噬菌体的分离与纯化
噬菌体分离纯化的原理和步骤
噬菌体分离纯化的原理和步骤1. 噬菌体简介好啦，大家，今天我们来聊聊一个有趣又神奇的东西，叫做噬菌体。
听起来像是外星人发明的玩意儿，其实它是一种专门攻击细菌的病毒，简直是细菌界的“灭霸”。
它们在微观世界中偷偷摸摸地工作，悄无声息地解决那些惹人烦的细菌问题。
咱们身边的细菌可不少，有的对我们有益，但有的却是个十足的“败类”。
这时候，噬菌体就像是细菌的天敌，真是太酷了！2. 分离纯化的意义2.1 为何要分离纯化噬菌体？那么，为什么我们要把噬菌体分离和纯化呢？首先，想象一下，如果你在一个大杂烩中找一颗珍珠，那可是相当困难的。
所以我们得把这些小家伙从杂乱的环境中“捞”出来，单独让它们站到聚光灯下。
这样一来，我们就可以更好地研究它们，了解它们是怎么攻击细菌的，有助于开发新的治疗手段，像是抗生素的替代品。
2.2 纯化的重要性再者，纯化的过程就像是给噬菌体洗澡，洗去那些多余的脏东西，只留下最纯粹的样子。
这样才能确保我们研究的数据准确，不然的话，可能会被一些“干扰分子”搞得一团糟。
想想，如果你的咖啡里多了一勺盐，那可就毁了整杯了，不是吗？3. 分离纯化的步骤3.1 收集样本接下来，我们来说说具体步骤。
第一步，得收集样本。
你可以从土壤、水源，甚至是一些腐烂的食物中找到细菌和噬菌体。
这可不是随便捞的，咱得选那些“鱼塘”丰富的地方。
想象一下，像在一片荒野中寻找“金矿”，可是比喻中的“金矿”得小心翼翼，别让细菌给我们添乱。
3.2 培养细菌收集好样本后，我们要把这些细菌培养起来。
通常用一些培养基，就像细菌的“自助餐”。
让它们在温暖的环境中肆意生长，像是细菌的“欢乐派对”。
可是咱可不能忘了，噬菌体也会趁机来“捣乱”，所以这时得时刻盯着它们的动态。
3.3 噬菌体分离一旦细菌培养得差不多了，就可以进行分离了。
这里可以用过滤的方法，把细菌和噬菌体分开。
想象一下，像是在过筛子，把沙子和金子分开，真是一场“筛沙子”的大比拼。
然后把留下来的液体提取出来，这里就大功告成了，噬菌体终于登场了。
大肠杆菌噬菌体的分离、纯化及其特性研究
１０ｎ 尾宽约 １ ２ ｉ 有尾鞘 、 ３ ｍ， ８— ２ｒ ｍ， 基板 、 尾丁 、 尾丝等结构 ， 该类噬菌体在污水中 占绝大多数． 三是短尾 噬菌体 ， 其头部
为二十面体 ， 大小为 ２ ｍ， ０ｒ 尾部长约 ２— ｍ， ｉ ３ｎ 在污水 中占有一定 的比例． ２种噬菌体在 一１ ￣ 冰箱可存活 ５ ８（ ２ ６天． 噬菌 经
体处理的污水 ， 总菌数下降了 ３ ％左右 ， ０ 大肠杆菌总数下降 ９ ％ 以上． ０
关 键词 ： 大肠杆菌； 噬菌体 ； 分离； 纯化； 特性
中图分类号 ： ３．８ Ｑ ９９４
文献标识码 ： Ａ
文章编 号 ： ３－ ７（０８ ￥－ ７－ ０ ８ ４９２０ ）２ ２３ ５ ４ ０ ０ ０
不衰 ， 已证 明利用 噬菌 体 可 以控 制 大肠 杆菌 引起 的 现 犊牛 、 仔猪 、 羔羊 的腹 泻 ， 治疗 大 鼠的大肠杆菌感 染 ， 在
１ 材 料 与方 法
１ １ 菌株来源及培养 ．
菌种 ： 大肠杆 菌（ ｃｉＣ Ｅ． ｌ ＭＣＣ（ ４ １３ 由厦 门 ｏ） Ｂ）４ ０ （
大学生命 科学学 院教学部提 供 ） 培养基 参 考文献 ［ ］ ， ７ 配制 ， ３倍 Ｌ Ｂ培 养基 ，Ｈ ． ７ ４ 其 中 Ｌ ｐ ７ ２— ． ； Ｂ底层 平 板培养 基加 ２ 琼脂 ， ％ 上层 培 养基 加 １０ ．％琼 脂 ．ＭＢ Ｅ 固体 培养基 ．
对鸡肉接种大肠杆菌的同时在鸡体不同部位注射噬菌 体， 则可保 护 鸡免 受 大 肠 杆 菌 的 感染 ．９２年 ，ｏｔｌ １９ Ｓｏｉ ｌ 发现 噬菌 体可 以保 护小 鼠免受 鲍 曼不 动 杆菌 、 脓假 绿 单胞菌的感染． 现在， 噬菌体在人、 鱼的传染性疾病 畜、 的防治方面发挥 着重 要 的作 用 ． 国 内， 在 自上 世 纪 ５ ０年代应用绿脓 杆菌 噬菌体 治疗 大 面积烧 伤病 人 ， 成 功地解 除 因耐药性 而 长期 不 能治 愈 的 问题 以来 ， 菌 噬
细菌的噬菌体分型
细菌的噬菌体分型实验二细菌的噬菌体分型第一部分肠杆菌科噬菌体的分离、纯化与增殖噬菌体广泛存在于自然界。
凡是有细菌存在的地方，一般都能找到相应的噬菌体。
例如，土壤、肥料、腐烂有机物、粪便和阴沟污水等常是各种细菌的栖息地，从中能分离到相应的噬菌体。
从自然界分离某一噬菌体需要经过以下步骤:培养宿主菌(或叫做敏感菌);采集含噬菌体的样品;噬菌体富集培养;制备噬菌体裂解液;验证噬菌体的存在;噬菌体的纯化;噬菌体的增殖;噬菌体的效价测定和保存。
