重组质粒的构建.

重组质粒的构建实验流程—质粒构建
基因提取—1、2、3
基因提取—1、2、3
PCR反应扩增目的基因—4、3
PCR反应扩增目的基因—4、3
DNA片段回收—5、3
DNA片段回收—5、3
重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5
重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5
测序
测序
重组质粒提取—2、 3
重组质粒提取—2、 3
菌种保藏—7
菌种保藏—7
目的片段与载体连接及转化—6
目的片段与载体连接及转化—6
实验操作
1、 LB培养基配置
LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。

其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。

【试剂】
胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar）
【实验步骤】
1、 LB固体培养基配方（配置100ml培养基）
胰蛋白胨（Tryptone） 1g
酵母提取物（Yeast Extract） 0.5g
NaCl 1g
琼脂（Agar） 1.5g
单蒸水 100ml
蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，
称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或
在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药
品，瓶盖也不要盖错。

2、液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。

3、包扎
用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

4、灭菌
将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。

如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。

灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。

5、 LB固体培养基倒板
配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。

抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

倒板：一般10ml倒1个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10—15min。

保存:将培养皿倒置放于4℃保存，一个月内使用。

二、质粒的提取（protocol）
1、大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至5ml的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。

【注：培养液不宜过量，过量时会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。

】
2、5ml菌液倒入5ml离心管中，10,000xg，1min离心，弃上清。

（实验室用的离心机转速达不到，故将其调到最大转速12,000rmp，离心
2min）
【注：rmp（转速）与rcf= ×g（相对离心力）,RPM只是一个习惯用法，g才是衡量转速的通用标准：不同的转子，RPM是不能通用的，g值则是通用的，也就是说，只要你在不同的离心机上用相同的g，他们的离心效果原则上是一样。

】
3、加入250ul SolutionⅠ（使用前加入RNase A1，冰箱4℃冷藏），充分悬浮细菌沉淀。

【注：注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器Vortex 等剧烈震荡使菌体充分悬浮。

】
4、加入250ul SolutionⅡ【裂解细胞】（提前放入37℃孵育箱内预热）轻轻地上下翻转混合5—6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。

【注：此步骤不宜超过5min】
5、加入350ul SolutionⅢ【变性蛋白】，轻轻上下翻转混合5—6次，直至形成紧实凝集块。

6、将上面液体倒入1.5ml的EP管中，13,000xg，10min离心。

7、将上述离心得到的液体倒入柱内，10,000xg，1min离心，弃液体。

8、加入500ul bufferHB，10,000xg，1min离心，弃液体。

9、加入700ul DNA wash buffer（提前加入指定体积的100%乙醇），10,000xg，1min离心，弃液体。

（重复一次）
10、空离，13,000xg，2min离心。

11、将离心柱放入1.5mlEP管内，置于孵育箱内3min烘干。

12、加入60ul ddH2O（提前在60℃水浴箱内预热），60℃摇2min。

13、13,000xg，1min离心，得液体。

14、测浓度。

15、DNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

【注：提好的质粒需标明时间、名称等，-20℃保存。

】
3ul 质粒（DNA ） 10xLoadingBuffer 1xTAE 3ul 1ul 6ul 6ul 质粒（DNA ） 10xLoadingBuffer 20ul 2.2ul
三、琼脂糖凝胶电泳
【试剂】
琼脂糖（Agarose ），1xTAE 电泳缓冲液，染料（SyBR Safe DNA Gel Stain ）,
DL2000 DNA Marker, 10xLoading Buffer
【实验步骤】
1、配置50ml （大样）、25ml （小样），1.5%的琼脂糖凝胶。

