小鼠单抗腹水纯化步骤
单克隆抗体的纯化
单克隆抗体的纯化一、腹水型单抗的纯化在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。
常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。
1、二氧化硅吸附法新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min 15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。
2、过滤离心法用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g 15分钟高速离心（4℃）除去细胞残渣及小颗粒物质。
3、混合法即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。
二、单抗的粗提1、硫酸铵沉淀法（1）饱和硫酸铵溶液的配制500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。
临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调PH至7.8。
（2）盐析吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。
（3）脱盐常用柱层析或透析法。
柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml。
第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。
透析法是将透析袋于2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用（并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存备用）。
通过小鼠腹水如何大量制备单克隆抗体
教学中产生的问题：单克隆抗体的制备过程中，大家都关注了筛选过程，往往没有关注制备的两条途径，其中之一，细胞培养的途径许多学生能理解，而腹水生产的途径就不熟悉，教材中也没有介绍，而这对内环境的知识也是有帮助的。
单克隆抗体（monoclonal
antibody，MAb），是针对专一的抗原决定簇产生的抗体。
单克隆技术又名杂交瘤技术起源于1975年，主要原理是利用产生抗体的B细胞与骨髓瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。
两种方法生产单克隆抗体：
目前大量制备单抗的方法主要有两种方法，一种是动物体内生产法（腹水制备），在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体，约1-2周，可见小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体；另一种是细胞体外培养法，将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养，在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。
由于腹水中单克隆抗体的产生通常会导致内源性宿主蛋白的污染，因此细胞培养对于小规模和大规模单克隆抗体的生产至关重要。
重点问题解疑：如何通过腹水产生单克隆抗体？
杂交瘤细胞被注射到小鼠腹腔内，由于有组织液提供足够的营养，所以能够大量分裂。同时部分杂交瘤细胞分泌抗体，这些细胞和抗体导致腹腔组织液渗透压增高，血浆和淋巴就会渗出并潴留在腹腔内形成腹水。
腹水制备法的优点：
腹水制备法操作简单、制备成本低，是目前国内生产抗体的主要方式，但是，得到的腹水常混有小鼠的各种杂蛋白（包括免疫球蛋白Ig），而且还有污染动物病毒的危险。而体外培养法通过转代培养制备的细胞培养得到的抗体，不但不含小鼠杂蛋白和动物病毒，而且抗体易纯化，目前在国外抗体生产中非常流行。
