重组质粒的构建.
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重组质粒的构建实验流程—质粒构建
基因提取—1、2、3
基因提取—1、2、3
PCR反应扩增目的基因—4、3
PCR反应扩增目的基因—4、3
DNA片段回收—5、3
DNA片段回收—5、3
重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5
重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5
测序
测序
重组质粒提取—2、 3
重组质粒提取—2、 3
菌种保藏—7
菌种保藏—7
目的片段与载体连接及转化—6
目的片段与载体连接及转化—6
实验操作
1、 LB培养基配置
LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。
【试剂】
胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar）
【实验步骤】
1、 LB固体培养基配方（配置100ml培养基）
胰蛋白胨（Tryptone） 1g
酵母提取物（Yeast Extract） 0.5g
NaCl 1g
琼脂（Agar） 1.5g
单蒸水 100ml
蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，
称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或
在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药
品，瓶盖也不要盖错。
2、液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。
3、包扎
用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
4、灭菌
将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。
5、 LB固体培养基倒板
配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。
抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
倒板：一般10ml倒1个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10—15min。
保存:将培养皿倒置放于4℃保存，一个月内使用。
二、质粒的提取（protocol）
1、大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至5ml的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。【注：培养液不宜过量，过量时会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。】
2、5ml菌液倒入5ml离心管中，10,000xg，1min离心，弃上清。（实验室用的离心机转速达不到，故将其调到最大转速12,000rmp，离心
2min）
【注：rmp（转速）与rcf= ×g（相对离心力）,RPM只是一个习惯用法，g才是衡量转速的通用标准：不同的转子，RPM是不能通用的，g值则是通用的，也就是说，只要你在不同的离心机上用相同的g，他们的离心效果原则上是一样。】
3、加入250ul SolutionⅠ（使用前加入RNase A1，冰箱4℃冷藏），充分悬浮细菌沉淀。【注：注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器Vortex 等剧烈震荡使菌体充分悬浮。】
4、加入250ul SolutionⅡ【裂解细胞】（提前放入37℃孵育箱内预热）轻轻地上下翻转混合5—6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。【注：此步骤不宜超过5min】
5、加入350ul SolutionⅢ【变性蛋白】，轻轻上下翻转混合5—6次，直至形成紧实凝集块。
6、将上面液体倒入1.5ml的EP管中，13,000xg，10min离心。
7、将上述离心得到的液体倒入柱内，10,000xg，1min离心，弃液体。
8、加入500ul bufferHB，10,000xg，1min离心，弃液体。
9、加入700ul DNA wash buffer（提前加入指定体积的100%乙醇），10,000xg，1min离心，弃液体。（重复一次）
10、空离，13,000xg，2min离心。
11、将离心柱放入1.5mlEP管内，置于孵育箱内3min烘干。
12、加入60ul ddH2O（提前在60℃水浴箱内预热），60℃摇2min。
13、13,000xg，1min离心，得液体。
14、测浓度。
15、DNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
【注：提好的质粒需标明时间、名称等，-20℃保存。】
3ul 质粒（DNA ） 10xLoadingBuffer 1xTAE 3ul 1ul 6ul 6ul 质粒（DNA ） 10xLoadingBuffer 20ul 2.2ul
三、琼脂糖凝胶电泳
【试剂】
琼脂糖（Agarose ），1xTAE 电泳缓冲液，染料（SyBR Safe DNA Gel Stain ）,
DL2000 DNA Marker, 10xLoading Buffer
【实验步骤】
1、配置50ml （大样）、25ml （小样），1.5%的琼脂糖凝胶。
称取50x1.5%=0.75g 琼脂糖粉末于锥形瓶中，加入50ml 1xTAE 缓冲液，染料2ul （边加染料边倒TAE 缓冲液于装有琼脂糖的锥形瓶中），封口。
2、放在微波炉中加热，沸腾2次，直到看不到油滴，形成均一的溶液。（一般中低档，5min ）
3、插入梳子，倒入制胶槽中。
4、放在抽屉里室温、避光静置20min 。
5、按下表加样。
适用于检测DNA （小孔）：
Marker （DL2000） 样品
适合回收DNA(大孔)
Marker （DL2000） 样品
6、120V ，电泳25min 左右。
7、检测：将凝胶板放入检测仪中检测。
新建→选染料（SyBR safe ）→选颜色（SyBR Green ）→勾除高亮选项→检测→文本注释(字体14，颜色白色)→保存