) 蛋白质印迹: Western blotting
印迹技术基本原理
凝胶电泳
转移
杂交
放射自显影 或化学显色
Southern blotting（DNA印迹技术）
组织或细胞中基因组DNA经限制性内切酶消 化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝 胶放入变性溶液变性后，使胶中的DNA分子转移 到NC膜上。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜 上，用于杂交反应可进行DNA印渍。
三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作 为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次） 后即可达到扩增DNA片段的目的。
PCR的主要用途
目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法
基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因 的嵌合、缺失、点突变等改造。
DNA和RNA的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR 的检测需要。
DNA序列分析 基因突变分析
PCR衍生技术
反转录PCR技术
mRNA反转录生成cDNA, cDNA 为模板PCR扩增
医学分子生物学ppt完整版
2024/1/30
切除修复
对于较复杂的DNA损伤 ，如嘧啶二聚体或DNA 链断裂，通过切除损伤 部位并合成新的DNA片 段进行修复。
重组修复
在DNA双链断裂等严重 损伤情况下，通过DNA 重组机制进行修复，涉 及同源序列的搜索和交 换。
13
DNA重组的方式与意义
同源重组
发生在同源序列之间的重组，通过交 换DNA片段实现遗传信息的重新组合
6
02
基因与基因组
2024/1/30
7
基因的概念与结构
01 基因的定义
基因是遗传信息的基本单位，控制生物性状的遗 传。
02 基因的结构
基因由编码区和非编码区组成，编码区包括外显 子和内含子。
03 基因的遗传效应
基因通过控制蛋白质的合成来控制生物的性状。
2024/1/30
8
基因组的组成与特点
01 基因组的定义
基因表达的调控方式
基因表达受到多种因素的调控，包括 转录因子、表观遗传学修饰、 microRNA等。
2024/1/30
10
03
DNA复制、修复与重组
2024/1/30
11
DNA复制的过程与特点
1
DNA复制的过程
起始、延伸和终止三个阶段，涉及多种酶和蛋白 质的参与，确保DNA的准确复制。
2 3
DNA复制的特点
结合分子生物学指标，对 药物疗效进行评估，为新 药研发和临床应用提供依 据。
29
分子生物学技术在个体化医疗中的应用
基因检测
通过基因检测分析个体基 因组信息，为个体化医疗 提供基础数据。
2024/1/30
个体化用药指导
根据基因检测结果和药物 代谢特点，为患者提供个 体化用药建议，提高药物 治疗效果。
切除修复
对于较复杂的DNA损伤 ，如嘧啶二聚体或DNA 链断裂，通过切除损伤 部位并合成新的DNA片 段进行修复。
重组修复
在DNA双链断裂等严重 损伤情况下，通过DNA 重组机制进行修复，涉 及同源序列的搜索和交 换。
13
DNA重组的方式与意义
同源重组
发生在同源序列之间的重组，通过交 换DNA片段实现遗传信息的重新组合
6
02
基因与基因组
2024/1/30
7
基因的概念与结构
01 基因的定义
基因是遗传信息的基本单位，控制生物性状的遗 传。
02 基因的结构
基因由编码区和非编码区组成，编码区包括外显 子和内含子。
03 基因的遗传效应
基因通过控制蛋白质的合成来控制生物的性状。
2024/1/30
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基因组的组成与特点
01 基因组的定义
基因表达的调控方式
基因表达受到多种因素的调控，包括 转录因子、表观遗传学修饰、 microRNA等。
2024/1/30
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03
DNA复制、修复与重组