下面以大肠杆菌噬菌体为例详细介绍噬菌体的分离和纯化方法。
1( 噬菌体的分离(1)制备菌悬液:取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
(2)增殖培养:于10ml三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶(1支5ml吸管)中，加入污水样品20ml(1支5ml吸管)与大肠杆菌悬液0.2ml(1支1ml吸管)，37?培养12h,24h以增殖噬菌体。
(3)制备裂解液:将以上增殖的混合培养液2500r/min离心15 min(1支5ml吸管)。
将上清液倒入无菌平皿，针管抽取液体，在针栓式滤器上过滤除菌。
所得滤液倒入灭菌瓶内，取少量滤液作无菌试验，即将它接入牛肉膏蛋白胨培养液中(1支5ml吸管、1支1ml吸管、1支无菌带帽华氏管)，置于37?培养过夜，以作无菌检查。
(4)噬菌体确证试验:滤液经37?培养过夜，若无细菌生长则表明已经彻底除菌。
需进一步证明噬菌体的存在。
于已烘干的肉膏蛋白胨琼脂平板(平皿1个)表面加一滴大肠杆菌悬液(1支1ml吸管)，再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均匀的一薄层。
放置数分钟，待琼脂表面干燥，在菌层的表面布点5个,7个，每点滴加上述滤液1小滴(1ml枪1把和枪头10个)，同时选择其中一点不加滤液只滴加一小滴生理盐水为对照，再放置数分钟，使液滴被琼脂吸干。
倒置平板，37?培养过夜。
次日观察结果，若平板上滴加滤液的部位出现噬菌斑，而在对照滴中处无噬菌斑，则表明该滤液中肯定含有大肠杆菌相应噬菌体。
噬菌体作为载体的使用流程
噬菌体作为载体的使用流程1. 简介噬菌体是一种可以感染细菌的病毒，它可以被利用作为生物学研究和生物工程领域的载体。
在使用噬菌体作为载体时，有一系列的流程需要遵循以确保实验的成功进行。
本文将介绍噬菌体作为载体的使用流程。
2. 噬菌体的培养和扩增在使用噬菌体作为载体之前，首先需要培养和扩增噬菌体。
以下是噬菌体的培养和扩增流程：•准备培养基：根据实验需求，选择适合噬菌体生长的培养基，并准备好所需的培养基。
•制备噬菌体接种物：选择适当的宿主细菌，如大肠杆菌等，并将其在培养基中进行培养，直至细菌达到适当的生长状态。
•加入噬菌体：将培养好的噬菌体加入到宿主细菌培养物中，使其与细菌发生感染。
•培养噬菌体：将噬菌体和宿主细菌混合物在恰当的条件下进行培养，如温度、pH等。
•扩增噬菌体：通过适当的培养时间和培养条件，使噬菌体扩增至所需的数量。
3. 分离和纯化噬菌体在培养和扩增噬菌体后，需要对其进行分离和纯化，以获得纯净的噬菌体溶液。
以下是噬菌体的分离和纯化流程：•离心分离：将培养物进行离心，以分离噬菌体颗粒和残留的细菌细胞。
•滤过分离：通过使用合适的孔径滤膜，将噬菌体溶液进行滤过分离，去除杂质。
•超速离心：利用超速离心技术进一步分离噬菌体颗粒和溶液中的其他组分。
•超滤：通过使用适当的分子量切割膜，将噬菌体颗粒从溶液中分离出来。
•冻干与储存：将纯化的噬菌体溶液进行冻干处理，并储存于适当的条件下。
4. DNA插入纯化的噬菌体作为载体可以用于DNA插入。
以下是噬菌体的DNA插入流程：•DNA准备：从源中提取目标DNA，并进行适当的处理，如限制性酶切。
•DNA连接：将目标DNA与噬菌体载体DNA进行连接，通过适当的连接酶进行连接。
•转化：将连接好的DNA转化到适当的宿主细菌中，使其得到插入噬菌体的DNA。
•选择与筛选：通过选择性培养基或筛选方法，选出携带目标DNA的宿主细菌。
5. 噬菌体的扩增和提取将DNA插入噬菌体后，需要对其进行扩增和提取，以获得足够的目标DNA量。
噬菌体展示实验步骤及总结
噬菌体展示实验步骤及总结噬菌体展示技术（Phage Display）是一种利用噬菌体（phage）作为载体表达、展示外源蛋白质或肽段的技术。
该技术可以通过体外筛选方式寻找与特定生物分子相互作用的肽段或蛋白质，并在医学、农业、环境科学等多个领域应用广泛。
本文将介绍噬菌体展示实验的步骤及总结。
一、噬菌体展示实验步骤1.分离噬菌体基因组首先需要从所需噬菌体中提取其基因组DNA，进行适当的酶切、纯化、修饰和扩增等操作，以获得高质量的DNA样品。
2.插入外源DNA将需要展示的外源肽段或蛋白质基因克隆到噬菌体基因组中的特定区域（通常是其Capsid蛋白的的N末端），使其与噬菌体基因组融合。
插入操作可采用PCR扩增、克隆或基因合成等方法进行。
3.包装噬菌体将重组噬菌体基因组与一定的病毒包装反应液混合，经过一定的反应时间，使其封装成噬菌体颗粒。