杂交瘤腹水纯化方法
杂交瘤腹水纯化方法
腹水纯化是获得高纯度单克隆抗体的重要步骤。
以下是一种常见的杂交瘤腹水纯化方法：
1. 离心：将收集的腹水离心，去除细胞和固体杂质。
2. 过滤：使用0.22 微米的过滤器过滤腹水，以去除微小的颗粒和悬浮物。
3. 亲和层析：使用针对单克隆抗体的亲和层析柱进行纯化。
将腹水加载到层析柱上，使抗体与层析柱上的配体结合，而其他杂质则流过柱子。
4. 洗脱：使用适当的洗脱缓冲液将结合在层析柱上的单克隆抗体洗脱下来。
洗脱缓冲液可以是具有竞争结合能力的物质，或者是改变pH 值或离子强度来打破抗体与配体的结合。
5. 浓缩和透析：将洗脱下来的抗体溶液进行浓缩，可以使用超滤或透析的方法去除多余的盐分和缓冲液，同时调整抗体的浓度。
6. 保存：将纯化后的单克隆抗体保存于适当的条件下，如低温冰箱或加入防腐剂。
需要注意的是，腹水纯化的方法可能因实验需求和设备条件而有所不同。
在进行腹水纯化之前，建议参考相关的实验手册和文献，以选择适合的纯化方法，并确保操作的正确性和安全性。
实验四 腹水型单抗的制备及纯化
实验四腹水型单抗的制备及纯化迄今为止，通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法，鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物当然首先BALB/c 小鼠。
本方法即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。
可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有细胞及其残渣、小颗粒物质、脂肪滴以及小鼠的各种杂蛋白，因此在很多情况下要提纯后才能使用。
而腹水单抗的纯化是一个相当困难的工作，本实验将进行IgG1型腹水单抗的提纯方法。
材料：1、成年BALB/c小鼠。
2、灭菌液体石蜡或福氏不完全佐剂；处于对数生长期的杂交瘤细胞；新鲜采集的腹水（或冻存的腹水）。
3、饱和硫酸铵（pH7.2-7.4）溶液，正辛酸，0.1M NaOH，1M NaOH，0.06M，pH4.0NaAc-HAc缓冲液，0.01M，pH7.4 PBS，10×PBS（0.01M，pH7.4）。
方法：一、腹水的制备1．取12周龄的BALB/ c小鼠腹腔注射灭菌石蜡，0.5ml/只或腹腔注射福氏不完全佐剂，0.2-0.3ml/只。
2．1周后（注射灭菌液体石蜡）或3天后（注射福氏不完全佐剂）腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠1—3×106/0.3ml。
3．间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水。
将腹水离心（2000rpm离心5min），吸去最上层的脂肪组织，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，将上清加入50﹪甘油冻存于－20℃冰箱，留下一小部分测定效价。
二、辛酸—硫酸铵法纯化腹水中的单抗1．取3ml腹水，2500r/min离心弃杂质，加入0.06M，pH4.0 NaAc-HAc缓冲液3ml，调pH 至4.8（用0.1M NaOH调）；2．加入99ul正辛酸（33ul/ml腹水），室温搅拌≥30min，4℃搅拌≥60min，逐滴加完，4℃澄清2h（20min）；3．取出15000r/min离心30min（10min）（4℃），去沉淀（白蛋白和其它非IgG蛋白），上清加入1/10体积的10×PBS（0.01M，pH7.4），用1M NaOH调pH至7.2；4．上清滴加等量饱和硫酸铵（pH7.2-7.4）溶液，使硫酸铵的饱和度为50％，继续搅拌10-30min，静置30min；5．10000rpm（4℃）离心30min（10min），弃上清，将沉淀溶于1.2ml，0.01M，pH7.4 PBS 中，6．0.01M，pH7.4 PBS透析过夜（4℃），其间换液3次，收集透析袋内液体，—20℃保存备用。
