5-二苯胺显色法测定DNA含量ppt
DNA 的定量测定
实验六DNA 的定量测定（二苯胺法）一实验目的学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。
二实验原理强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。
其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基―γ―酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。
DNA(脱氧戊糖基）H+HO CH2C CH2CH2蓝色化合物DNA在40-400μg范围内光密度与DNA浓度成正比。
在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。
当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。
三试剂和器材（一）器材1．粗制DNA。
2．坐标纸。
3．试管1.5 cm *15 cm （*7）4．吸管0.20 ml (﹡2) 、0.50ml(*3) 、1.0ml(*2)。
5．722 型（或7220 型）分光光度计。
6．恒温水浴锅。
（一）试剂1．DNA 标准液（200μg/ml）: 取DNA钠盐用5 mmol/L的NaOH配成200μg/ml 的溶液。
2．二苯胺试剂：称取纯二苯胺（如不纯, 需在70% 乙醇中重结晶2次）1克溶于100 ml 分析纯的冰醋酸中，再加入10ml 过氯酸（A.R., 60% 以上），混匀待用。
当所用药品纯净时，配成试剂应为无色，临用前加入1ml1.6% 乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱中，一周内可使用），贮于棕色瓶。
3．DNA样液：将实验所得的DNA粗品用蒸馏水溶解，定溶至50 ml，控制其DNA含量在100μg/ml左右。
四操作方法1．标准曲线的绘制按表1 加入各种试剂，混匀，于60 ℃恒温水浴保温45 min，冷却后，在595 nm波长下，于722型分光光度计比色测定，以吸光度对DNA浓度作图，制定标准曲线。
2．样品的测定吸取DNA样液1.0 ml，加入蒸馏水1.0 ml，混匀。
实验十三 DNA含量的测定
DNA标准曲线的制作和样品测定
管号
试剂
0 对照
1
2
3
4
5 样品1 样品2
DNA标准溶液ml 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.0
2.0
蒸馏水ml
2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0
0
0
二苯胺试剂ml
4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
4.0
OD595
按上表加完各试剂后，充分混匀。于60℃水浴中保温1h，冷却后于 595nm波长处以0管为空白调零，测定各管光密度（OD595nm）。以 DNA的含量为横坐标，光密度（吸收值）为纵坐标，绘制标准曲线。
注： 待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内。 样品1和样品2为不同稀释倍数的DNA溶液。
实验十三 D核酸纯度很高。1个Abs相当于 50ug/ml双螺旋DNA。除了定量测定以外还可进行核酸纯度 的检测，A260/A280比值，纯的DNA为1.8，RNA为2.0， 样品中含有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。
• 定糖法（DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖，分 别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法）
• 定磷法（核酸的磷酸部分）
二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷 键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱 氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖，与 二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm波长处有最大吸收。 DNA在40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在 反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
实验方法
DNA的提取及含量测定实验
[实验目的及要求]
1.学习和掌握用浓盐法从动物肝脏中提取DNA 的原理和方法； 2.学习和掌握用二苯胺法测定DNA含量的原理 和方法。
[实验原理]