包装操作可在细菌宿主中进行，也可采用体外装配法，将噬菌体基因组与其他组件（例如，在非细菌宿主中回收的Capsid蛋白）进行反应，实现噬菌体的包装。
4.筛选目标配体将噬菌体颗粒通过筛选池，如固体支持物、细胞表面或溶液相应用目标体分别进行生物学或化学实验等。
通过筛选，得到与目标体有特异性、较高亲合力的噬菌体颗粒。
随后将噬菌体提取、扩增等操作，得到一系列具体的孤儿噬菌体（orphan phage）或配体噬菌体。
5.注意事项在实验过程中需注意的一些问题：（1）噬菌体的主要结构是头部和尾部，根据实验需要可对其进行不同的修饰（例如添加标签、调整展示方向等），以增加其展示效率和特异性等。
（2）外源蛋白的表达量、保持稳定性通常受到噬菌体载体、连接方式、插入位置、转化水平等因素的影响，实验中需对其进行合理设计。
（3）噬菌体筛选应选择样品的适当浓度、筛选反应时间等，以保证准确、高效地获得目标配体。
二、噬菌体展示实验总结噬菌体展示技术是一种非常有前景的生物技术，逐渐成为体外筛选的重要手段之一。
噬菌体的分离与纯化
大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化【实验目的】1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。
2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。
3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。
4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。
5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。
【实验原理】1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。
粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。
2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：（1）培养寄主细胞（大肠杆菌）；（2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；（3）将样品内的细胞进行富集培养；（4）制备噬菌体裂解液；（5）检测噬菌体是否存在；（6）噬菌体的纯化及效价测定。
3.培养基的配制（配方）与灭菌（1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（2）牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。
（4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。
封好做好标记于121℃灭菌20min备用【实验材料及器皿】1.菌种：大肠埃希氏菌。
2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。
4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。
1-3-3 实训 噬菌体的分离与纯化
（一）实训目的 • 学习分离纯化噬菌体的基本原理。 • 掌握纯化噬菌体的方法。 • 观察噬菌斑的形态和大小。
（二）实训原理 噬菌体广泛分布在自然环境中，在 其宿主存在的地方都可以找到噬菌体。 噬菌体对宿主有高度专一性，可利用 敏感菌株—宿主培养并发现它们；根 据噬菌体感染宿主并使之裂解，可在 敏感菌株(即宿主)的琼脂平板上出现 肉眼可见的噬菌斑，一个噬菌体可形 成一个噬菌斑，对此可进行计数。
④试验 上述滤液若无菌生长，可进行有、无噬菌体 存在的试验，其方法有试管法和琼脂平板法两种， 本实验用琼脂平板法。 • 步骤一：于肉汤琼脂平板上滴加大肠杆菌菌液一 滴，用无菌玻璃刮棒涂布成一薄层。 • 步骤二：待平板菌液干后，滴加上述滤液1小滴或 数小滴于平板上，再将此平板置于37℃培养过夜。 如滤液内有大肠杆菌噬菌体存在，即加滤液处便 无菌生长，而呈蚕食状的空斑。 • 步骤三：如已证明有噬菌体的存在，可再将滤液 接种于原已同时接种有大肠杆菌的肉汤内，如此 重复移种数次，即可使噬菌体增多。
（三）材料和用具 • 大肠杆菌斜面菌种(37℃，培养l8～24h)； • 上层肉汤蛋白胨琼脂培养基(含琼脂0.6%)， 底层肉汤蛋白胨琼脂培养基(含琼脂1.5%～ 2%)，三倍浓缩的肉汤蛋白胨培养基。 • 无菌吸管，无菌培养皿，无菌抽滤器，无菌 玻璃刮棒，三角瓶，恒温水浴箱，蔡氏细菌 滤器，真空泵，阴沟污水。