2024/1/30
11
DNA复制的过程与特点
1
DNA复制的过程
起始、延伸和终止三个阶段，涉及多种酶和蛋白 质的参与，确保DNA的准确复制。
2 3
DNA复制的特点
结合分子生物学指标，对 药物疗效进行评估，为新 药研发和临床应用提供依 据。
29
分子生物学技术在个体化医疗中的应用
基因检测
通过基因检测分析个体基 因组信息，为个体化医疗 提供基础数据。
2024/1/30
个体化用药指导
根据基因检测结果和药物 代谢特点，为患者提供个 体化用药建议，提高药物 治疗效果。
分子生物学课件ppt
转基因技术
转基因技术是将外源基因导入生物体，实现基因的过 表达或补充。转基因技术的关键在于选择合适的载体 和导入方法。
THANKS
感谢观看
基因编辑技术的应用
基因编辑技术在许多领域都有广泛的应用，如罕见病治疗、癌症免疫治疗、农业育种等。 通过基因编辑技术，可以实现对特定基因的敲除、敲入或修饰，以达到治疗或改良的目的 。
基因编辑技术的伦理问题
虽然基因编辑技术具有巨大的潜力，但也引发了伦理和法律等方面的争议。在应用基因编 辑技术时，需要充分考虑伦理和法律问题，确保技术的合理应用和规范发展。
发展趋势
基因组学、蛋白质组学、代谢组学等 多组学研究，跨学科交叉融合，生物 信息学和计算生物学的发展等。
02
分生物学基本概念
基因与DNA
基因
基因是生物体内携带遗传信息的最小 单位，负责编码蛋白质或RNA分子 。
DNA
DNA是生物体的主要遗传物质，由四 种不同的脱氧核苷酸组成，通过特定 的序列排列储存遗传信息。
高通量测序
高通量测序是指一次可以对大量DNA或RNA分子进行序列测定的技术。高通量测序技术极大地提高了 基因组学和转录组学研究的效率，为生物医学研究提供了强大的工具。
04
分子生物学应用
生物医药研究
01
02
03
药物设计与开发
利用分子生物学技术，研 究药物与靶点的相互作用 ，提高药物的疗效和降低 副作用。
分子生物学前沿研究
表观遗传学研究
01
表观遗传学研究
表观遗传学是研究基因表达的调控机制，通过研究DNA甲基化、组蛋
白修饰等机制，揭示基因表达的调控规律，以及环境因素对基因表达的
影响。
02
分子生物学(共19张PPT)
04
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成与结构
氨基酸通过肽键连 接形成多肽链，即 蛋白质的一级结构 。
多条多肽链组合在 一起，形成蛋白质 的三级结构。
蛋白质的基本组成 单位是氨基酸，共 有20种常见氨基酸 。
多肽链经过盘绕、 折叠形成二级结构 ，主要形式包括α螺旋和β-折叠等。
在特定条件下，蛋 白质可形成四级结 构，由多个亚基组 成。
发展历程
从20世纪50年代DNA双螺旋结构 的发现开始，分子生物学经历了 飞速的发展，成为现代生命科学 中最为活跃和前沿的领域之一。
分子生物学的研究对象与任务
研究对象
主要包括DNA、RNA、蛋白质Байду номын сангаас生 物大分子，以及它们之间的相互作用 和调控机制。
研究任务
揭示生物大分子的结构、功能及其相 互作用机制；阐明基因表达调控的分 子机制；探索生物大分子在生命过程 中的作用和意义。
转录因子
01
真核生物中存在大量转录因子，它们与DNA特定序列结合，激
活或抑制基因转录。
表观遗传学调控
02
通过DNA甲基化、组蛋白修饰等方式，改变染色质结构，影响
基因表达。
microRNA调控
03
microRNA是一类小分子RNA，通过与mRNA结合，抑制其翻
译或促进其降解，从而调节基因表达。
基因表达调控的分子机制
发育生物学研究生物体的发育过程，而分子 生物学则揭示了发育过程中基因表达和调控 的分子机制。
02
DNA的结构与功能
DNA的分子组成与结构
DNA的基本组成单位
脱氧核糖核苷酸，由磷酸、脱氧核糖 和碱基组成。
DNA的碱基
DNA的双螺旋结构
分子生物学ppt课件
基因组大小(Mb)
0.58 1.83 4.20 4.60 13.50 12.50 466 165 97 2700 3000
基因数
470 1743 4100 4288 6034 4929 30000 13601 18424 30000 25000
染色体数*
无 无 无 无 16 16 21 4 6 20 23
包括：
结构基因组学
功能基因组学
三个亚领域.