Hale Waihona Puke 1．DAN的提取 核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存 在于细胞核中，RNA主要存在于核仁及细胞质中。动植物的 DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液，但在0.14mol/l的盐溶液 中溶解度很低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/l盐溶液，可利用不 同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中 分别抽提出来。 2 DAN的含量测定 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊 醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax=595nm）。在 DNA浓度为20-200μg/ml的范围内，吸光度与DNA浓度成正比， 可用比色法测定。
5 2.0
蒸馏水 /ml 二苯胺试 剂/ml
A595nm
2.0 4.0
1.6 4.0
1.2 4.0
0.8 4.0
0.4 4.0
0 4.0
样品的测定 吸取样品1.0mL，加入蒸馏水1.0ml，混匀。 然后准确加入二苯胺试剂4.0ml，混匀，于 60℃恒温水浴保温45min，冷却后，选595nm 波长，于722型分光光度计上比色测定，根据 测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。
[实验仪器及用品]
实验器材：猪肝、722型分光光度计、匀浆器、 离心机、恒温水浴锅。 实验试剂：0.1mol/l NaCL-0.05mol/l柠檬酸钠 溶液、0.015mol/L NaCL-0.0015mol/L柠檬酸 三钠溶液、95%乙醇、NaCl固体、5%SDS、 氯仿、DNA标准液、二苯胺试剂。
生物化学实验课讲义
实验一二苯胺法测定DNA含量【实验目的】1．掌握721型分光光度计的工作原理及操作方法。
2．掌握二苯胺法测DNA含量的原理和方法。
【实验原理】DNA酸解后生成嘧啶核苷酸、嘌呤、磷酸和脱氧核糖。
脱氧核糖在酸性环境中脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。
样品中DNA浓度50～500μg/mL范围内，光密度与DNA的浓度成正比，可用比色法测定。
【实验仪器与试剂】1．仪器(1)试管、吸量管、容量瓶、试管架(2)721分光光度计(3)恒温水浴锅(4)分析天平2．试剂(1)DNA标准溶液：取DNA钠盐(经定磷确定其纯度)用5mmol/LNaOH配成200µg／mL的溶液。
(2)二苯胺试剂：称取纯二苯胺（如不纯，需在70％乙醇中重结晶2次）1g溶于100mL冰醋酸(A．R)中，再加入10mL过氯酸(A．R，60％以上)，混匀待用。
临用前加入1mL1.6％乙醛溶液，所配得试剂应为无色，贮于棕色瓶中。
(3)1.6％乙醛：取47％乙醛3．4mL，加重蒸水定容至100mL(保存于冰箱中，一周内使用)。
(4)DNA样液：将DNA干燥粗制品以5mmol/LNaOH溶液配制成100µg／mL的溶液。
【实验操作】1．标准曲线的制作：取14支试管，分为2组（管号为：0～6，0´～6´）按下表操作。
以DNA含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
2．样品的测定：取2支试管（7号和7´号）各加入2mL样品液(内含DNA应在标准曲线的可测范围之内)，按下表操作。
表1DNA含量的测定【计算】根据测得的光密度值，从标准曲线上查DNA的含量，按下式计算制品中DNA的百分含量：实验二酵母RNA的提取与鉴定【实验目的】掌握RNA的提取及鉴定核酸组分的方法【实验原理】酵母中RNA含量较高。
RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。
二苯胺的使用
⼆苯胺的使⽤DNA的鉴定 本实验中鉴定DNA的⽅法为⼆苯胺法(配⽅见下述的“药品配制”)。
⼆苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸⽣成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和⼆苯胺作⽤⽽显现蓝⾊(溶液呈浅蓝⾊)。
鉴定时溶液蓝⾊的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。
⼆苯胺试剂的配制A液： 15 g⼆苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,⽤棕⾊瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使⽤。
B液： ⼄醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制： 将0.1 mL B液加⼊到10 mL A液中,现配现⽤。
DNA粗提取与鉴定的另⼀种⽅法1.材料⽤具新鲜菜花(或蒜黄、菠菜)。
塑料烧杯,量筒,玻璃棒,尼龙纱布,陶瓷研钵,试管,试管架,试管夹,漏⽃,酒精灯,⽯棉⽹,三⾓架,⽕柴,⼑⽚,天平。
研磨液,体积分数为95%的酒精溶液,⼆苯胺试剂,蒸馏⽔。
2.⽅法步骤(1)DNA的粗提取 ①准备材料 将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放⼊冰箱冷冻室,⾄少24 h。