2.纯化 • ①滤液稀释 将含大肠杆菌噬菌体的滤液用 肉汤培养基按l0倍稀释法进行稀释，使成 5个稀释度。 • ②倒底层平板 用9cm直径的平皿5个，每 个平皿约倒l0mL底层琼脂培养基，依次标 明。 • ③倒上层平板 取5支各装有4mL上层琼脂 培养基的试管，依次标明。熔化后放于 50℃左右的水浴锅内保温，然后分别向每 支试管加0.1mL 大肠杆菌菌液和对号加入 0.1mL各稀释度的滤液，摇匀，然后对号倒 人底层琼脂平板上，摇匀铺平。
噬菌体简介
噬菌体一、生物学特性噬菌体（Phage）属于非细胞型微生物，是侵染细菌、放线菌等细胞型微生物的病毒。
它们个体微小，通常仅能在电子显微镜下观察到；结构简单，多数噬菌体仅由蛋白质和核酸两种成分组成，蛋白质构成的衣壳包裹着核酸。
在自然界单独存在的噬菌体不表现出生命规象，但具有潜在的生命力。
噬菌体从吸附至宿主细胞上的一瞬间，就开始了自己的生命过程。
根据噬菌体与宿主的关系，可将其分为烈性噬菌体与温和噬菌体。
烈性噬菌体通过吸附、侵人、生物合成、装配与释放等步骤使宿主细胞裂解死亡；而温和噬菌体侵染宿主后，则将其核酸整合在宿主基因组上，并以原噬菌体状态存在，宿主则转为溶原性菌株；但有时也有机率较少的温和噬菌体与烈性噬菌体一样，引起宿主细胞的裂解死亡。
温和噬菌体对溶原状态和裂解途径的选择，取决于感染细胞内的一些宿主基因产物和噬菌体基因产物活性之间的平衡。
[1]噬菌体广泛分布于自然界是与其宿主的广泛分布分不开的。
迄今为止，几乎没有一群细菌尚未发现其相应的噬菌体，只有那些我们了解的还很肽浅的细菌才尚未见其相应噬菌体的报导。
[2] 根据大小、形态结构特征，可以把噬菌体分为3种类型，一是蝌蚪状不可收缩尾的噬菌体，其头部为二十面体，直径约110 -120nm，尾部长220-230 nm,尾宽13-15 nm,无尾鞘、基板、尾丁、尾兹等结构。
二是蝌蚪状可收缩尾的噬菌体，其头部为三十面体，约70nm x 110 nm，尾部长约120 -130 nm,尾宽约18-22nm，有尾鞘、基板、尾丁、尾兹等结构，该噬菌体似有包膜。
三是短尾噬菌体，其头部为二十面体，大小为20 nm，尾部长约2-3 nm。
[3]图1. 噬菌体生活周期二 噬菌体的繁育技术1. 繁殖方式噬菌体为非细胞型微生物，其增殖(复制)方式与细菌的繁殖(二分裂)方式不同，从吸附宿主菌到子代噬菌体的释放是一个爆发的过程，表现为“一步生长”的特点。
一步生长实验于1939年Ellis 和Delbruck 创立，据此可以测知噬菌体在细菌内增殖的潜伏期即每一个细菌产生噬菌体的平均裂解量。
噬菌体制备流程
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幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统及其表达纯化方法和应用
幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统及其表达纯化方法和应用幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）是一种常见的胃肠道致病菌，在人类胃黏膜中引起多种疾病，包括慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌等。
为了适应宿主环境并有效地定殖于胃黏膜，幽门螺旋杆菌具有复杂且高效的获得铁源和逃避宿主免疫攻击的机制。
在幽门螺旋杆菌的适应性进化过程中，噬菌体（phage）在菌株间的转移起到了重要的作用。
噬菌体是一种具有细胞寄生性的病毒，能通过感染细菌并利用其生物合成机制来复制自身。
幽门螺旋杆菌噬菌体被称为ΦHPP12，通过编码一种特别的裂解系统，能够在宿主细胞中释放并破坏细胞壁，从而释放大量的噬菌体。
幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统主要包括三个基本组分：裂解酶（endolysin）、膜相关蛋白（holin）和锚定蛋白（spanin）。
裂解酶是裂解系统的核心组分，能够切割细胞壁的肽聚糖链，导致胞内外渗透平衡失调，最终导致细胞爆破。
膜相关蛋白在细菌细胞膜上形成通道，使裂解酶能够进入细胞质内。
锚定蛋白通过与裂解酶和膜相关蛋白相互作用，将裂解酶定位到特定的位置，以确保有效的裂解过程。