比较基因组学
28
29
一、病毒基因组 二、原核生物基因组 三、真核生物基因组
30
一、病毒基因组
基因组（genome） 1个配（精子或卵子），1个单倍 体细胞或1个病毒所包含的全套遗传物质的总和。病毒核酸 或为DNA或为RNA，可以统称为病毒染色体。
完整的病毒颗粒具有蛋白质外壳，以保护病毒核酸不 受核酸酶的破坏，并能识别和侵袭特定的宿主。
分子生物学
Molecular Biology
1
What is Molecular Biology?
分子生物学是从分子水平研究生命现象、生命规律和生命本质 的学科。
核心内容是从分子水平研究基因和基因的活动，这些活动主要 通过核酸和蛋白质的活动来实现。
医学分子生物学主要研究人体生物大分子和大分子体系的结构、 功能、相互作用及其与疾病发生、发展的关系。
16
三、基因的结构特点和分类
基因的结构
结构基因：编码区序列（coding region sequence ）
在细胞内表达为蛋白质或功能RNA的DNA序列
转录调控序列：非编码序列（non-coding sequence）
基因表达需要的调控区（regulatory region）序列， 包括启动子（promoter）、增强子（enhancer）等。
分子生物学课件(共51张PPT)
二级结构
蛋白质局部主链的空间结构， 包括α-螺旋、β-折叠等。
三级结构
整条肽链中全部氨基酸残基的 相对空间位置Байду номын сангаас即整条肽链每 一原子的相对空间位置。
四级结构
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等 。 酶：催化生物体内的化学反应。
分子生物学是生物学的重要分支
01
分子生物学以生物大分子为研究对象，揭示生命现象的分子基
础，是生物学的重要分支之一。
分子生物学推动生物学的发展
02
分子生物学的发展推动了生物学的研究从细胞水平向分子水平
深入，为生物学的发展提供了新的理论和技术支持。
分子生物学与其他学科的交叉融合
03
分子生物学与遗传学、生物化学、微生物学、免疫学等学科存
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
05
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
肽键
连接氨基酸之间的主要化学键。
辅基与辅酶
某些蛋白质还包含辅基或辅酶， 以辅助其功能的发挥。
蛋白质的结构层次
一级结构
指蛋白质中氨基酸的排列顺序 。
重组DNA分子的构建和 筛选
PCR技术及其应用
01
02
PCR技术的基本原理和步骤
引物的设计和选择
03
04
PCR反应体系和条件优化
PCR技术在DNA扩增、突变 分析、基因分型等领域的应用
基因克隆与基因工程
蛋白质局部主链的空间结构， 包括α-螺旋、β-折叠等。
三级结构
整条肽链中全部氨基酸残基的 相对空间位置Байду номын сангаас即整条肽链每 一原子的相对空间位置。
四级结构
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等 。 酶：催化生物体内的化学反应。
分子生物学是生物学的重要分支
01
分子生物学以生物大分子为研究对象，揭示生命现象的分子基
础，是生物学的重要分支之一。
分子生物学推动生物学的发展
02
分子生物学的发展推动了生物学的研究从细胞水平向分子水平
深入，为生物学的发展提供了新的理论和技术支持。
分子生物学与其他学科的交叉融合
03
分子生物学与遗传学、生物化学、微生物学、免疫学等学科存
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
05
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
肽键
连接氨基酸之间的主要化学键。
辅基与辅酶