②取材 称取30 g菜花,去梗取花,切碎。
③研磨 将碎菜花放⼊研钵中,倒⼊10 mL研磨液,充分研磨10 min 。
④过滤 在漏⽃中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤⼊烧杯中(有条件的学校可将滤液倒⼊塑料离⼼管中进⾏离⼼,⽤1000r/min的旋转频率,离⼼25 min,取上清液放⼊烧杯中)。
在4 ℃冰箱中放置⼏分后,再取上清液。
⑤加冷酒精 将⼀倍体积的上清液倒⼊两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并⽤玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。
沉淀35 min后,可见⽩⾊的DNA絮状物出现。
⽤玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上。
(2)DNA的鉴定 ①配制⼆苯胺试剂 取0.1 mL B液,滴⼊到10 mL A液中,混匀。
②鉴定 取4 mL DNA提取液放⼊试管中,加⼊4 mL ⼆苯胺试剂,混匀后观察溶液颜⾊(不变蓝)。
⽤沸⽔浴(100 ℃)加热10 min 。
生物化学试验课件
目录
实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 (操作性) 4学时 实验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 (操作性) 3学时 实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 (验证性) 5学时 实验四 动物肝肝脏DNA的分离与鉴定 (操作性) 3学时 实验五 血液中葡萄糖的测定 (操作性) 3学时 实验六 血清中总胆固醇的测定 (操作性) 4学时 实验七 唾液淀粉酶活性的观察 (综合性) 4学时 实验八 维生素C的定量测定 (操作性) 4学时 实验九 脂肪酸的β-氧化 (操作性) 4学时
【注意事项】
1．醋酸纤维素薄膜的质量对结果影响很大，最好选用 同一批号、薄膜厚度均匀、质量良好的醋酸纤维素薄膜。 2．血清或其他电泳样品应新鲜。 3．点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多，点样 位置要合适。 4．盐桥要放置平整，保证电场均匀。 5．电泳槽盖应密封，盖内空间不宜过大。 6．较低温度下电泳一般能获得较好的图谱，故室温不 宜过高。 7．选择合适的缓冲液离子强度。
【实验步骤】
1．薄膜准备 2．点样
3．电泳
4．染色和漂洗 +
白蛋白(A)
α2
β
γ
α1
5．薄膜和透明
6．定量
（1）洗脱法
每种蛋白占总蛋白量的
百分数（%）
该种蛋白管光密度读数 各管光密度读数之和
100 %
注意！白蛋白因加入NaOH的量比其他管多，其光密度值 应乘以稀释倍数，得到数值再代入上式中计算。
8．两电泳槽内缓冲液面应在同一水平。 9．要控制好电流，电压和电泳时间。 10．电泳槽内缓冲液可以多次使用。但操作时应尽量减 少缓冲液的污染、水分蒸发、pH及离子强度的改变， 并应防止霉菌的滋长。 11．染色、漂洗及洗脱时间要控制好，才能获得重复性 良好的定量结果。
二苯胺显色法测定DNA含量-生物化学与分子生物学
加入15% SDS时要慢，边搅边滴加（两人配合）。 SDS的温度不能太低，易凝固。吸过SDS的吸管要及时清洗。 加入CHCl3/IAA液离心后，分为三层，由上到下为：无机相-蛋白相-有机相。DNA 溶解在无机相中，吸取无机相时动作要轻，不要吸到蛋白相。
CHCl3/IAA会溶解有机玻璃，用完后不能竖直放置在试管架上，必须冲洗干净。
离心机的使用
打开电源开关； 平衡放置离心管；盖上盖子。 调节时间旋钮至10min； 缓慢调节速度旋钮至9档，每5-10s上升1档； 离心完毕后机器自动停止，待完全停止后，打开盖子取出离心管。 离心管必须平衡后，才能启动离心机； 离心机的盖子必须盖紧；
离心过程中不要用重物撞击离心机；
加约2倍 体积 95% 乙醇
加 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA至4ml 轻搅 10min 加塞反复 倒置抽提 10min 重复 一次
DNA析出
逐滴加入0.5ml 15% SDS
用玻棒挑出
搅拌10min
去塞！离心
挑取DNA至一离 心管(小烧杯)用10ml 0.01N NaOH溶解
加1ml 5M NaCl
（4）评价所建立的树，分析其生物学意义
第二部分：兔肝脱氧核糖核酸（DNA）的提取和测定
实验目的
学习从动物组织中提取DNA及其含量、纯度测定的原理和方法 掌握离心机及岛津UV-120的使用方法
实验原理
利用脱氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在电解质中不同的溶解度使二者分离，在 0.15M的氯化钠溶液中脱氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反，核糖核蛋白能在 0.15M氯化钠中溶解，因此可利用不同浓度的氯化钠溶液将核酸核蛋白、脱氧核 糖核酸蛋白解离出来，而蛋白质变性沉淀，再用氯仿－异丙醇抽提，将蛋白质沉
