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生物选修3 知识点

（区别不同工程和不同操作水平）

专题1 基因工程

概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

基本原理：让目的基因在受体细胞内稳定且高效的表达

理论基础：DNA 是生物遗传物质的发现，DNA 双螺旋结构，遗传信息传递方式

核心：构建重组DNA 分子

（1）基本工具（技术基础）

Cf 工具&工具酶

1.限制性核酸内切酶

（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的

（不切割自身 DNA 的原因：原核生物中无该限制酶的识别序列或其已被修饰）（2）功能：识别和切割 DNA 分子内一小段特殊的脱氧核苷酸序列（偶数碱基对回文序列）特异性表现：识别特定片段、切割该片段中的特定位点、形成一种末端

Cf —G↓GATCC— & —↓GATC—

（3）结果：DNA 片段末端形成末端碱基互补的黏性末端或平末端

①用切割（质粒）

②根据目的基因的位置或剪辑序列来确定限制酶的种类

③切割后的片段要画全

2.DNA 连接酶

（1）功能：连接具有末端碱基互补的 2 个 DNA 片段，形成重组 DNA 分子

Cf DNA 聚合酶：只能将单个脱氧核苷酸逐个添加到已有的脱氧核苷酸链之后，

需模板 DNA，连接磷酸二酯键

3.载体

（1）条件：①能在受体细胞中稳定保存并大量复制，基本不影响受体细胞正常生命活动

②一至多个限制酶酶切位点（必须在所需标记基因外），供外源 DNA 片段插入

③标记基因，便于筛选含有重组 DNA 分子的受体细胞

——往往需要根据需求改造天然载体

（2）功能：①作为运载工具将目的基因转移到受体细胞内

——载体选质粒的原因：具有环状结构，能够携带目的基因

②利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制和转录/表达

（3）质粒（最常用的载体）

一种能够自主复制，在细菌(或酵母菌)中独立于染色体之外存在的双链环状 DNA 分子（4）其它载体：噬菌体、动植物病毒

(二)基因工程的基本操作程序

第一步：获取目的基因

1.目的基因：人们所需要的编码蛋白质的结构基因

2.方法

(1)序列已知

①化学合成法——较长 DNA 单链合成过程中容易出现碱基缺失

如反转录法（e.g 获取 mRNA 逆转录成 cDNA 再用 DNA 聚合酶生成双链）

②聚合酶链式反应(PCR)扩增Polymerase Chain Reaction

（1）原料：水、缓冲液、4 种游离脱氧核苷酸、TaqDNA 聚合酶、模板DNA(……基因)

、

对…基因特异的 2 段 DNA 引物（防止相互或自身折叠）

（2）过程：第一步：加热至 90～95℃，DNA 在高温下变性解链

第二步：冷却到 55～60℃，引物结合到互补 DNA 链（退火）

第三步：加热至 70～75℃，热稳定 DNA 聚合酶从引物起始互补链的合成

能量来源于 dNTP

(2)序列未知

建立基因文库：

建立一个包括目的基因在内的基因文库(保存在受体菌中)，再从基因文库中获取

3.目的基因大量扩增/分子水平的克隆

①利用受体细胞（如 E.coli）无性繁殖，利用基因探针钓取，再导入最终受体细胞

e.g 目的基因→大肠杆菌→农杆菌→植物细胞→植物

（主要在细菌分裂时几何级扩增，尽管质粒独立于拟核，可在分裂时发生自我复制，

但由于多数细菌对胞内质粒数量有限制，故该种复制对扩增效果不大）

②PCR 技术

第二步：形成重组 DNA 分子（基因表达载体：启动子＋目的基因＋终止子＋标记基因） 1.目的：转运目的基因，并使在受体内稳定存在、复制、表达/转录并稳定遗传（基因型X

0）

2.过程：（1）单酶切：用同种限制酶分别切割目的基因和载体从而形成相同的粘性末端，

然后用 DNA 连接酶将目的基因和载体连接起来

——有时用不同限制酶也可以形成相同的粘性末端

（2）双酶切：用两种限制酶切割使目的基因和载体两端各形成两种粘性末端，防

止载体和目的基因自身环化

第三步：将重组 DNA 分子导入受体细胞

——需将目的基因整合到动植物细胞的染色体 DNA 上

目的基因是否整合到染色体 DNA 上决定于基因表达载体上是否有相关序列（形成酶

）

1.植物体细胞：农杆菌转化法（插入 Ti 质粒上的 T-DNA），基因枪法、花粉管通道法

——导入叶绿体 DNA 中，由于细胞质/器DNA 的遗传与性别相关联，故可避免因花粉传播而造成基因污染（目的基因传播到非转基因生物中）

2.动物受精卵：显微注射技术

用（如显微注射）技术/方法将目的基因导入 cf 转基因/基因工程技术

3.原核细胞：CaCl2/Ca2+ 处理法（先用Ca2+处理增加细胞壁通透性，使之成为感受态细胞

，

再将重组质粒与感受态细胞混合，在一定温度下感受态细胞吸收 DNA 分子）

——原核生物作为受体细胞的原因：

①繁殖快②体积小新陈代谢旺盛（目的产物合成效率高）③遗传物质少（便于操

作）、

④单细胞（容易培养）

第四步：筛选含有目的基因的受体细胞

1.原因：受体细胞接纳重组DNA 分子存在概率

2.原理：载体如质粒上的抗性基因等标记基因

3.方法：利用选择培养基筛选