某些蛋白质还包含辅基或辅酶， 以辅助其功能的发挥。
蛋白质的结构层次
一级结构
指蛋白质中氨基酸的排列顺序 。
重组DNA分子的构建和 筛选
PCR技术及其应用
01
02
PCR技术的基本原理和步骤
引物的设计和选择
03
04
PCR反应体系和条件优化
PCR技术在DNA扩增、突变 分析、基因分型等领域的应用
基因克隆与基因工程
《分子生物学全套》ppt课件
分子生物学定义
分子生物学是一门从子水平研究生 物大分子的结构和功能的科学，主要 关注DNA、RNA和蛋白质等生物大 分子的复制、转录、翻译和调控等过 程。
分子生物学特点
以分子为研究对象，阐明生命现象的 本质；与多学科交叉融合，推动生命 科学的发展；实验技术手段不断更新 ，提高研究效率和准确性。
分子生物学发展历程
分子生物学研究内容及方法
研究内容
包括基因和基因组的结构与功能、DNA损伤与修复、基因表达的调控、蛋白质 组学的研究以及疾病产生的分子基础等。
研究方法
包括基因克隆与表达、蛋白质分离与纯化、PCR技术、基因敲除与敲入、高通 量测序技术、生物信息学分析等。这些方法的应用使得分子生物学研究更加深 入和广泛。
阔前景。
下一代测序技术在分子生物学中应用
下一代测序技术原理
基于大规模并行测序的原理，一次可对数百万至数十亿个DNA分 子进行测序。
测序数据分析
包括序列比对、变异检测、基因表达量分析等，以揭示基因组的结 构和功能。
下一代测序技术的应用
在疾病诊断、个性化医疗、物种鉴定和进化生物学等领域发挥重要 作用。
非编码RNA与疾病关系
非编码RNA异常表达与多种疾病相关，如肿瘤、心血管疾 病等，可作为疾病诊断和治疗的新靶点。
非编码RNA研究前景
随着高通量测序技术和生物信息学发展，非编码RNA研究 将更加深入，为疾病防治提供新思路和新方法。
合成生物学在分子生物学中应用前景
合成生物学概念及研究范畴
合成生物学是一门新兴交叉学科，旨在通过设计和构造新的生物部件、系统和机器来理解 和操控自然生物系统。
RNA产物。
影响因素
包括DNA模板的序列和 结构、RNA聚合酶的活 性和选择性、转录因子
分子生物学是一门从子水平研究生 物大分子的结构和功能的科学，主要 关注DNA、RNA和蛋白质等生物大 分子的复制、转录、翻译和调控等过 程。
分子生物学特点
以分子为研究对象，阐明生命现象的 本质；与多学科交叉融合，推动生命 科学的发展；实验技术手段不断更新 ，提高研究效率和准确性。
分子生物学发展历程
分子生物学研究内容及方法
研究内容
包括基因和基因组的结构与功能、DNA损伤与修复、基因表达的调控、蛋白质 组学的研究以及疾病产生的分子基础等。
研究方法
包括基因克隆与表达、蛋白质分离与纯化、PCR技术、基因敲除与敲入、高通 量测序技术、生物信息学分析等。这些方法的应用使得分子生物学研究更加深 入和广泛。
阔前景。
下一代测序技术在分子生物学中应用
下一代测序技术原理
基于大规模并行测序的原理，一次可对数百万至数十亿个DNA分 子进行测序。
测序数据分析
包括序列比对、变异检测、基因表达量分析等，以揭示基因组的结 构和功能。
下一代测序技术的应用
在疾病诊断、个性化医疗、物种鉴定和进化生物学等领域发挥重要 作用。
非编码RNA与疾病关系
非编码RNA异常表达与多种疾病相关，如肿瘤、心血管疾 病等，可作为疾病诊断和治疗的新靶点。
非编码RNA研究前景
随着高通量测序技术和生物信息学发展，非编码RNA研究 将更加深入，为疾病防治提供新思路和新方法。
合成生物学在分子生物学中应用前景
合成生物学概念及研究范畴
合成生物学是一门新兴交叉学科，旨在通过设计和构造新的生物部件、系统和机器来理解 和操控自然生物系统。
RNA产物。
影响因素
包括DNA模板的序列和 结构、RNA聚合酶的活 性和选择性、转录因子
《分子生物学技术》课件
基因克隆和序列分析
获取目标蛋白质的基因序列， 进行必要的克隆操作和序列分 析。
表达和纯化
将改造后的基因导入表达系统 ，表达并纯化目标蛋白质。
确定目标蛋白质