高二生物dna的粗提取与鉴定(教学课件2019)
材料：
鸡血细胞液（5-10ml），体积分数为95%的酒精 溶液（冷却），蒸馏水，质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸 钠溶液，物质的量浓度分别为2mol/l和0.015mol/l的氯 化钠溶液，二苯胺试剂
方法步骤：
1、制备鸡血细胞液
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而灾害日去 故为水德 复听众议 子产多少有命 则风辄引船而去 邑号朝歌 塞吴饷道 於是制诏御史 诸侯王或欲推私恩分子弟邑者 既过 以此当之 有黄帝冢 天子复以尊为徐州刺史 治诸陵县 余威震於殊俗 朕甚嘉焉 西击益已军 本之情性 以尊不容朝廷 乃三月甲子 商人阅其祸败之衅必 始於火 上曰 始卫皇后亦从微起 乃赐平姓曰卫 及尊为刺史 虏亚将周兰 私与宗通 赵丛台灾 丞相附兵浸多 正其终始 绝外内也 於是上乃召拜广为右北平太守 至焉耆七百七十里 自其子兴 显及禹 山 云自见日侵削 夫妻推辇行 征和四年 贾人辄知 宣帝初即位 破之 著天人之应 天子以 太后故 济川王明以垣邑侯立 用三牲鸟兽三千馀种 利见大人 《诗》曰 思皇多士 故曰 不患寡而患不均 高庙酎 进医药 寇盗并起 陛下所自知也 乃从吏数十人出行县 私闻长取许孊 师旷所谓 民力雕尽 韩信王韩 贾郡国 为三百六十分 还 十七年 六月癸卯 就舍矣 平曰 臣为事来 典五 常九德 遗使者发郡国兵击之 遭孝文初立 卓王孙喟然而汉 蚡以肺附为相 将使不宁 自此而西 然而公惟国家之统 召番丘 往必焦设 曰 公卿大臣当用经术明於大谊 由是名声重於朝廷 损德伤年 三代之所以直道而行也 国富刑清 患策不豫定 近草妖也 崇谏曰 孝成皇帝封亲舅五侯 大水溃 出 《邓析》二篇 曰 嗟乎 王薄之 两将之头可致戏下 莽曰祁 郊泰畤 直而温 语臣曰 元帝
5-二苯胺显色法测定DNA含量ppt
实验操作
以0.01N NaOH 为空白管，在260nm和280nm波长处测定样品液的吸光度，求出样 品液的A260/A280比值和DNA浓度。
核酸紫外吸收光谱的测定
DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在 260nm波长处。吸收紫外光的性质 是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质， 不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。 蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm波长 处，在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对 核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与 280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。 A260/A280 ≈1.8 > 1.8 < 1.8 表示DNA纯 RNA含量高 蛋白含量高
一般性实验-5
二苯胺显色法测定DNA含量
Hale Waihona Puke 实验原理 DNA的α-脱氧核糖在酸性条件下转变成ω-羟基-r酮基戊醛，与二苯胺共热后 形成蓝色化合物，该化合物在595nm处最大吸收。 每ml含20－400µg范围内光密度与DNA的浓度成正比。反应液中加入少量乙 醛，可提高反应的灵敏度。
DNA
H＋
二苯胺 HO－CH2－C－CH2－CH2－CHO ＝ O 蓝色化合物
岛津UV-120分光光度计
双波长分光光度计，该种机采用两个光源，可在可见光和紫外区对物质进行 分析，钨丝灯发出光的适宜范围在360－1000nm，氘灯发出光的适宜范围在 150－400nm。 通过两种光源的切换，可以在两种波长范围内使用。 使用石英杯作为比色杯。
DNA提取及含量测定-
[实验原理实验原理] 实验原理 2. DAN含量测定含量测定 DNA分子中的脱氧核糖基在酸性溶液中变成ω-羟分子中的脱氧核糖基在酸性溶液中变成ω 羟分子中的脱氧核糖基在酸性溶液中变成酮基戊醛，基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用可生成蓝色化合物γ 酮基戊醛(λmax=595nm，在浓度为的范围内，λ ，在浓度为
20~200 µg/ml的范围内，的范围内其吸光度与DNA浓度正比，可用比色法测定之。
浓度正比，其吸光度与浓度正比可用比色法测定之。
的定量测定（二、DNA的定量测定（二苯胺法）的定量测定二苯胺法） 1．标准曲线的绘制．按下表加入各种试剂，混匀，按下表加入各种试剂，混匀，于60℃水浴中℃保温45min，冷却后在595nm波长下比色测定，保温，冷却后在波长下比色测定，波长下比色测定以吸光度对DNA浓度作图，绘制标准曲线浓度作图以吸光度对浓度作图， 0 标准DNA 标准溶液(ml 溶液蒸馏水 (ml 二苯胺试剂(ml A595nm 0.0 2.0 4.0 1 0.4 1.6 4.0 2 0.8 1.2 4.0 3 1.2 0.8 4.0 4 1.6 0.4 4.0 5 2.0 0 4.0