为了研究幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统的机制以及开发相关的应用，研究人员开展了表达纯化幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统的研究。
首先，需要通过PCR方法从幽门螺旋杆菌中克隆出裂解酶、膜相关蛋白和锚定蛋白的基因序列。
接着，将这些基因序列插入适当的表达载体中，并将其转化到大肠杆菌等表达宿主中。
通过感受态筛选、鉴定阳性克隆以及培养大规模表达，可以获得大量的幽门螺旋杆菌裂解系统蛋白。
纯化幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统蛋白的方法主要包括细胞裂解、亲和层析和分子筛分离等步骤。
首先，利用超声波等方法将表达宿主细胞进行裂解，释放蛋白质。
接着，通过亲和层析柱中特异性的亲和标记，如His标记，将目标蛋白与其他蛋白质分离。
最后，通过分子筛分离技术进一步提纯目标蛋白，得到高纯度的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解系统蛋白。
噬菌体的分离与纯化实验设计
噬菌体的分离与纯化（小组成员：宋淑芳、项媛媛、谢坤、陈金杰、陶思凡）一、实验目的学习分离纯化噬菌体的基本原理和方法，观察噬菌斑二、实验原理噬菌体感染宿主细胞后，其DNA（或RNA）在细胞体内进行复制、转录，相关基因表达，装配成完整的噬菌体颗粒，最后裂解宿主细胞或通过挤出方式从宿主细胞（宿主细胞不被杀死，如M1噬菌体）中释放出来。
因此，①在液体培养基中可使浑浊的菌悬液变为清亮或较清亮。
利用噬菌体的这种特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基混合后培养，噬菌体便能大量增殖，释放，从而可分离到特定的噬菌体。
②在有宿主细菌生长的软琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌或限制被染细菌的生长，形成透明的或浑浊的空斑，亦称噬菌斑。
一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这种现象可将分离获得的噬菌体进行纯化。
三、实验用具及材料1.菌种：大肠杆菌2.试剂：氯仿3.培养基：液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6 g，NaCl 1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏 0.9g，NaCl 1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌；半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌4.仪器及其他用品：无菌小试管、无菌吸管、玻璃涂棒、无菌细菌过滤器（孔径0.22um），恒温水浴锅等5.阴沟污水四、实验步骤1.噬菌体的分离⑴制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液的试管中，混合均匀后置37℃培养过夜⑵增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基大的三角烧瓶中加入阴沟污水20mL和大肠杆菌过夜培养物0.3mL，混合后置37℃振荡培养12～24h⑶制备裂解液：将上述混合培养物倒入一支50mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一无菌离心管中，所得裂解液经37℃培养过夜，以作无菌检查，此为噬菌体裂解液；还可加入几滴氯仿，稍作混合，备用⑷噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL大肠杆菌菌液，用无菌玻璃涂棒将菌液均匀地涂布在培养基表面上。
抗噬菌体菌株筛选
抗噬菌体菌株筛选噬菌体的分离取疑似噬菌体感染的生产菌株斜面或平板，用无菌蒸馏水将菌苔洗下，无菌过滤或离心，收集滤液或上清液。
在摇瓶培养基中接种1%生产菌株的孢子或细胞悬浮液，适温下培养24 h，加入1%的上述滤液或56离心上清液，继续培养24 h，无菌离心或过滤，收集上清液或滤液。
取上述上清液或滤液和生产菌株的孢子或细胞悬浮液各0.25ml，混匀后加在生产菌株的平板培养基上，用刮棒涂布均匀，适温下培养48~96h，确认是否生成噬菌斑。
噬菌体的纯化与增殖将上述平板上长出的噬菌斑用接种针移入生产菌株培养12~24 h的摇瓶培养液中，继续培养24 h左右，无菌过滤或离心收集滤液或上清液。