高效液相色谱两步法纯化小鼠腹水IgM单克隆抗体
高效液相色谱两步法纯化小鼠腹水IgM单克隆抗体
商澎;田方;陈镔复;金伯泉
【期刊名称】《单克隆抗体通讯》
【年(卷),期】1992(8)2
【摘要】随着单克隆抗体技术的普遍应用,IgM类单克隆抗体的液相色谱分离纯化方法越来越多。
由于IgM分子的特殊性而使得IgM的纯化较为困难,迄今还没有一种特别有效的方法。
除免疫亲和色谱外,IgM的色谱纯化方法多用强阴离子交换色谱柱Mono-Q结合凝胶过滤色谱的两步法;还有45％饱和度(NH_4)_2SO_4盐析后,使用常压凝胶过滤色谱和离子交换色谱纯化。
【总页数】3页(P69-71)
【关键词】液相色谱;单克隆抗体;纯化
【作者】商澎;田方;陈镔复;金伯泉
【作者单位】第四军医大学中心实验室;第四军医大学免疫学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R392－33
【相关文献】
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5.高效液相色谱纯化抗肾综合征出血热病毒血凝素单克隆抗体及特性鉴定 [J], 薛小平;商澎;汪美先;陈镔复;王海涛
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小鼠单克隆抗体的制备与纯化
小鼠单克隆抗体的制备与纯化关键词：细胞骨髓瘤细胞 B细胞培养基试剂标准物质北京标准物质网小鼠单克隆抗体的制备与纯化一般可分为细胞融合、阳性杂交瘤细胞的筛选与单克隆化、单克隆抗体的生产与纯化等过程。
1.细胞融合动物免疫方法与抗血清制各相同。
为保证得到的B细胞有较强的分泌抗体活性，在融合前3天须进行一次静脉加强免疫。
融合时小鼠骨髓瘤细胞(如SP2／0-Ag14细胞株)要处于对数分裂期的良好生长状态，对在无菌条件下获得的小鼠脾脏B细胞需用无血清培养液洗2至3遍，以去除小鼠血清。
融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例一般为5：1至10：1，常用的融合剂为50%的聚乙二醇，完成融合后要用培养液缓慢稀释后离心，除去PEG，然后将细胞用HAT选择培养基(RPMI1640含10%～20％胎牛或小牛血清和HAT悬浮后接种于96孔板中。
正常情况下在融合后的第3、4天在光镜下即可看到克隆的生长，在第10天后可以进行筛选。
PEG虽融合效率较低，但方法简单，成本低廉，故较为常用。
电融合虽融合率较高，但一次融合的细胞数少，且需专门设备，故较少使用。
在融合后的细胞培养过程中，可同时添加同种动物的腹腔细胞(即饲养细胞)，其中的吞噬细胞能清除死亡细胞碎片，有助于杂交瘤细胞的生长。
商品化的杂交瘤细胞生长因子，也可以促进杂交瘤细胞的生长。
2.阳性杂交瘤细胞的筛选与单克隆化杂交细胞经约10～14天培养后(此间要换培养液1～2次)可进行筛选，ELISA是最常用的筛选方法。
对获得的阳性克隆细胞要通过有限稀释法进行亚克隆，以保证抗体分泌细胞来源于单个细胞。
由于融合细胞的染色体容易发生丢失，故一般要通过数次亚克隆，直至来自同一克隆的所有亚克隆细胞均为反应阳性，表明该克隆的抗体编码基因已较稳定，可以扩大培养并建株。
3.单克隆抗体的扩大生产采用什么方法进行单克隆细胞株的扩大培养及抗体制备，取决于实际需要。
目前生产大量单克隆抗体的常用方法有小鼠腹水制备、大瓶培养和中空纤维反应器三种，前者多用于实验室制备，后二者适用于工厂化生产。
腹水的制备
这里还有一个获得腹水经验性步骤，不知道能否帮的了你1) 选用雌性Balb/c小鼠，小鼠一定要健康。
2) 腹腔注射0.5ml石蜡油/鼠，1-2周后（我一般选用注射10天后的小鼠，不过注射3-4周后的小鼠仍可用）腹腔注射细胞。
3) 打腹水时，细胞要处于对数生长期，细胞数量过多过少都不好，我一般是注射10^6/鼠，每株杂交瘤打3只。
4) 约7天后，触摸小鼠腹部有肿胀感时，即可用16号针头采集腹水，针头刺入腹腔后，一般即有腹水喷出，若没有腹水流出，可轻旋针头，操作时要有耐心。
