免疫学实验：NK细胞毒检测
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
＋10%FBS 1640培养液
调细wenku.baidu.com浓度
1×106/ml
加板(三复孔)
(加法见附图)
5%CO2 37℃培养 2小时
离心，取100ul上清移入新 孔， 37℃孵育10min
加入底物 100ul/well
室温避光孵育15min ·16·
实验步骤
免疫学实验
❖ 单细胞悬液的制备 1. 小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡消毒2-3分钟。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有5ml 1640培养液的平皿内。 3. 用纱网包裹住脾组织，将脾剪成小块，用5ml注射器塞轻压使脾细胞透过纱 网。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中， 再分别用1ml培养液冲洗纱网和平皿，并将细胞悬液吸出，放入同一50ml离 心管中，剩余3ml培养液备用。
·12·
同位素释放法
免疫学实验
❖应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶 细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出 51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡 靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数(cpm)， 即可计算出NK细胞毒活性。
·13·
乳酸脱氢酶释放法-原理
免疫学实验
2. 调脾细胞浓度至1×108/ml，每组所需总量为1ml 3. 调YAC－1细胞浓度至1×106/ml，每组需2ml
❖同位素释放法： 51Cr、3H-TdR、125I-UdR
❖乳酸脱氢酶释放法 (本次实验采用)
·11·
同位素释放法
免疫学实验
G0
G1
S
New DNA
Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
Or Protein
cpm
SI
试验孔cpm均值－自然释放孔 cpm均值 最大释放孔 cpm均值－自然释放孔 cpm均值
乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，不
能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至 培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中， 使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶(NADH)，后者再通过 递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝 (INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在 570nm波长处有一吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细 胞毒活性。
·14·
乳酸脱氢酶释放法
免疫学实验
靶细胞 NK YAC-1 杀伤
靶细胞 膜损伤
LDH 释放到细胞外
无色底物
LDH底物 还 原
测OD570值
有色物质
实验值-自发释放值
杀伤率( %)= Max- S自发
×100
最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值 自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值
4. 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。 ❖ 细胞计数：
1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中， 混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀 后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。
·5·
NK细胞功能：清除异常细胞
免疫学实验
❖通过杀伤激活受体（KAR）直接识别
❖通过抗体间接识别：ADCC
❖分泌杀伤介质： perforin granzyme
TNF IFN
❖清除异常细胞
❖（肿瘤、病原体感染）
免疫学实验
通过杀伤激活受体（KAR）直接识别
通过抗体间接识别：ADCC
免疫学实验
实验原理
1. 小鼠 (NS,OVA)
1只/组
2. YAC-1
1*106 * 2ml
3. 培养液（DMEM) 无FCS 10ml/组
4. 培养液(DMEM)10%FCS
10ml/组
3. LDH底物
3ml/组
4. 柠檬酸（终止液） 1ml/组
·4·
原理
免疫学实验
➢ NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为机 体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的 第三类群淋巴细胞。 ➢ NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既 不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。 ➢YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染 的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的 杀伤活性。
1块/组
8. 无菌离心筒
1个/组
9. 可调微量加样器
1套/组
10. 细胞计数板
1套/组
11. 显微镜
1台/组
12. EP管
若干
13. 眼科剪、小镊子
1套/ 组
14. 细胞培养箱
1台/room
15. 酶标仪 16. 离心机
1台 2个/room
17. 超净台
1台/组
分组： 每组4人 1只小鼠
❖ 动物、细胞及试剂
❖NK细胞+靶细胞
免疫学实验
❖靶细胞破裂,释放内容物
❖胞浆内酶类 ❖LDH酶活性
❖胞浆内蛋白
❖放射性铬酸钠 ❖51Cr标记
❖DNA ❖3H-TdR掺入
NK细胞分离方法
❖密度梯度离心 ❖Ficoll 密度梯度离心 ❖Percoll密度梯度离心
❖磁化细胞分离器分离法
免疫学实验
·10·
常用的检测方法
免疫学实验
·15·
操作流程
无菌取脾
研磨成单细胞悬液+2ml 1640 （无FBS)
细胞计数 【?/ml】 混匀取后2取0u出l细2胞0u+l细98胞0u+l2的10W1u6l台40盼蓝
30l /孔 1mol/L柠檬酸
酶标仪测吸光度值： OD570nm
结果判定：
调细胞浓度
1×107 /ml
免疫学实验
培养YAC－1细胞
免疫学实验
NK细胞毒检测
·1·
NK细胞活性检测
免疫学实验
❖自然杀伤细胞（NK）介导天然免疫应答，它不 依赖抗体和补体，即能直接杀伤靶细胞，如肿瘤细 胞或被病毒感染的细胞等；此外，尚有免疫调节功 能，也参与移植排斥反应和某些自身免疫病的发生 发展。 ❖NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感 染的指标之一。例如在血液系统肿瘤、实体瘤、免 疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK活性 减低；宿主抗移植物反应者，NK活性升高。
·2·
主要内容
❖实验分组及材料 ❖实验原理 ❖检测方法 ❖主要操作步骤 ❖结果判定
免疫学实验
·3·
实验分组及材料
免疫学实验
❖ 器材
1. 75%酒精
若干
2. 5ml注射器
1个/组
3. 100ml烧杯
1个/组
4. 无菌纱网
1块/组
5. 无菌平皿