称取50x1.5%=0.75g 琼脂糖粉末于锥形瓶中，加入50ml 1xTAE 缓冲液，染料2ul （边加染料边倒TAE 缓冲液于装有琼脂糖的锥形瓶中），封口。

2、放在微波炉中加热，沸腾2次，直到看不到油滴，形成均一的溶液。

（一般中低档，5min ）
3、插入梳子，倒入制胶槽中。

4、放在抽屉里室温、避光静置20min 。

5、按下表加样。

适用于检测DNA （小孔）：
Marker （DL2000） 样品
适合回收DNA(大孔)
Marker （DL2000） 样品
6、120V ，电泳25min 左右。

7、检测：将凝胶板放入检测仪中检测。

新建→选染料（SyBR safe ）→选颜色（SyBR Green ）→勾除高亮选项→检测→文本注释(字体14，颜色白色)→保存
（酶切后的质粒会出现两条色带，上面的一条是载体较暗，下面的一条是目的质粒较亮，根据Marker显示，证明是否是所需质粒）
【注】
1、当加入浓度的样品量小于5ul时，10xLoadingBuffer均加1ul。

2、电泳的加样空宽度小于6mm时，每次取5ul制品电泳便可得到清晰条带，如果加样空增宽，需适当增加Marker制品的加样量。

3、对DNA电泳而言，琼脂糖的纯度对DNA条带的清晰度影响很大。

4、进行琼脂糖凝胶电泳时，琼脂糖的浓度与DNA片段的分离性能关系密切。

琼脂糖的浓度越大，对短片段的分离性能越好，反之，琼脂糖浓度越小，越有利于长片段DNA的分离。

5、当电泳后片段需回收时，选用大孔胶，当电泳只起检测作用时，选用小孔胶。

6、若电泳产物需要回收，则需换新的缓冲液。

7、实验室有两种常用的Marker分别为DL2000 DNA Marker和λ-EcoT14 digest DNA Marker。

琼脂糖电泳图像示意图如下：
四、PCR
【试剂】
灭菌水、10xbuffer、混合的寡核苷酸（dNTPS）、引物（上、下）
Taq DNA聚合酶、模板DNA（质粒）
【操作步骤】
加样前应先打开PCR仪预热。

1、在0.5mlPCR管中加入依次下列试剂：
25ul体系（EGFP扩增）：
灭菌水： 9.5ul
LA混合物： 12.5
上引物： 1ul
下引物： 1ul
模板DNA（PCDHA）： 1ul
总体积： 25.0ul
2、将上述PCR反应混合物放入PCR仪中。

3、设定程序进行扩增：
94℃变性5min后，开始以下循环
94℃变性-----------------------------------------30s
55℃退火（退火温度不固定，根据引物进行调整）-----1min
72℃延伸-----30s（延伸时间根据目的片段的长度进行调整）
共30个循环
最后循环结束后72℃反应7min，4℃冷却。

4、PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

【注】
1、当PCR反应后的产物目的片段还需要进行后续操作时，选用LA Taq 酶；当PCR反应用于检测时选用EX Taq酶。

2、buffer的选择应与酶的选择相对应，例如：LA Taq酶对应的buffer为10xLA PCR Buffer。

3、在PCR小管中加样时，应先将各试剂加到管壁上，最后混匀。

这样既节省时间，又节省枪头。

五、PCR产物的回收纯化
1、将PCR产物稍微离心片刻。

2、将PCR扩增产物转移至1.5ml EP管中，然后加入4-5倍体积的Buffer CP,若PCR产物<200bp则加入6倍体积的Buffer CP。

3、充分振荡混合。

4、然后转移至DNA离心柱中，10,000xg离心1min，倒回重复一次，弃
液体。

5、加入700ul的DNA Wash Buffer，10,000xg离心1min ，弃液体。

6、空离，13,000xg，2min离心。

7、将离心柱放入1.5mlEP管内，吹风吹干。

8、加入15-30ul ddH2O（提前在60℃水浴箱内预热），60℃摇2min。

9、13,000xg，1min离心，得液体。

六、与T载体连接
10ul体系
2xRapid Ligation Buffer，T4 DNA Ligase 5ul
PGEM-T Easy Vector（50ng） 1ul
PCR product（150ng） 150/C ul
T4 DNA Ligase 1ul
Water 3-150/C ul
总体系 10ul
放入4℃冰箱内过夜。

