细胞转染、药物筛选(试行)[2]

细胞转染、药物筛选（试行）

第一天细胞复苏

1、从液氮罐取出一管细胞)，迅速置于37℃水浴锅中溶化。

2、和9ml FBS-DMEM（双抗）一起转移到14-ml的离心管中。

3、离心1000rpm 5min，负压吸去上清。

4、用FBS-DMEM（双抗）重悬细胞，铺到6孔板上（2ml液体）。

12hr后若死细胞很多需换液

1、负压吸去培养基。

2、加入2ml新鲜的FBS-DMEM（双抗）。

第三天细胞传代

1、负压吸去培养基，加入2ml PBS，吸去PBS，加入0.5ml Trypsin。

2、室温放置约30秒，吸走胰酶。加入3毫升FBS-DMEM，吹打至单个细胞状态。

3、1：3传代，取2/3平分到2个6孔板的孔内。1孔转染，1孔支原体检测（不含抗性的培养基中连续传3代，最后一次传代后需不换液3天后取细胞做支原体检测）。

4、37度，5%CO2培养。

第五天细胞传代

1、负压吸去培养基，加入2ml PBS，吸去PBS，加入0.5ml Trypsin。

2、室温放置约30秒，吸走胰酶。加入2毫升FBS-DMEM，吹打至单个细胞状态。

3、细胞计数，传代。使细胞数达到6*105个/毫升，取2毫升/孔加到2个孔内。（与支原体检测孔分开操作）

4、37度，5%CO2培养。

第六天转染

1、观察细胞，若状态良好，且细胞密度达到70-80%可以进行细胞转染。

2、转染前2个小时细胞换上1毫升新鲜的FBS-DMEM（含血清，不含抗生素）。

3、2个小时后取0.1毫升DMEM（不含药物，不含血清）加入1.5毫升EP管中。

4、从-20度中取出DNA（1ug/ul），待全部溶解后将DNA混匀，取4 ug DNA加入到0.1毫升

DMEM中，混匀。

5、将已溶解的PEI（PEI一定要最后加入）吹打混匀，取12ul加入0.1毫升DMEM中，将

PEI、DNA、DMEM三者轻轻吹打混匀。室温放置15分钟。

6、将三者混合物分多点加入到2个小时前换液的细胞，成十字形摇晃培养基。

7、37度，5%CO2培养。

8、6小时后换上新鲜的FBS-DMEM（双抗）继续培养。

(若是双转浓度比例为DNA(1+2):PEI=1:3,即DNA1为2ug ，DNA2为2ug，PEI为12 ul)

第七天细胞传代

1、转染后24小时负压吸去培养基。

2、加入2ml PBS，吸去PBS，加入0.5ml Trypsin。

3、室温放置约30秒，吸走胰酶。加入2毫升FBS-DMEM（可以含抗生素），吹打至单个细胞

状态。

4、1：3传代到3个10cm培养皿。

5、37度，5%CO2培养。

第八天药物加压

1、转染后48小时负压吸去10cm 培养皿上清。

2、加入10 ml/10cm dish新鲜的FBS-DMEM（s/p）.

2、加入抗性筛选药(如加40 ul ZEO，使其终浓度为400 ug/ml)。

3、持续加压14天。

4、细胞加压后约第3天开始出现死亡细胞。第4、

5、6天细胞出现大量死亡，第七天后背

景比较干净，可看到一些克隆。克隆形态为松散、可分出细胞形态和紧凑、分辨不出细胞形态，呈扁平隆起状。

5、加压到第10天后挑克隆到96孔板内培养（含有加压的药物）。

6、待96孔板内细胞长满后1：3消化传代，其中1/3用作96孔板细胞功能检测，2/3用作

冻存细胞。

细胞铺板，功能检测

1、负压吸去96孔板内培养基。

2、加入200ul/孔 PBS，吸去PBS，加入20ul/孔 Trypsin。室温放置约30秒。

3、加入90ul/孔FBS-DMEM（不含有加压的药物），中止胰酶作用，吹打至单细胞。

4、96孔板每孔共取75 ul，按25 ul/孔将75 ul细胞平均分到3个384孔板的孔内，其中

3*2为转染细胞加配体检测孔，3*1为加DMSO阴性对照。剩余细胞在96孔板内继续培养（每孔内加170 ul FBS-DMEM（含有加压的药物））。

5、未转染的细胞取25 ul/孔（每孔20000个），按3*3加入384孔板内，其中3*2为未转

染细胞阴性对照，3*1为阳性对照。

7、铺板后第二天细胞密度达到90%以上进行功能检测。

8、若有阳性克隆，将96孔板相对应的克隆号的细胞继续培养。

9、待细胞长满后传代到24孔板。

10、24孔板细胞长满后，将细胞进行亚克隆，挑单克隆进行功能检测。

11、将阳性孔细胞传代到6孔板，其中取一部分细胞进行支原体检测。

12、6孔板长满后，细胞传代到10cm dish ，细胞需冻存5支。

示意图如下

注：试验中FBS-DMEM中所需的血清浓度，药物添加种类与数量由所用细胞及转染质粒抗性决定。

试剂配制：

0.05%胰酶

需0.25%胰酶100毫升

PBS或液体DMEM 400毫升

5倍稀释，4度储存分装备用。

G418

液体分装，1ml/管，-20度保存,初浓度为50mg/mL,使用浓度为250ug/ mL。

ZEO

液体分装，1ml/管，-20度保存,初浓度为100mg/mL,使用浓度为400ug/ mL。

FBS

GIBCO公司生产，4度融化，45ml/管分装，-20度保存。

质粒DNA

干粉DNA 50ug

ddH2O 50ul

震荡混匀，取2 ul验菌无误后使用，使用浓度为1 ug/ ul。

PEI

干粉0.1g

ddH2O 100 ml

过滤分装，-80度保存，使用浓度为1 ug/ ul。

Hygromycin B

液体分装，1ml/管，4度保存，储存浓度为50 mg/mL，使用浓度为400ug/ mL。

双抗（青链霉素）

ddH2O溶解固体粉末，过滤分装，-20度保存，储存浓度为10000U/ mL，使用浓度为100U/ mL。