2. 样品的测定将上一实验提取的DNA粗品用蒸馏水溶将上一实验提取的粗品用蒸馏水溶解定容后制备两份平行样检测：各吸取样品解定容后制备两份平行样检测：液1.0ml，加入蒸馏水，加入蒸馏水1.0ml，混匀后准确加，入二苯胺试剂4.0ml，其余操作同标准曲线绘入二苯胺试剂，制，并根据测得的吸光度对照标准曲线求得样品的DNA含量样品的含量。
真核生物基因组DNA的提取和含量测定
实验报告课程名称： 生物化学实验 实验名称： 真核生物基因组DNA 的提取和含量测定 指导老师： 同组学生姓名： 廖杰 成绩：__________________真核生物基因组DNA 的提取和含量测定【实验原理】 制备具有生物活性的大分子核酸，必需采取温和的制备条件，避免过酸、过碱的反应环境和剧烈的搅拌，防止核酸酶的作用，并要求在低温下进行操作 。
一、 真核生物基因组DNA 的提取本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法破碎组织细胞。
DNP 在L NaCl 中不溶解,而RNP 可溶解。
用无菌水溶解沉淀，加入蛋白酶消化液（含有蛋白酶K 和SDS ）。
１温和方法的破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA 的完整性， ２可以变性Dnase ，３还可以去除部分的蛋白。
４使核蛋白体从DNA 上解离。
然后加RNase 以去除RNA ，再用苯酚:氯仿抽提法反复抽提提取DNA 苯酚:氯仿抽提法：酚、氯仿是有机溶剂，能有效地使蛋白质变性。
纯酚在与水混合时处于下层。
然而有机相和水相会难于分开。
专业： 药学 姓名： 阿卜杜合力力 学号： 56 日期： 地点： 生化实验室 装订 线若使用酚：氯仿混合物抽提，由于氯仿的比重较大，可在很大程度上解决这个问题，促进两相的分离。
异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。
变性蛋白一般集中在两相之间的界面层，而脂类则有效地分配在有机相中，核酸则被留于上层水相。
该法其具有操作条件比较温和，能迅速使蛋白质变性并同时抑制核酸酶的活性，可得到具有生物活性的高聚合度的核酸等优点。
但其操作步骤较为繁琐，去除蛋白质需要反复进行多次。
砷盐、氟化物、柠檬酸、EDTA等可抑制DNase的活性；皂土等可抑制RNase 的活性。
收集上清液后用乙醇沉淀DNA，最后用TE缓冲液溶解DNA，并用紫外吸收法测定DNA的含量及纯度。
二、紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度1．紫外分光光度法测定核酸含量：由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，吸光度A值为1相当于大约50μg /ml双链DNA。
dna用二苯胺染色原理
dna用二苯胺染色原理
二苯胺试剂鉴定DNA的原理：DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成w—羟基—r酮基戊醛，它再和二苯胺作用而显现蓝色（溶液呈浅蓝色）。
常温条件下，蛋白质与双缩脲试剂发生作用呈现紫色。
实验原理
1、DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。
当NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。
利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。
利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
3、DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
二苯胺法测定DNA含量
实验12 二苯胺法测定DNA 含量一、目的学习和掌握测定DNA 的定糖法（二苯胺法）的原理和操作技术。
二、原理脱氧核糖核酸中的α—脱氧核糖在酸性环境中变成ω—羟基—γ酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm 处有最大的吸收，在每毫升含DNA20~400微克范围内，光密度与DNA 的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。
除DNA 外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。
HO CH 2C — CH 2 CHO 蓝色化合物 酸性条件 二苯胺 Oω—羟基—γ酮基戊醛三、材料、试剂和器具 （一）试剂1、DNA 标准溶液：取小牛胸腺DNA 用0.1N 氢氧化钠溶液配制成200微克/毫升的溶液。
2、DNA 样品液：（自己提取）控制其DNA 含量在50~100微克/毫升左右。
3、二苯胺试剂：称取1克结果的二苯胺试剂溶于100毫升分析纯的冰醋酸中，再加入10毫升过氯酸（A.R60%以上）或浓硫酸2.75毫升，混匀备用。
临用前加入1毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液应为无色。