根据实际需求，选择需要改造 的蛋白质。
基因突变和改造
根据需要，对基因进行突变和 改造，以改变蛋白质的结构和 功能。
性能评估
对改造后的蛋白质进行性能评 估，包括结构和功能分析。
CHAPTER 03
蛋白质工程技术
蛋白质工程技术的定义与原理
蛋白质工程技术的定义
蛋白质工程技术是通过基因工程技术 对蛋白质进行改造，以达到改善或优 化蛋白质的特性和功能的一种技术手 段。
蛋白质工程技术的原理
基于基因工程技术，通过改变蛋白质 编码基因的序列，实现蛋白质结构和 功能的优化。
蛋白质工程技术的操作步骤
《分子生物学技术》 ppt课件
contents
目录
• 分子生物学技术概述 • 基因工程技术 • 蛋白质工程技术 • 基因组学技术 • 生物信息学技术
CHAPTER 01
分子生物学技术概述
定义与分类
定义
分子生物学技术是以分子为研究 基础，通过分析分子的结构、功 能和相互作用的科学方法。
分类
分子生物学技术包括基因工程技 术、蛋白质工程技术、基因组学 技术和生物信息学技术等。
详细描述：基因工程技术是一种利用重组DNA技术对生物体的遗传物质进行操作 的方法。其原理基于分子遗传学和生物化学的基本原理，通过人工设计和构建基 因表达载体，将外源基因导入受体细胞，实现基因的转移、表达和调控。
基因工程技术的操作步骤
总结词：全面解析
详细描述：基因工程技术主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的表达与检 测等步骤。其中，基因表达载体的构建是整个技术的核心环节，涉及到限制性内切酶、DNA连接酶等工具酶的应用。
获取目标蛋白质的基因序列， 进行必要的克隆操作和序列分 析。
表达和纯化
将改造后的基因导入表达系统 ，表达并纯化目标蛋白质。
确定目标蛋白质
根据实际需求，选择需要改造 的蛋白质。
基因突变和改造
根据需要，对基因进行突变和 改造，以改变蛋白质的结构和 功能。
性能评估
对改造后的蛋白质进行性能评 估，包括结构和功能分析。
CHAPTER 03
蛋白质工程技术
蛋白质工程技术的定义与原理
蛋白质工程技术的定义
蛋白质工程技术是通过基因工程技术 对蛋白质进行改造，以达到改善或优 化蛋白质的特性和功能的一种技术手 段。
蛋白质工程技术的原理
基于基因工程技术，通过改变蛋白质 编码基因的序列，实现蛋白质结构和 功能的优化。
蛋白质工程技术的操作步骤
《分子生物学技术》 ppt课件
contents
目录
• 分子生物学技术概述 • 基因工程技术 • 蛋白质工程技术 • 基因组学技术 • 生物信息学技术
CHAPTER 01
分子生物学技术概述
定义与分类
定义
分子生物学技术是以分子为研究 基础，通过分析分子的结构、功 能和相互作用的科学方法。
分类
分子生物学技术包括基因工程技 术、蛋白质工程技术、基因组学 技术和生物信息学技术等。
详细描述：基因工程技术是一种利用重组DNA技术对生物体的遗传物质进行操作 的方法。其原理基于分子遗传学和生物化学的基本原理，通过人工设计和构建基 因表达载体，将外源基因导入受体细胞，实现基因的转移、表达和调控。
基因工程技术的操作步骤
总结词：全面解析
详细描述：基因工程技术主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的表达与检 测等步骤。其中，基因表达载体的构建是整个技术的核心环节，涉及到限制性内切酶、DNA连接酶等工具酶的应用。
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• 模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可 以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以 是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).