我每次可采集4-5ml 腹水/鼠，有时甚至可达6ml，隔天后再次采集，一般可采集三次左右，每只小鼠可采集十多ml腹水。
有时一只小鼠采到20多ml腹水后仍然活得很好（这也很烦）。
还有一点，采集用的针头要事先灭菌！小鼠对不同杂交瘤细胞的敏感性不同，有的注射后一周即死亡，有的会出现血性腹水，有的可以反复收取腹水2-3次。
我做过2种类别10株细胞的腹水，以下供参考：1、每组细胞准备2只小鼠，8-10周龄，最好与制备单抗的小鼠同系；接种杂交瘤细胞前预先使用致敏剂，可以用石蜡油（提前一周）或不完全弗氏佐剂（提前三天）；2、第一只接种细胞数可以控制在10的6次方，如果出现腹水少、死得快的现象，则第二只小鼠接种细胞数不能超过5*10的5次方；注射细胞少腹水形成慢但效价会更高；3、待第7天左右开始密切观察小鼠的腹水及存活情况，如果活力佳，有明显移动性腹水，可以放腹水2次左右；一旦发现小鼠活动受限，要立即处死放腹水；4、一般每次可以收取2-3ml。
制备小鼠腹水细节剪刀剃毛，酒精消毒止血钳、镊子夹提腹部皮毛小号针头，越细越好，减少损伤eppendorf管或玻璃试管装均可，但要高压灭菌刺入针头时注意先提起腹部皮毛，在腹部中线旁刺入空隙，勿扎住内脏腹水采集分成两类：1：活着是抽取腹水2: 处死抽取腹水活着抽取腹水主要用到的是酒精棉球与注射器（2-5ml）以及灭后菌的eppendorf管(因为腹水还要分离所以用这个最好，便于离心）。
小鼠腹水的纯化
小鼠腹水的纯化腹水制备：1、提前十天免疫，不完全佐剂0.5ml/只。
2、每只老鼠2*105个细胞/只。
试剂：醋酸盐配制：A：0.06mol/L NaAc 0.4926g，加水至100mlB：0.06mol/L HAc 0.344ml，加水至100mlA与B以59:41混合，调整溶液pH值4.8。
（经验值：NaAc 0.3g+HAc 0.14ml 加水至100ml）1、取腹水15000rpm，30离心弃沉淀，取上清。
2、辛酸-硫酸铵沉淀（加下述各种试剂都要在搅拌下缓和逐滴加入NaOH、HCl、硫酸铵）1）取5ml 腹水加2倍（即10ml）醋酸盐缓冲液中，用1M HCl 300μl调pH值至4.8。
（例：32.5ml腹水+HAC buffer 65ml+1.5ml-4M HCl）2）加入165μl辛酸（即11×（5+10））的比例（11:1）体积，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，4℃静置2h，取出15000rpm离心30min，弃沉淀。
3）定性滤纸过滤4）上清中加入1/10V的PBS（大约1.5ml），用1N NaOH（400-800μl）调pH至7.2。
4℃条件下（冰上）加入饱和硫酸铵至硫酸铵终浓度为45%（即15ml）搅拌30min，静置1h，10000rpm离心30min后弃上清。
5）沉淀用PBS（10-15ml）溶解，重复4步操作（不加NaOH）。
例：一般加入22mlPBS 溶解，再加18ml饱和硫酸铵，即终浓度为45%。
6）沉淀用（2ml）PBS溶解，4℃透析过夜（PBS），次日离心后对上清测定OD280后，加NaN3（1-5‰）。
后续可制备抗体亲和柱（详见英文protocol）测定蛋白浓度：将透析后的溶液离心后取上清，做10倍（或20倍）稀释，以所用的PBS透析液为空白和稀释液。
测定OD280（不可信区间：OD＞2；或OD＜0.05）遇到不可信区间应选择继续稀释测定或测定原液。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
小鼠腹水制备的原理
小鼠腹水制备的原理小鼠腹水制备的原理主要包括两个方面：胸腺B细胞的免疫应答和血液与淋巴液的滤过。
首先，胸腺是免疫系统中的一个重要器官，其中主要存在B淋巴细胞。
当小鼠体内存在所谓的"外来"抗原（如蛋白质），免疫系统将启动免疫应答。
B细胞在胸腺中通过特定受体（BCR）结合并识别到外来抗原，这时候会对该抗原进行内化和处理。
内化后的抗原将进入内质网并被加工，最终表达出B细胞表面的MHC-II分子。