取上述滤液或上清液和生产菌株的孢子或细胞悬浮液各0.25 ml ，混匀后加在生产菌株的平57 板培养基上，用刮棒涂布均匀，适温下培养48~96h，确认是否生成噬菌斑。
重复以上两个步骤，使噬菌体达到纯化和增殖的目的。
最终所得滤液或上清液作为纯化噬菌体原液置冰箱保存。
噬菌体效价的测定取6支灭菌并烘干的小试管，分别标注 1 0-1、1 0-2、1 0-3、1 0 -4、1 0-5和10-6，各加入0.9 ml 无菌蒸馏水。
在10-1小试管中加入纯化噬菌体原液0.1ml，混匀后取出0.1ml移入10-2小试管中，如此类推，分别获得 6 个稀释度的噬菌体稀释液。
在 5 支灭菌并烘干且分别标注10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的小试管中，分别加入0.1 ml 上述10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的噬菌体稀释液和0.9 ml生产菌株的孢子或细胞悬浮液，摇匀后再加入50C的生产菌株琼脂培养基，迅速摇匀后分别倾入标注10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的灭菌培养皿中，凝固后置适温下培养48~96 h，对所形成的噬菌斑计数。
抗噬菌体菌株选育步骤斜面範子悬浮液T不同様释度平板分离培养.苗落计数/诱变处理J6O80C下处理5*：L5min t抗性捡测*/不同稀释度平板分离培养、菌落计懿单菌落J 屮只选取抗性检测具冇最大抗性的舒面恐浮液进入卜」步敢菌落分离+ K/扌富瓶发酵余全部j Ai^i fa销毁*如耒能获彳&抗效价测定性，则反复遊行上述步•骤。
噬菌体纯化步骤
噬菌体纯化步骤
噬菌体纯化的第一步呢，就是要得到含有噬菌体的样品。
这可能是从被噬菌体感染的细菌培养物里来的哦。
就像是从一个充满小秘密（噬菌体）的小世界（细菌培养物）里把它们找出来。
接着呢，得把这个样品过滤一下。
为啥呢？就像筛沙子一样，把那些大个儿的细菌啥的都给拦住，只让小小的噬菌体通过。
这时候用的滤膜就像是一个小关卡，只允许噬菌体这种小机灵鬼儿过去。
然后呀，要进行噬菌体的富集。
可以用一种特别的方法，让噬菌体在合适的环境里变得多多的。
比如说给它们提供特别适合生存和繁殖的条件，就像给小宠物创造一个超级舒服的小窝一样。
再之后呢，就是进行梯度离心啦。
这就像是把不同重量的东西在一个旋转的小世界里分开。
噬菌体比较轻，就会和那些重的杂质分离开来。
想象一下，噬菌体就像轻飘飘的小羽毛，而杂质就像重重的小石子，在这个离心的过程中，它们就各奔东西啦。
最后呀，还得再检测一下纯化后的噬菌体是不是足够纯。
可以用一些专门的检测方法，就像给噬菌体做一个小小的体检一样。
如果不纯呢，可能就得再重复前面的步骤，直到得到很纯的噬菌体为止。
宝子，噬菌体纯化虽然听起来有点复杂，但是只要一步一步来，就像搭小积木一样，慢慢就能把这个工作做好啦。
。
实验十一 从自然环境中分离纯化噬菌体
噬菌体分离和纯化的流程图
取20ml 水样 37℃ 振 荡培养 12-24h 离心收集 2500r/min 15min 上清 过滤
看板
分散滴 37℃ 过夜
加数滴
取 一 环
待 干 37℃过夜 培养 加0.1－0.2ml
EP管中加 0.9ml水
混匀 后取 0.2ml 加0.1ml 加0.1ml
立即倒 平板
③ 制备裂解液：将过夜培养物2500r/min离心15min，上清液用 无菌滤头过滤； ④ 确证实验：确证滤液中含有噬菌体的存在 在含有培养基的平板上加一滴大肠杆菌悬液，用灭菌涂布 器涂布均匀； 待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面， 置于37 ℃培养过夜；如果在滴加处形成无菌生长的透明 的噬菌斑，证明滤液中含有大肠杆菌的噬菌体。
蛋白胨 10g/L
酵母粉 5g/L NaCl 10g/L
琼脂 0.7%
琼脂 2%
四、实验操作步骤
（一）噬菌体的分离
① 制备菌悬液：平板上挑取适量E. coli接入LB摇瓶中，过夜培 养制成菌悬液；
② 增殖培养：于10ml三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基中， 加入20ml污水样品和1ml大肠杆菌菌液，37℃震荡培养 12~24h；
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌，大肠杆菌噬菌体(10-2的稀释液)。 2、培养基： LB琼脂平板(20ml培养基，2%琼脂，作底层培养基用)5个; 含琼脂培养基的试管(5ml，0.7%琼脂，作上层培养基用)5支。 3、仪器与其他用具： 含4.5ml无菌水小试管4支; 灭菌1.5ml Ep管 5个;
