激光扫描共聚焦显微镜_LSCM_及其生物学应用

第8卷第4期激　光　生　物　学　报V o l.8　N o.4 1999年12月A CTA　LA SER　B I OLO GY　S I N I CA D ec.1999

激光扫描共聚焦显微镜(L SCM)

及其生物学应用

肖艳梅　付道林　李安生

(中国科学院遗传研究所,北京　100101)

摘　要　激光扫描共聚焦显微镜(L SC M)有效地排除了非焦平面信息,提高了分辨率及对比度,使图像更为精确清晰;与计算机及相应的软件技术组合,L SC M实现了连续光学切片,广泛应用于生物三维结构重组及动态分析。目前,激光共聚焦显微技术已成功应用于生物芯片技术、激光显微操作系统、细胞骨架研究、生理生化及胚胎学研究、基因定位等领域。多光子技术的发展,进一步改善了L SC M成像清晰度,拓宽了L SC M在生物学领域中的应用。本文叙述了L SC M的基本原理及其在生物学研究中的应用。

关键词　激光共聚焦显微镜(L SC M);光学切片;三维成像;多光子技术,应用

中图分类号　Q336

文献标识码　A

文章编号　1007-7146(1999)04-0305-07

La ser Scann i ng Confoca l M icroscope(L SC M)and Its Appl ica tion i n B iology

X IA O Y an m ei　FU D ao lin　L I A n sheng

(Institute of Genetics,Ch inese A cadem y of Sciences,Beijing　100101)

Abstract　L aser Scann ing Confocal M icro scop e(L SC M)excludes the ou t-of-focu s signals effectively and enhances its reso lu ti on and con trast and p rovides clearer i m b in ing w ith com p u ter and co rresponding softw are,L SC M realizes series op tical secti on ing and is app lied in3 di m en si onal recon structi on and dynam ic assay of b i o logical speci m en s w idely.A t p resen t,L SC M has been app lied successfu lly in Gene ch i p,laser m icro m an i p u lati on system,studies on cyto skeleton, p hysi o logy and b i ochem istry research,em b ryo logy research,gene locati on and o ther b i o logy fields. Ow ing to the p resen t of the m u lti p ho ton techn ique,h igher i m aging defin iti on and m o re ex ten sive app licati on cou ld be ach ieved.In th is review,w e exp lain the basic p rinci p le of the L aser Scann ing Confocal M icro scop e(L SC M)and discu ss its app licati on in b i o logy research.

Key words　L SC M;Op tical secti on;M u lti p ho ton techn ique;3D i m aging;A pp licati on

长期以来,普通光学显微镜对于我们理解生物结构,揭示生命现象发挥了很大作用。然而,受光波衍射效应的限制,普通光学显微镜的分辨率已接近理论极限。因此,人们考虑通过增加物象与背景的反差来改善成像质量,提高图像清晰度,间接提高显微镜成像分辨率。激光扫描共聚焦显微镜(L aser Scann ing Confocal M icro scop e, L SC M)的诞生,在一定程度上实现了这一目的。

激光扫描共聚焦显微镜是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的高科技产品,为现代分子生物学研究提供了有力的工具。早在1957年,M arvin M in sky就提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理。随后二十多年中,著名学者Egger、Petran、牛津和阿姆斯特丹等人就此项工作进行了积极的探索。1984年B i o R ad公司首次推出世界第一台商品化共聚焦显微镜。随后Zeiss、M eridian等多家公司相继开发出各种型号的共聚焦显微镜产品。目前,激光扫描共聚焦显微

收稿日期:1999-05-18

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激　光　生　物　学　报

第8卷

技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究,并能提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段,结合其它相关生物技术,在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用。

1　L SC M 的工作原理

激光扫描共聚焦显微镜是由普通荧光显微镜和共聚焦系统组成。扫描激光经过显微镜光学系

统聚焦到目标样品上,形成微米级光斑,该光斑正置显微镜物镜焦点所在,这也是激光共聚焦显微镜“共焦”的本质含义。激光扫描共聚焦显微镜利用生物体自身或体内特定的一些物质经过染料标记后被激光激发均可以发生出荧光,激发荧光通过显微镜的光学系统及有关光学元件,输送到光电倍增管,光学信号经进一步处理,转换成样品图象

。

F igu re 1　Configu rati on fo r a Confocal M icro scope .(A :Sandard Configu rati on fo r a Confocal M icro scope ;B :Infin ity Co rrected Configu rati on fo r a Confocal M icro scope ) 利用激光扫描样品时,如图所示(图11A 为有限距离光路;图11B 为平行光路),照明激光沿着理想的光学通路,经显微镜物镜聚焦到样品,形成衍射极限的共焦光斑。样品激发荧光沿着光学系统经过光通过分束器(beam sp litter ),光通过分束器具有特定的光学性质,可以把样品激发荧光同其它非信号光线分开,其中激发荧光由光电倍增管接受。在光电倍增管前有一针孔(p inho le )装置,针孔起到空间滤波器的作用,在于最大限度阻抑非聚焦平面散射光和削弱聚焦平面的杂散光(聚焦平面焦点斑以外的散射光),保证光电倍增管所到的荧光光学信号全部来源于样品光斑焦点位置,因此,样品上衍射聚焦光斑和检测针孔成像光斑包含同样信息,两焦点共扼,从而大大提高了系统信噪比和成像清晰度。对于观察相对较厚的样品,该种技术显得尤其重要。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强,而且非焦面光被针孔滤去,因此共焦系统的景深近似为零,沿Z 轴方向的扫描可以实现光学断层扫描,形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。聚焦平面的选择是通过计算机控制的步动电动机带动显微镜移动实现。典型的步动电动机可以小至011微米的步长移动样品。把X -Y (焦平面)平面扫描与Z 轴(光轴)扫描相结合,通过累加连续层次的二维图象,经过专门的计算机软件处理,可以获得样品的三维图像。

检测针孔对于共聚焦系统的性能起着重要的

作用。如图1所示只有样品中聚焦衍射光斑激发的荧光(连续直线所示)才能到达并聚焦于检测针孔,而偏离衍射光斑的荧光(如破折线所示)则不能聚焦于检测针孔而被阻挡在针孔之外。因此,针孔的这种只接受聚焦衍射光斑处荧光信息的能力赋予激光扫描共聚焦显微镜能够对样品内部深层次进行观察鉴定并可以完成光学切片,因此通过对连续层次上的共聚焦图像的计算机处理,我们可以实现真正的三维图像的重建。另外平行光路的共聚焦显微镜最大的特点是:其一,聚焦平面和检测针孔间的距离不固定,这样使得系统的设计具有更好的灵活性;其二,平行光束不受表面平整的光学元件增减的影响,而且聚焦光斑的球面畸变效应减少。

2　L SC M 在生物学研究中的应用

211　生物芯片技术的应用

生物芯片技术是随着人类基因组计划(H um an genom e p ro ject )的实施应运而生的。生物芯片又称DNA 芯片、DNA 微探针阵列、基因芯片等。该技术系指将大量探针分子固定于基片表面形成二维探针阵列进而与标记的样品分子杂交,通过检测各探针分子的杂交信号强度,获取待测样品所含的信息。生物芯片技术的诞生是探针固相原位合成术、照相平板印刷术以及激光扫描