在这个过程中，抗原加工和递呈机制会施行一种叫做"适应性免疫"的应答，因为机体需要适应不同类型的抗原。
其次，血液和淋巴液在小鼠体内循环，并经过肝脏和脾脏等器官进行过滤和处理。
血液中的浆液和淋巴液会包含很多溶解性的物质，其中就包括"外来"抗原。
这些"外来"抗原可以通过淋巴系统的滤过进入腹腔。
淋巴系统拥有很多淋巴结，这些结构会对其中的有害物质进行分解和清除。
当血液中的有害物质进入淋巴系统豆状气球肿大以致虚化，在这个层级，淋巴球与外界的相遇被更加从细胞层级进行进行。
因此，腹腔是淋巴系统中能够以各种方式吞噬、清除外界抗原的一个理想场所。
通过以上两个过程，小鼠体内的外来抗原和淋巴液中的有害物质能够通过胸腺B 细胞的免疫应答以及血液和淋巴液的滤过进入腹腔，从而形成腹水。
腹水的组分主要由外来抗原、细胞成分和溶解物质等构成，其组成和性质与疾病或病变有关。
腹水的产生往往伴随着机体免疫系统的应激和病理反应，因此腹水的制备也可以作为一种动物模型来研究相关的疾病机制和治疗方法。
需要注意的是，制备小鼠腹水是一种对动物实验进行的手术技巧，需要遵循相应实验伦理和安全规范，并在合适的实验条件下进行。
制备腹水后，一定要对腹水样本进行相应的分析和处理，以保证研究结果的可靠性。
小鼠腹水中抗人食管癌单克隆抗体的纯化
小鼠腹水中抗人食管癌单克隆抗体的纯化赵云生;张保才【期刊名称】《新乡医学院学报》【年(卷),期】1993(10)1【摘要】研究目的从小鼠腹水中纯化抗人食管癌单克隆抗体。
处理方法小鼠腹水通过羟基磷灰石柱层析后(层析环境温度15℃,起始缓冲液pH6.8,0.01MPB。
流速1ml/min,线性梯度洗脱液500ml,0.1～0.5MPB)。
由酶联免疫过滤法(EIF)鉴别出抗体活性部分。
然后以SDS-PAGE鉴定所得抗体的分子量及其纯度(10％聚丙烯酰胺凝胶,电极缓冲液pH8.3,上样量约50/μg,电流3.5mA/管,考马斯亮兰R-250染色)。
研究结果层析洗脱液经紫外监测A_(280nm)得出三个吸收峰;由EIF作抗体活性鉴定,确证第3个峰为活性部分;SDS-PAGE中于分子量约75KD及30KD处显示两个单一色带,相当于该单抗的重链和轻链。
结论本法纯化所得抗人食管癌单克隆抗体纯度良好。
【总页数】1页(P18)【作者】赵云生;张保才【作者单位】不详;不详【正文语种】中文【中图分类】R735.1【相关文献】1.抗人TIM-3单克隆抗体的纯化及其体外生物学功能的研究 [J], 岳翠华;孙润孜;陈建新;蒋敬庭;卢斌峰2.分离小鼠腹水中抗HBs/a单克隆抗体杂交瘤细胞制备小鼠腹水 [J], 邹汉武;刘琦3.抗人食管癌单克隆抗体和争光霉素A6结合物的制备及其对食管癌... [J], 赵云生;朱洪波4.抗人TDP-43单克隆抗体的制备纯化及效价测定 [J], 吴绍长;刘奕;申子好5.纯化小鼠腹水中抗富含组氨酸糖蛋白单克隆抗体方法的比较 [J], 李志坚;徐克前因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化步骤小鼠单抗是一种通过免疫响应体外制备的抗体，通常通过腹水提取方式来获得。
下面是小鼠单抗腹水纯化的一般步骤：1.小鼠免疫将小鼠注射目标抗原，通常使用免疫佐剂将抗原与免疫系统刺激起来。
免疫期间要注意小鼠的饮食和生活环境，保证其健康状态。
2.收集腹水在免疫后，根据小鼠的体重和免疫剂量，使用注射器从小鼠的腹腔中收集腹水。
使用无菌器具，注意操作过程要无菌。
3.储存和预处理腹水收集到的腹水用离心机离心，去除其中的杂质和细胞。
然后将澄清的腹水分装入无菌离心管中，并进行储存。
4.蛋白质浓缩和沉淀将腹水进行浓缩，可以使用离心或超滤等方法。
浓缩过程中要注意温度和时间的控制，以避免蛋白质降解。
浓缩后的腹水可以进一步进行封冻保存。
5.抗原亲和纯化使用亲和层析柱，将浓缩的腹水与目标抗原相互作用。
亲和层析柱可以选择已经与目标抗原结合的树脂，或者通过动态亲和层析的方法进行柱填充。
6.纯化和洗脱将亲和层析柱上结合的抗原-抗体复合物进行洗脱。
可以使用洗脱液来改变物质之间的亲和力，以实现复合物的解离。
洗脱后的洗脱液可以进行进一步的分析和检测。