3、混合液加入到上层培养基中 (1) 将5管上层培养基溶化，分别标上10-4,10-5, 10-6,10-7和对照。 放置于48℃的水浴锅内。 (2) 分别将4管混合液和对照管加入对应的上层培养基试管中， 每加入一管就要立即摇匀。 4、上层培养基倒入底层平板上 (1)将摇匀的上层培养基迅速倒入相应的底层平板上，放在台面 上摇匀，使上层培养基布满平板。 (2)凝固后，置37℃培养过夜。
噬菌体纯化注意事项
噬菌体纯化注意事项
噬菌体纯化是一种将噬菌体颗粒从细菌细胞中分离出来的过程。
在进行噬菌体纯化时，有一些注意事项需要注意：
1. 无菌操作：纯化过程中需要保持细菌和噬菌体的环境无菌，以防止细菌污染。
2. 保护噬菌体完整性：在离心、稀释和搅拌等操作中要小心，避免破坏噬菌体的完整性。
3. 控制温度：噬菌体纯化过程中，需要控制温度以维持噬菌体的稳定性。
通常，噬菌体纯化在4C下进行，以减少噬菌体降解的可能性。
4. 避免酶活性：噬菌体一般会包含一些限制性内切酶和外切酶，这些酶可能对DNA和RNA有活性。
在纯化过程中，需要避免激活这些酶，以免影响纯化结果。
5. 注意噬菌体寿命：噬菌体具有有限的寿命，因此应该尽快进行纯化过程，以避免噬菌体降解。
6. 合适的缓冲液选择：选择合适的缓冲液可以帮助维持噬菌体的稳定性和纯化效果。
一般情况下，选择pH适宜的缓冲液，并加入适当的保护剂以保护噬菌体。
7. 纯化步骤选择：根据具体的纯化需求，可以选择不同的纯化方法，如离心、过滤、柱层析等。
根据实际情况选择最合适的纯化步骤。
总之，噬菌体纯化是一个复杂的过程，需要注意以上几点，以保证纯化效果和噬菌体的完整性。
噬菌体的纯化的注意事项
噬菌体的纯化的注意事项噬菌体的纯化是一种重要的实验技术，用于从混合细菌培养物中分离和富集目标噬菌体。
纯化噬菌体的过程相对复杂，需要注意许多细节和实验条件。
下面我将详细介绍噬菌体纯化的注意事项。
1. 预处理菌株：选择合适的菌株进行培养。
一般来说，应该选择易受感染的细菌菌株作为宿主，如E. coli。
同时，保证宿主菌株的健康和活力，要进行常规的培养条件优化，如温度、pH、培养基的配方等。
2. 噬菌体感染条件的优化：对于不同的噬菌体，感染条件可能有所不同，例如感染时间、感染菌液浓度等。
需要通过优化这些感染条件来提高噬菌体感染效率和产量。
3. 选择适当的抗生素：为了纯化目标噬菌体，可以选择一种或多种适合的抗生素来抑制宿主细菌的生长，从而让噬菌体选择性地感染宿主。
抗生素的选择应该针对宿主细菌对抗生素的敏感性进行测试。
4. 噬菌体感染的时间控制：感染细菌的时间应该精确控制，避免过长或过短。
过长的感染时间可能会导致噬菌体大量复制，而细菌丧失活力。
过短的感染时间则可能导致噬菌体产量过低。
5. 噬菌体的收集和处理：感染结束后，应将培养基进行离心，将上清液和沉淀分离。
上清液中含有噬菌体，沉淀中含有残余的细菌细胞。
这一步需要注意不要离心过高或过低，以避免沉淀的损失或噬菌体的污染。
6. 噬菌体的纯化方法：通常采用交叉过滤、密度梯度离心或亲和层析等方法进行噬菌体的纯化。
选择合适的纯化方法需要考虑噬菌体的性质、产量和纯度要求等因素。
7. 噬菌体的保存：纯化后的噬菌体应该进行适当的保存，以备后续实验使用。
常见的保存方式包括低温冷冻保存和分装保存等。
同时，还需要对噬菌体进行鉴定和检测，确保其质量和纯度。
8. 实验安全：在进行噬菌体纯化的过程中，要注意实验室的安全操作。
遵循实验室标准操作规程，采取必要的防护措施，如戴手套、眼镜等。
避免将噬菌体带出实验室，避免交叉污染。
总之，噬菌体的纯化是一项复杂的实验技术，需要仔细操作和严格控制实验条件。
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噬菌体的分离纯化及一步生长曲线的绘制
前言
噬菌体是以细菌为寄主的一类非细胞微生物。
目前对于噬菌体的研究大多数集中在人和动物传染性疾病的防治方面，在环境的治理方面的研究报道较少，因此我们试图分离纯化污水中的噬菌体，掌握其生物学性质，应用所得噬菌体处理、净化生活污水，减少生活污水中病原性细菌的危害。
本研究以从小鹅中提取的大肠杆菌为宿主菌，从污水中分离噬菌体并进行纯化，最后绘制一步生长曲线。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种及样品
菌种：从小鹅中提取的大肠杆菌，由老师提供。
污水来源：主要来自于农大出水口。
1.1.2试剂
1mmol/L CaCl2溶液