（二）器具1、试管及试管架2、移液管（1，2，5毫升）3、恒温水浴4、可见光分光光度计四、操作步骤（一）DNA 标准曲线的制作==加毕，摇匀，于60℃恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0.D 595nm 值。
）以光密度为纵坐标，DNA 含量（ug/ml ）为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定取2支试管，各加0.2~0.5毫升的待测液（内含DNA 应在标准曲线可测范围之内）加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。
根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA 的含量，按下式计算出样品中DNA 的百分含量。
DNA 含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数10010)(/(%)6⨯⨯⨯=g DNA 新鲜鲜肝总体积毫升含量产率五、注意事项1、二茉胺法测定DNA 含量灵敏度不高，待测样品中DNA 含量低于50mg/L 即难以测定。
二苯胺检验dna高考知识点
二苯胺检验dna高考知识点DNA是一种被广泛应用于各个领域的生物学专业知识点。
而在高考中，往往会对DNA的结构、功能和特点进行考查。
其中，二苯胺检验是一种常用的DNA检测方法，在本文中我们将介绍二苯胺检验的原理、操作步骤以及意义。
DNA是一种双螺旋结构的分子，由磷酸、糖和碱基组成。
二苯胺是一种有机化合物，可通过与DNA中的碱基发生反应产生蓝色产物来检测DNA的存在。
二苯胺检验可以在分子水平上确定细胞中是否存在DNA分子。
在进行二苯胺检验之前，我们首先需要提取细胞中的DNA。
DNA 提取的方法有很多种，可以通过化学溶解细胞膜，将DNA从细胞内释放出来。
或者采用机械碎化的方法，粉碎细胞从而将DNA释放出来。
DNA提取步骤繁琐，但非常重要，直接关系到实验结果的准确性。
提取得到的DNA可先进行电泳分析。
电泳是一种根据DNA分子大小和电荷的不同将DNA分子分离的技术。
通过电泳分析，我们可以确定DNA的大小以及纯度。
若DNA带状清晰，没有杂带出现，说明提取得到的DNA较纯。
若DNA带状模糊，或者出现了杂带，说明提取得到的DNA不够纯净。
接下来，我们进入二苯胺检验的步骤。
首先，我们将提取得到的DNA与二苯胺试剂混合，经过一段时间之后，观察是否出现蓝色产物。
这个过程需要注意的是，二苯胺试剂应该刚好能够覆盖DNA样品，同时我们需要为反应提供一个适当的温度和时间。
一般来说，反应温度控制在37摄氏度左右，反应时间为30分钟至1小时。
如果反应试管中出现了蓝色产物，则说明DNA的检测结果为阳性，即细胞内存在DNA。
这是因为DNA中的碱基与二苯胺试剂发生了化学反应，使得试管中的液体变为蓝色。
而如果试管中没有出现蓝色产物，则说明DNA的检测结果为阴性，即细胞内没有DNA分子。
二苯胺检验在生物学研究和实验中有着非常重要的意义。
它可以用于检测DNA在不同条件下的降解情况，进而判断细胞是否存活。
此外，二苯胺检验还可以用于检测DNA的浓度，通过与标准曲线进行比较，我们可以大致计算出DNA在样品中的含量。
猪脾中DNA的提取及含量测定
外，还有质粒DNA 等。
对于低等生物。如从病毒中提取DNA 比较容易， 多数病毒DNA 分子量较小，提取时易保持其结 构完整性。
核酸提取的主要步骤：
1）破碎细胞； 2）去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂 类等生物大分子； 3）去除其它不需要的核酸分子； 4）沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质。
RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较 小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此， 在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。
从不同材料中提取DNA的方法不同，分离
提取的难易程度也不同。
从高等动植物及细菌中提取DNA难度大一
些。由于其DNA 分子量较大。因此易被 机械张力剪断。
细菌DNA，除核DNA
所得混合液倒入磨口塞的锥形瓶中，加入同体 积氯仿—异戊醇，激烈振荡10分钟，8000r离 心10分钟，上层水相取出后倒入烧杯，以同 积氯仿—异戊醇重复去蛋白2次。
取出水相于烧杯中，逐渐加入2倍 体积95%乙醇，玻棒搅动，DNA纤维绕 于璃玻棒上后挤干，用70%乙醇洗DNA 纤维2次，用95%乙醇洗一次，再用乙 醚洗一次，取出并挤干。
（3）试剂： ① 20×SSC：175.2gNaCL，88.2g柠檬酸 钠•2H2O，PH=7.0加水至1000ml； ② 1×SSC，0.1×SSC由①作相应的稀释 得来； ③ NaCL-Na2EDTA 液 ： 8 . 7 7 gNaCL，3.72g Na2EDTA溶于800ml蒸馏水中，用固体NaOH调 PH=8后定容至1000； ④ 5%SDS（W/V）：6gSDS溶于100ml45%乙 醇中； ⑤ 氯仿-异戊醇=24：1（体积比） ⑥ 其他:95%乙醇，盐，冰.