7.鉴定和分析对纯化后的抗体进行鉴定和分析，可以使用免疫层析、SDS-、Western blot等方法。
这些方法可以检测纯化后的抗体的纯度、抗体滴度和特异性。
8.储存和保存将纯化后的抗体进行分装并储存，通常以冷冻的形式保存。
在保存的过程中要注意使用无菌的存储容器，避免污染和降解。
以上是小鼠单抗腹水纯化的一般步骤。
根据实际需求和具体实验条件的不同，可能会有所调整。
另外，为了保证实验的安全和可重复性，建议在进行实验前充分了解相关实验操作和操作流程，并遵守实验室安全规范。
小鼠腹水IgG类单克隆抗体的制备及活性研究
小鼠腹水IgG类单克隆抗体的制备及活性研究
李涛;刘代成
【期刊名称】《食品与药品》
【年(卷),期】2007(009)012
【摘要】目的探讨小鼠腹水IgG类单克隆抗体制备及盐析法纯化的最佳条件.方法依次研究诱导剂、小鼠鼠龄及性别对小鼠腹水抗体产量和活性的影响;分别用辛酸-硫酸铵法(CA-AS)、硫酸铵沉淀法(AS)粗提小鼠腹水,比较两种方法所得粗提抗体的活性及IgG回收率.结果弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant,FIA)预处理10～12周龄Balb/c小鼠可显著提高小鼠腹水产量;腹水经CA-AS法纯化后抗体效价为1:3.2×104,IgG回收率为50%～60%,优于AS法.结论弗氏不完全佐剂预处理10～12周龄Balb/c小鼠制备腹水,然后用CA-AS法纯化.
【总页数】3页(P8-10)
【作者】李涛;刘代成
【作者单位】山东师范大学生命科学学院,山东,济南,250014;山东师范大学生命科学学院,山东,济南,250014
【正文语种】中文
【中图分类】R155.6
【相关文献】
1.小鼠腹水IgG类单克隆抗体的制备及活性研究 [J], 李涛;刘代成
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金伯泉
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11.7小鼠腹水纯化
2．方法：
1、把小鼠腹水和binding buffer按1：2或者更高的比例混合，之后用0.45um滤膜过滤。
2、把填料小心的装入合适的柱子中，等待大约30min填料就会沉淀好。
3、用binding buffer平衡柱子直至平衡，测流出液体的pH值为9.0，流速设置为1.00ml/min
4、加入处理好的样品，此时要把流速设置为0.5ml/min
5、继续用binding buffer洗脱杂蛋白直至平衡。
6、用elution buffer洗脱目的蛋白，待等到目的蛋白波峰出现时立即收集。
7、使用洗脱液洗脱柱子直至平衡
8、使用保存液（不含叠氮钠）洗脱直至平衡
9、取出填料用含有叠氮钠的保存液4℃保存。
试验结果
1．纯化得到纯抗体
2．
3．
4．
5．
试验分析
问题分析
1．
2．
3．
4．
5．
结果分析
1．
2．
3．
4．
5．
试验进一步设计方向
问题解决设计
1．
2．
3．
4．
整体试验设计
1．
2．
3．
4．
备注说明
试验记录整理说明：
1．学生每天试验务必进行试验记录，并进行规范整理；此工作为实验进行过程中的例行工作；
2．试验目的、方法应与试验日期当天记录整理；试验结果、试验分析和试验进一步设计应予试验完成后及时记录整理；
试验技能训练记录整理表
实验室名称
动物传染病与基因芯片实验室
试验学生姓名
李俊材
试验日期
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小鼠单抗腹水纯化
一、初纯——辛酸—硫酸铵法
【原理】
在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】
1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml
取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.