• 就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯 度.
• 引物： PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。与模板 DNA特异互补的单链寡聚核苷酸片段，一般18-30bp, 上下游引物
解链; • (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度
(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配 • (3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA
的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.
• 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循 环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环 就可使DNA扩增达数百倍。
✓ 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使 非特异性增高。
• 引物: oligo dT, random primer等。 • RNA酶抑制剂 • 底物：等浓度的四种dNTP • 反应环境: 缓冲液（RT buffer）
逆转录酶
定义： 是RNA指导的DNA聚合酶。
具有三种酶活性： RNA指导的DNA聚合酶 DNA指导的DNA聚合酶 RNase H的活性
可单独购买或逆转录试剂盒
逆转录反应（cDNA合成）
• 逆转录（reverse transcription）： 是 指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成 DNA的过程。
R 模 板 NA
DNA-杂 R化 N双 A 链
单 链 DNA
逆转录反应体系的基本成分
• 模板: 组织或培养细胞总RNA。
• 逆转录酶：AMV: 禽类成髓细胞性白血病病毒 M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒
• 弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入 75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
• 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不 要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于 水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行 mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
R 模 板 NA
DNA-杂 R化 N 双 A 链
单 链 DNA
Байду номын сангаас
引物
• Oligo dT ：适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA 、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT 要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即 使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
PCR反应体系的基本成分
• 模板: cDNA • 引物:与模板DNA特异互补的单链寡聚核苷
酸片段，一般18-30bp, 上下游引物 • DNA聚合酶: 如Taq酶 • 底物: 等浓度的四种核苷酸（dNTP） • 反应环境: 含有Mg2＋的Tris-Cl缓冲液。
含DNA聚合酶的2×反应混合物
PCR反应体系的基本成分
避免RNA酶污染
• 由于RNA分子容易受RNA酶的攻击反应而降解,加 上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中 要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这 是本实验成败的关键。
• 在cDNA生成之前，也就是RNA提取和逆转录过 程中都要避免RNA酶污染。
• DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性 基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。实验用 品用0.1%DEPC水处理，高压蒸汽灭菌后烤干备用 或购买经过处理的无RNA酶实验用品。
常用实验基本技术
四大常用基本技术
• 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） • 免疫组织化学技术（免疫组化） • 免疫印迹技术（Western blot）
• 细胞培养技术
常用分子生物学技术
• RNA的提取和cDNA合成 • 聚合酶链式反应(PCR)扩增和产物克隆 • 重组质粒的连接、转化及筛选 • 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 • 测序技术 • DNA酶切及凝胶电泳
逆转录酶
• 在逆转录酶的作用下，总RNA中的mRNA在体外被反向转 录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模 板mRNA，称之为互补DNA（cDNA）；
• 利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核 苷三磷酸（dNTP）为材料，在引物的引导下复制出大量 的cDNA或目的片段
步骤
• 以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积 不能超过所用Trizol体积的10%。
• 研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的 比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
• 取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙 醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10 分钟。
• 操作过程中带手套、口罩。
PCR
• 聚合酶链式反应(PCR)扩增：指数扩增是一 种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的 RNA。
• 一种选择性体外扩增DNA的方法. • 一种将微量的目的DNA片段在体外快速、
大量扩增的技术。 • 半保留复制
• 三个基本步骤: • (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下
局限性 联合应用
RNA制备
• Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织 或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol 法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直 接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+ 分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
• RNA提取试剂盒：国产、进口 常用总RNA提取试剂盒 尽量选用含DNA酶的试剂盒
• 随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA 、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模 板的RT-PCR反应。
• 基因特异性引物： 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已 知的情况。
cDNA合成最常用的引物是与真核细胞 mRNA分子3'端poly(A)结合的12-18核苷酸 长的oligo(dT)。
• 就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯 度.