七、DNA片段的回收纯化
【实验步骤】
1、实验前将水浴锅调到55℃-60℃，将灭菌水60℃水浴锅内预热。

2、使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。

3、在紫外灯下切出还有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。

此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA的回收率。

（注：切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防DNA损伤，先切后验证。

）
4、切碎胶块。

5、向胶块中加入胶块融化液Binding buffer 500ul。

6、均匀混合后55℃-60℃加热融化胶块7min，此时应间断振荡混合。

（注：胶块一定要充分融化，否则将会影响DNA的回收率。

）
7、将上述胶块融化液倒入柱子内，10,000xg 1min离心，倒回，重复一次。

8、加入300ul Binding buffer，10,000xg 1min离心，弃滤液。

9、加入700ul DNA wash buffer，10,000xg 1min离心，弃滤液。

10、空离，13,000xg，2min离心。

11、将离心柱放入1.5mlEP管内，吹风吹干。

12、加入30ul ddH2O（提前在60℃水浴箱内预热），60℃摇2min。

13、13,000xg，1min离心，得液体。

八、目的片段与载体的连接及转化
【试剂】
PMD-18载体、目的片段、SolutionⅠ、感受态细胞、LB液体培养基（加氨苄青霉素抗体AMP）、
含AMP的LB固体培养基
【实验步骤】
1、连接
、实验前水浴准备。

、在PCR管中加入：
PMD-18载体 1ul
目的片段 4ul
总体积 5ul
、再加入5ul的SolutionⅠ
、16℃，连接90min
2、转化
、全量10ul加入至感受态细胞中，冰上放置40min。

、42℃水浴锅内热激90s（让质粒进入感受态细胞）。

、取出冰上放置5min（让感受态细胞关闭）。

、加入200ulLB液体培养基（无抗体AMP），37℃摇床培养1h。

3、涂板
将上述培养液涂布在含AMP的LB固体培养基上，过夜培养。

（3ml培养基中加入3ulAMP）
4、挑菌
第二天晚上五点左右挑菌，在5ml LB液体培养基（加5ul AMP）中摇床培养，37℃过夜。

（5ml LB培养菌+5ulAMP+用枪头挑菌，枪头可打入培养瓶中）
5、第二天提取质粒。

或6、保藏
、实验前超净台灭菌。

、将500ul50%的甘油与500ul菌液混合，-80℃保存。

九、双酶切反应
【试剂】
Buffer2.1、限制酶Ⅰ（EcoRⅠ）、限制酶Ⅱ（BstBⅠ）、重组质粒（plasmind）、灭菌水
【实验步骤】
1、实验前水浴准备。

2、在0.5ml的PCR管中加入下列试剂：
体系：
灭菌水： 20ul-V其他
Buffer2.1： 2ul
BSA： 0.2ul
质粒： 1ug/C
EcoRⅠ： 0.5ul
BstBⅠ： 0.5ul
总体积： 20ul
（注：黑色加粗部分的体积不随总体系体积的变化而变化，既保持恒定不变。

）
3、37℃水浴，2-4h。

4、琼脂糖凝胶电泳检测双酶切产物。

【注】
1、酶的选择：载体上有酶切位点，但目的片段上没有该酶的酶切位点，且选择的酶为常用酶。

2、Buffer的选择：需要参考所选择的酶，必须同时适用于两种酶。

相关资料请查询双酶切通用缓冲液使用表。

例：若选用BamHⅠ、HindⅢ，则buffer选用10xK。

3、反应温度的选择：需要参考所选的酶，必须同时适用于两种酶。

相关资料请查询TaKaRa中文目录。