0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）
2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml
取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.
0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）
0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）
3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml
称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.
【步骤】
1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
4、12000r/min，4℃，30min，收集上清。
5、上清液经普通滤纸过滤1次，加入1/10体积的10*PBS（0.1M pH7.4）用1M NaOH 调至7.4，冰浴至4℃。
6、根据每ml上述混合液加0.277g固体硫酸铵（0℃条件下，45%饱和硫酸铵为0.291g/ml），冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵，不可一次全部加入，而以小分量分多次慢慢溶入，并不时搅拌，以免造成局部浓度过高。
缓慢加入时为了避免局部的浓度一下子很高，因为硫酸铵不同的浓度是沉淀不同的蛋白为主，这样就可能将不想沉淀的蛋白沉淀下来。
冰浴条件是为了保证蛋白的活性，因为硫酸铵加入到辛酸溶液后会产热。
7、硫酸铵全加入后，再搅拌10-30min，使溶液完全平衡，然后就可以进行离心。
一般采取4℃搅拌30min后，继续静置至少60min（一般过夜）。
再13000r/min，4℃离心30min，弃上清，在短暂离心，将沉淀溶解于少量PBS中。
但如果进行下面的亲和层析，可直接将沉淀溶解于1.5ml结合缓冲液中。
二、亲和层析
【HiTrap Protein AG HP 1ml（Amersham Bioscience）特性】
柱床体积：1ml
柱子大小：0.7*2.5cm
耐受压：0.3mPa
最大流速：4ml/min
建议流速：1ml/min
【protein G】
G组链球菌的表面蛋白，属于III型Fc受体，能以非免疫机制的方式结合IgG Fc区域。
protein G和IgG在pH7.0时有很强的结合能力，而其结合产物的洗脱一般在pH2.5-3是进行。
由于IgG对段敏感，会破坏其生物学活性，故一般在收集管种种加入60-200μl的1M Tris-HCl （pH9.0），一般用100μl/ml洗脱液，这样纯化的IgG最终会中和成中性。
注意：经pH洗脱后在收集管内欲置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。
小鼠IgG单克隆抗体溶液在280nm时。
1.44（吸光单位）相当于1mg/ml。
【缓冲液准备】
1、结合缓冲液：20mM sodium phosphate。
pH7.0 定容至1000ml
称取7.6024g Na3PO4·2H2O（MW380.12），定容置1000ml，调pH至7.0.
2、洗脱缓冲液：0.1M Glycine-HCl，pH2.7 1000ml
称取7.507g Glycine（MW75.07），定容至1000ml，调pH至2.7.
【样品准备】
样品最好用结合缓冲液稀释，上柱前样品过滤（0.22μm滤膜）或离心。
【操作步骤】
1、在收集管中加入100μl的1 MTris-HCl（pH9.0），用于收集1ml的洗脱液。
2、将注射器或泵管充满结合缓冲液。
移去柱子上接口的塞子，用适配的接头子将其连接到注射器或者泵管，一“滴对滴“的方式充满柱子后方可以连接，避免空气进入主子。
3、移去柱子下接口的塞子，扭断即可。
4、用10ml（10个柱床体积）结合缓冲液洗柱子，流速为1ml/min
5、上样：用2ml上样环上样。
6、用5-10ml（5-10个柱床体积）结合缓冲液冲洗柱子，直到流出液中没有杂物质。
7、用2-5ml（5-10个柱床体积）洗脱液进行洗脱。
8、纯化产物可以利用Hi Trap Desalting 或PD-10柱交换缓冲液。
9、纯化结束后，用20%乙醇保存柱子，防止微生物的生长。
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