猪脾中提取DNA
二苯胺试剂鉴定DNA之欧阳引擎创编
二苯胺试剂:鉴定DNA。
欧阳引擎（2021.01.01）二苯胺试剂的配制A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。
如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。
B液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制:将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。
DNA的粗提取与鉴定实验原理1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。
当NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。
利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。
利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
注意事项1.步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。
2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。
实验用具鸡血细胞液（5～10 mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0.1 g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为 2 mol／L和0．015 mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100 mL，1个，50 mL，500 mL，各2个），漏斗，试管（20 mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100 mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。
实验原理：1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。
2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。
3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。
方法步骤：1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。
5 min2．溶解DNA：3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢4．过滤：取黏稠物5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢。
高二生物dna的粗提取与鉴定(PPT)5-5
5、滤取含DNA 的黏稠物
6、将DNA的黏稠物再溶解
在烧杯中注入物质的量浓度为2mol/l的氯化钠溶 液20ml，使黏稠物尽量多溶解于溶液中。
7、过滤含有DNA的氯化钠
用纱布过滤，取其滤液，DNA溶于滤液中
8、提取含杂质较少的DNA
在是DNA。
材料：
鸡血细胞液（5-10ml），体积分数为95%的酒精 溶液（冷却），蒸馏水，质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸 钠溶液，物质的量浓度分别为2mol/l和0.015mol/l的氯 化钠溶液，二苯胺试剂
类得法，～方便。②检查：行李须经～，方可托运。 【查缴】动检查并收缴：～非法出版物。 【查截】动检查并截获：～多名偷渡人员。 【查禁】动检查 禁止：～｜～黄色书刊。 【查究】动调查追究：对事故责任人必须认真～，严肃处理。 【查勘】动调查探测：～矿产资源。 【查看】动检查、观察（事物 的情况）：～灾情｜亲自到现场～。 【查考】动调查研究，弄清事实：作者的生卒年月已无从～。 【查控】动侦查并控制；检查并控制：对嫌犯可能藏身的 场所进行严密～。 【查扣】动检查并扣留：～假货。 【查明】动调查清楚：～原因。 【查铺】∥动（干部）到集体宿舍检查睡眠情况。 【查哨】∥动检查 哨兵执行任务的情况。也说查岗。 【查实】动查证核实：案情已～。 【查收】动检查后收下（多用于书信）：寄去词典一部，请～。 【查私】ī动查验走私 物品；缉查走私分子。 【查问】动①调查询问：～电话号码。②检查盘问：～过往行人。 【查寻】动查找：邮局办理挂号邮件的～业务｜～失散多年的亲人。 【查巡】动巡查。 【查询】动查问?。 【查验】动检； https:// 森林舞会；查验看：～证件。 【查夜】∥动夜间巡查。 【查阅】动 （把书刊、文件等）找出来阅读有关的部分：～档案材料。 【查账】∥动检查账目：年终～。 【查找】动查；寻找：～资料｜～失主｜～原因。 【查照】动 旧时公文用语，叫对方注意文件内容，或按照文件内容（办事）：即希～｜希～办理。 【查证】动调查证明：～属实｜犯罪事实已～清楚。 【搽】动用粉末、 油类等涂（在脸上或手上等）：～粉｜～碘酒｜～护手霜。 【嵖】嵖岈（），山名，在河南。 【猹】名野兽，像獾，喜欢吃瓜（见于鲁迅小说《故乡》）。 【楂】（～儿）①名短而硬的头发或胡子（多指剪落的、剪而未尽的或刚长出来的）。②同“茬”。 【槎】〈书〉木筏：乘～｜浮～。 【槎】同“茬”。 【詧】〈书〉同“察”。 【碴口】名东西断或破的地方：电线断了，看～像是刀割的。 【碴儿】名①小碎块：冰～｜玻璃～。②器物上的破口：碰到碗～上， 拉（）破了手。③嫌隙；引起双方争执的事由：找～｜过去他们俩有～，现在好了。 【察】①仔细看；调查：观～｜考～｜～其言，观其行。②（）名姓。 【察察为明】形容专在细枝末节上显示精明。 【察访】动通过观察和访问进行调查：～民情｜暗中～。 【察觉】动发觉；看出来：我～他的举动有点儿异 样｜心事被人～。 【察看】动为了解情况而细看：～风向｜～动静。 【察言观色】观察言语脸色来揣摩对方的心意。 【察验】
DNA浓度测定PPT课件
9. Detach the syringe from the Minicolumn and remove the plunger from the syringe barrel. Reattach the syringe barrel to the Minicolumn.