1.1.3试剂的配制
(1) 液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨5g，牛肉膏1.5 g，NaCl 2.5g，加H2O至500mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌。
(2) 3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，NaCl 1.5g，加H2O 至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌。
(3) 固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌。
(4) 半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌。
1.1.4主要仪器
电热恒温培养箱（SHEL·LAB）、
电热恒温水温箱（HHW21·Cu600，XMTD）、
恒温摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）、
通风柜（M·TFG-A）、医用净化工作台（苏净集团安泰公司）、
台式离心机（eppendorf）、
台式高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER）、
超低温冰箱（Forma Scientific）、
YM50全自动不锈钢立式电热蒸汽消毒器、
针头式细菌过滤器、0.22μm微孔滤膜（上海市新亚净化器件厂）、
微量移液器（GILSON）、UVette(Eppendorf)。
1.2方法
1.2.1噬菌体的分离
1.2.1.1摇菌
老师提供的大肠杆菌液加入5mL1×牛肉膏液体培养基，混合后，37℃振荡（120rpm）14h，此时大肠杆菌达到了对数生长期，取出4℃保存。
1.2.1.2噬菌体分离
从农大出水口采集未经消毒处理的污水样本一瓶，经双层滤纸粗滤后取用50mL，加入氯化钙母液（终浓度为1mmol/L），再用0.22微米微孔滤膜过滤除菌。
取10mL滤后液加入5mL3×牛肉膏培养液，再加
入对数生长期宿主菌悬液0.5mL，混匀37℃过夜。
次日8000rpm离心30min,取上清液4.5mL加5mL3×牛肉膏培养基及宿主菌液0.15mL，室温放臵1h,30℃振荡（120rpm）10h,取出后再次离心（12000rpm,30min），微孔滤膜过滤，-20℃保存待用。
1.2.2单层平板验证试验
1.2.2.1浇板
将配制的牛肉膏固体培养基浇板，注意不要被污染，放入37℃温箱培养过夜，验证有无细菌生长。
1.2.2.2涂板
将1×牛肉膏琼脂平板分成3个扇形区，无菌吸取宿主菌液0.1mL，滴入平板，用灭菌的曲玻棒均匀涂开，超净台内自然干燥后，选一扇形区滴入过滤后噬菌体原液，用曲玻棒在该区域涂匀，不要超过界限，自然晾干后，30℃温箱培养12h,室温放臵2h后观察噬菌体区域有无细菌生长。
结果，单层平板噬菌斑不明显。
1.2.3噬菌体双层平板噬菌斑实验
1.2.3.1稀释噬菌体原液
取0.2 mL噬菌体原液，加入1.8 mL1×牛肉膏培养液，为一倍稀释，依此类推，稀释度为101、102、103、104、105、106稀释液4℃内保存。
1.2.3.2双层平板噬菌斑试验
取102、104、106被稀释的噬菌体原液各0.05 mL与宿主菌0.15 mL
混匀，室温放臵15分钟后，加入50℃上层牛肉膏培养基约2.5 mL，将该混合液迅速倾倒入下层牛肉膏培养基平板上,摇匀平臵5min,37℃温箱培养12h后观察噬菌斑形成情况。
结果，第一次试验，仅宿主菌为松原猪的出现噬菌斑，其余三株均未出现结果
下图为松原猪大肠杆菌为宿主菌的双层平板噬菌斑照片：
图1为稀释度为102的噬菌斑图片
图2为稀释度104的噬菌斑图片
1.2.4单一性噬菌体筛选
1.2.4.1挑噬菌斑
在噬菌斑形成的双层平板上挑取形态大小一致、单个独立的典型噬菌斑，用最小的枪头穿刺目的噬菌斑，将穿刺后的枪头放入5 mL 3×牛肉膏液体培养基，轻轻搅拌，重复2～3次后，加入噬菌体宿主菌液0.2 mL，摇匀，室温放臵1h,37℃培养12h,4℃下12000rpm离心30min,取上清4℃保存。
1.2.4.2 纯化
反复用双板试验验证噬菌体，在多次试验中，均没有再出现噬菌斑。
2.结论
在老师所提供的八株大肠杆菌当中，只有松原猪型大肠杆菌成功的分离出噬菌体，并出现了明显的噬菌斑。
但经过多次反复试验，均没能够成功纯化。
，所以导致无法成功绘制噬菌体一步生长曲线。