1块/组
6. 无菌吸头（大、中、小）3盒/room
7. 无菌96孔培养板
调细wenku.baidu.com浓度
1×106/ml
加板(三复孔)
(加法见附图)
5%CO2 37℃培养 2小时
离心，取100ul上清移入新 孔， 37℃孵育10min
加入底物 100ul/well
室温避光孵育15min ·16·
实验步骤
免疫学实验
❖ 单细胞悬液的制备 1. 小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡消毒2-3分钟。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有5ml 1640培养液的平皿内。 3. 用纱网包裹住脾组织，将脾剪成小块，用5ml注射器塞轻压使脾细胞透过纱 网。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中， 再分别用1ml培养液冲洗纱网和平皿，并将细胞悬液吸出，放入同一50ml离 心管中，剩余3ml培养液备用。
·12·
同位素释放法
免疫学实验
❖应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶 细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出 51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡 靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数(cpm)， 即可计算出NK细胞毒活性。
·13·
乳酸脱氢酶释放法-原理
免疫学实验
2. 调脾细胞浓度至1×108/ml，每组所需总量为1ml 3. 调YAC－1细胞浓度至1×106/ml，每组需2ml
❖同位素释放法： 51Cr、3H-TdR、125I-UdR
❖乳酸脱氢酶释放法 (本次实验采用)
·11·
同位素释放法
免疫学实验
G0
G1
S
New DNA
Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
Or Protein
cpm
SI
试验孔cpm均值－自然释放孔 cpm均值 最大释放孔 cpm均值－自然释放孔 cpm均值
乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，不
能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至 培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中， 使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶(NADH)，后者再通过 递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝 (INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在 570nm波长处有一吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细 胞毒活性。
·14·
乳酸脱氢酶释放法
免疫学实验
靶细胞 NK YAC-1 杀伤
靶细胞 膜损伤
LDH 释放到细胞外
无色底物
LDH底物 还 原
测OD570值
有色物质
实验值-自发释放值
杀伤率( %)= Max- S自发
×100
最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值 自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值
4. 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。 ❖ 细胞计数：
1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中， 混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀 后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。
·5·
NK细胞功能：清除异常细胞
免疫学实验
❖通过杀伤激活受体（KAR）直接识别
❖通过抗体间接识别：ADCC
❖分泌杀伤介质： perforin granzyme
TNF IFN
❖清除异常细胞
❖（肿瘤、病原体感染）
免疫学实验
通过杀伤激活受体（KAR）直接识别
通过抗体间接识别：ADCC
免疫学实验
实验原理
1. 小鼠 (NS,OVA)
1只/组
2. YAC-1
1*106 * 2ml
3. 培养液（DMEM) 无FCS 10ml/组
4. 培养液(DMEM)10%FCS
10ml/组
3. LDH底物
3ml/组
4. 柠檬酸（终止液） 1ml/组
·4·
原理
免疫学实验
➢ NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为机 体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的 第三类群淋巴细胞。 ➢ NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既 不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。 ➢YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染 的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的 杀伤活性。
1块/组
8. 无菌离心筒
1个/组
9. 可调微量加样器
1套/组
10. 细胞计数板
1套/组
11. 显微镜
1台/组
12. EP管
若干
13. 眼科剪、小镊子
1套/ 组
14. 细胞培养箱
1台/room
15. 酶标仪 16. 离心机
1台 2个/room
17. 超净台
1台/组
分组： 每组4人 1只小鼠
❖ 动物、细胞及试剂
❖NK细胞+靶细胞
免疫学实验
❖靶细胞破裂,释放内容物
❖胞浆内酶类 ❖LDH酶活性
❖胞浆内蛋白
❖放射性铬酸钠 ❖51Cr标记
❖DNA ❖3H-TdR掺入
NK细胞分离方法
❖密度梯度离心 ❖Ficoll 密度梯度离心 ❖Percoll密度梯度离心
❖磁化细胞分离器分离法
免疫学实验
·10·
常用的检测方法
免疫学实验
·15·
操作流程
无菌取脾
研磨成单细胞悬液+2ml 1640 （无FBS)
细胞计数 【?/ml】 混匀取后2取0u出l细2胞0u+l细98胞0u+l2的10W1u6l台40盼蓝
30l /孔 1mol/L柠檬酸
酶标仪测吸光度值： OD570nm
结果判定：
调细胞浓度
1×107 /ml
免疫学实验
培养YAC－1细胞
免疫学实验
NK细胞毒检测
·1·
NK细胞活性检测
免疫学实验
❖自然杀伤细胞（NK）介导天然免疫应答，它不 依赖抗体和补体，即能直接杀伤靶细胞，如肿瘤细 胞或被病毒感染的细胞等；此外，尚有免疫调节功 能，也参与移植排斥反应和某些自身免疫病的发生 发展。 ❖NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感 染的指标之一。例如在血液系统肿瘤、实体瘤、免 疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK活性 减低；宿主抗移植物反应者，NK活性升高。
·2·
主要内容
❖实验分组及材料 ❖实验原理 ❖检测方法 ❖主要操作步骤 ❖结果判定
免疫学实验
·3·
实验分组及材料
免疫学实验
❖ 器材
1. 75%酒精
若干
2. 5ml注射器
1个/组
3. 100ml烧杯
1个/组
4. 无菌纱网
1块/组
5. 无菌平皿
1块/组
6. 无菌吸头（大、中、小）3盒/room
7. 无菌96孔培养板