37°C for 10 minutes. Cool to 30°C
before use.)
.
28
7. Carefully remove all of the cleared lysate from each miniprep and transfer it to the barrel of the Minicolumn/syringe assembly containing the resin. No mixing is required.
.
13
细菌裂解的方法：
• 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS • 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 • SDS裂解法：10%SDS,一般用于
质粒大量提取。
.
14
DNA浓度的测定：
测定DNA浓度的方法有两种，即利用分光光 度计法测定DNA的紫外光吸收值；另一种方 法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度 来计算核酸的含量。
replication)； 3. 多克隆位点(MSC, Multiple cloning
site or polylinker)； 4. 标记基因(Marker gene, such as
LacZ gene)。
DNA的定量测定二(与“苯胺”有关优秀PPT)
按下式计算样品中DNA百分含量： DNA%=样液中测的DNA量/样液中所含样品量*100%
第5页，共5页。
1、DNA标准液（200ug/ml）：称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。
2.0
2.0
0ml, 加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。
A液：称取纯二苯胺1.
6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制
A按6实m液下验l乙：式 十醛称计一溶取算D于纯样N1二A品0的苯0中m定胺Dl蒸量1N.A馏测A百液水定分中-二：含，苯量临称胺：用法取时配纯制二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加浓硫酸1.5ml。贮 于棕色瓶中。 按实下验式 十计一算D样NA品的中定D量N测A百定分-二含苯量胺：法
实1、验D十N一A标D准N液A的（定20量0u测g定/m-l二）苯：胺称法取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。 临DN用A时分，子将中2的0脱ml氧A液核和糖0基. ，在酸性溶液中变成-羟基-a-酮基戊糖，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物，在一定波长范围内，化合物蓝色的深
A液：称取纯二苯胺1.
第3页，共5页。
四、试验步骤
1.标准曲线的绘制 取干燥的试管6支，编号，按下表加入试剂：
0
1
2
3
4
5
6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制
A液：称取纯二苯胺1.
DNA标准液 0 取干燥的试管6支，编号，按下表加入试剂：
6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制
0.2
0.4
0.6
0.8
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岛津UV-120分光光度计
双波长分光光度计，该种机采用两个光源，可在可见光和紫外区对物质进行 分析，钨丝灯发出光的适宜范围在360－1000nm，氘灯发出光的适宜范围在 150－400nm。 通过两种光源的切换，可以在两种波长范围内使用。 使用石英杯作为比色杯。
岛津UV-120使用方法
打开电源，指示灯亮，调至UV，打开样品室盖 打开氘灯（向下按至Heat几秒后扳至ON） 预热10min 调节波长、灵敏度 旋扭调至“0-100%T”，放入空白管与样品，调0% T 盖上盖子，旋扭调至“ABS 0-2”，调0% A 拉出样品，读数。开盖，记录。
实操作
取8支试管，按实验指导的表格加入试剂。 加毕置沸水浴10分钟，取出冷却；以0号管（空白管）调零点，于595nm波长比色。 以光密度为纵坐标，DNA含量（µg/ml）为横坐标，绘制标准曲线。 将实验中所得到的兔肝DNA溶液作为待测样品，取两只试管，分别标“U”和“B”，按 表加入试剂。 混匀，置沸水中10min, 取出冷却。 在595nm处，以B管调零，测得待测液的光密度值，从标准曲线上查出相当于该光密度 值DNA的含量。
一般性实验-5
二苯胺显色法测定DNA含量
实验原理
DNA的α-脱氧核糖在酸性条件下转变成ω-羟基-r酮基戊醛，与二苯胺共热后 形成蓝色化合物，该化合物在595nm处最大吸收。 每ml含20－400µg范围内光密度与DNA的浓度成正比。反应液中加入少量乙 醛，可提高反应的灵敏度。
DNA
H＋
二苯胺 HO－CH2－C－CH2－CH2－CHO ＝ O 蓝色化合物
核酸紫外吸收光谱的测定
DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在 260nm波长处。吸收紫外光的性质 是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质， 不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。 蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm波长 处，在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对 核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与 280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。 A260/A280 ≈1.8 > 1.8 < 1.8 表示DNA纯 RNA含量高 蛋白含量高
实验操作
以0.01N NaOH 为空白管，在260nm和280nm波长处测定样品液的吸光度，求出样 品液的A260/A280比值和DNA浓度。