• 引物： PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。与模板 DNA特异互补的单链寡聚核苷酸片段，一般18-30bp, 上下游引物
解链; • (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度
(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配 • (3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA
的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.
• 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循 环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环 就可使DNA扩增达数百倍。
✓ 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使 非特异性增高。
• 引物: oligo dT, random primer等。 • RNA酶抑制剂 • 底物：等浓度的四种dNTP • 反应环境: 缓冲液（RT buffer）
逆转录酶
定义： 是RNA指导的DNA聚合酶。
具有三种酶活性： RNA指导的DNA聚合酶 DNA指导的DNA聚合酶 RNase H的活性
可单独购买或逆转录试剂盒
逆转录反应（cDNA合成）
• 逆转录（reverse transcription）： 是 指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成 DNA的过程。
R 模 板 NA
DNA-杂 R化 N双 A 链
单 链 DNA
逆转录反应体系的基本成分
• 模板: 组织或培养细胞总RNA。
• 逆转录酶：AMV: 禽类成髓细胞性白血病病毒 M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒
• 弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入 75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
• 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不 要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于 水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行 mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
R 模 板 NA
DNA-杂 R化 N 双 A 链
单 链 DNA
Байду номын сангаас
引物
• Oligo dT ：适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA 、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT 要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即 使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
PCR反应体系的基本成分
• 模板: cDNA • 引物:与模板DNA特异互补的单链寡聚核苷
酸片段，一般18-30bp, 上下游引物 • DNA聚合酶: 如Taq酶 • 底物: 等浓度的四种核苷酸（dNTP） • 反应环境: 含有Mg2＋的Tris-Cl缓冲液。
含DNA聚合酶的2×反应混合物
PCR反应体系的基本成分
避免RNA酶污染
• 由于RNA分子容易受RNA酶的攻击反应而降解,加 上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中 要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这 是本实验成败的关键。
• 在cDNA生成之前，也就是RNA提取和逆转录过 程中都要避免RNA酶污染。
• DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性 基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。实验用 品用0.1%DEPC水处理，高压蒸汽灭菌后烤干备用 或购买经过处理的无RNA酶实验用品。
常用实验基本技术
四大常用基本技术
• 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） • 免疫组织化学技术（免疫组化） • 免疫印迹技术（Western blot）
• 细胞培养技术
常用分子生物学技术
• RNA的提取和cDNA合成 • 聚合酶链式反应(PCR)扩增和产物克隆 • 重组质粒的连接、转化及筛选 • 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 • 测序技术 • DNA酶切及凝胶电泳
逆转录酶
• 在逆转录酶的作用下，总RNA中的mRNA在体外被反向转 录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模 板mRNA，称之为互补DNA（cDNA）；
• 利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核 苷三磷酸（dNTP）为材料，在引物的引导下复制出大量 的cDNA或目的片段
步骤
• 以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积 不能超过所用Trizol体积的10%。
• 研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的 比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
• 取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙 醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10 分钟。
• 操作过程中带手套、口罩。
PCR
• 聚合酶链式反应(PCR)扩增：指数扩增是一 种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的 RNA。
• 一种选择性体外扩增DNA的方法. • 一种将微量的目的DNA片段在体外快速、
大量扩增的技术。 • 半保留复制
• 三个基本步骤: • (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下
局限性 联合应用
RNA制备
• Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织 或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol 法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直 接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+ 分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
• RNA提取试剂盒：国产、进口 常用总RNA提取试剂盒 尽量选用含DNA酶的试剂盒
• 随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA 、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模 板的RT-PCR反应。
• 基因特异性引物： 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已 知的情况。
cDNA合成最常用的引物是与真核细胞 mRNA分子3'端poly(A)结合的12-18核苷酸 长的oligo(dT)。