噬菌体裂解液的制备和菌种的保藏、噬菌体效价的测定、细菌转导测定、凝聚反应、沉淀反应
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[实验材料]
菌种：大肠杆菌E.coliK12 Fgal+（双重溶源菌，含有λ噬菌体和缺陷型噬菌体λdg的基因组，发酵半乳糖）；大肠杆菌E. coliK12Sgal-（非溶源菌，对噬菌体敏感，不发酵半乳糖）
培养基：牛肉膏蛋白胨固体及液体培养基、加倍肉汤培养基、半固体素琼脂、磷酸盐缓冲液（0.1mol/L,pH7.0）、无菌水、氯仿、EMB培养基
四、沉淀反应
在沉淀反应中，我组为观察到明显现象，他组偶见沉淀线，借此可以排除抗原或抗体变性或不能特异性结合的可能。由教材克制，双向琼脂扩散法是将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶版小孔中，两者互向对方扩散，相遇后若特异性结合且比例适当，形成乳白色沉淀线。因此我组不能得到沉淀线的可能原因为：①抗原与抗体的比例不合适；②素琼脂层太薄，孔洞太浅不能盛装足够的抗原与抗体，导致二者不能扩散直至相遇形成沉淀。
从实验结果易得：由 ， 两个稀释度的噬菌体悬液所获得的噬菌斑算出的噬菌体效价存在显著差异。可能原因：①10倍系列稀释操作不当造成所获得的裂解液的噬菌体浓度不成10倍关系；②接种噬菌体前未将稀释好的噬菌体悬液摇匀，导致所取悬液的噬菌体浓度并非想要的浓度。
二、细菌转导的测定
（1）点滴法
该实验为定性实验。在点滴法转导实验中，F菌标记处是阳性对照，长出的菌落为紫色带金属光泽的菌落。λ标记处是空白对照，只有噬菌体，没有受体菌，不能长出菌落。S菌标记处是阴性对照，由于S菌不能发酵半乳糖，形成的菌落是浅红色的菌落。在裂解液与S菌的交叉处可出现紫色带金属光泽的菌落。
在光下观察，4个培养皿中均未发现深紫色带有金属光泽的菌落存在，实验较为失败。失败的可能原因：①稀释后的裂解液太稀，噬菌体含量太少，而且本身细菌转导频率较低，综合之下转导失败；②对菌体色泽的判断因人而异，没有客观标准。
三、凝集反应
在凝集反应中，能较明显地观察到抗血清端形成的凝集颗粒，而加磷酸盐缓冲液的一端则无明显现象，这证明了在电解质的影响下，抗原与相应抗体混合可以形成肉眼可见的凝集块。
仪器及用具：试管、三角瓶、离心机、离心管、振荡器、培养皿、紫外灯（UV灯，30W）、磁力搅拌器、涂布器、酒精灯、恒温水浴箱、培养箱等
其他材料：
E. coli及其抗血清
人IgG及兔抗人Ig G
载玻片、1%琼脂糖、打孔器等
[实验内容及步骤]
一、噬菌体裂解液的制备和菌种保藏
1、菌种活化
弃上清，用等体积PB（2mL）悬浮细胞，制成菌悬液
8.从诱导、离心、接种、稀释至铺双层平板等一系列操作过程，必须无菌操作。
9.噬菌体对温度敏感，一般噬菌体在60℃5min绝大部分失活。加入上层培养基的温度应不超过50℃。
10.观察噬菌斑的培养16~24h为宜。
在光下观察，4个培养皿中均未发现深紫色带有金属光泽的菌落存在。
三、凝聚反应
右侧为对照组，滴加磷酸盐缓冲液（代替生理盐水）与E. coli，无明显反应。
左侧为实验组，滴加抗血清与E. coli，在室温下静置数分钟后形成肉眼可见的凝集块。
四、沉淀反应
两个载玻片菌没有观察到明显现象，没有白色沉淀线生成。
注：理想条件下，应出现如下图所示现象。
2.按右图所示在皿底用记号笔画好标记。
3.接种无菌操作，取矢量培养活化的K12 S gal-菌一环，涂于S标记处；取适量活化的K12 F gal+菌液，划线接种于F标记处；取适量噬菌体裂解液，涂于λ标记处。
4.将接好的平板静置，所有菌液被培养皿吸收后再倒置，放37℃培养48~72h，观察结果。
（2）转导频率的测定
1.取0.5mLE.coli K12S,37C预热10分钟
2.取0.5mL裂解液,37C预热10分钟
3.把上述S菌和裂解液混合均匀，37C预热10分钟
4.用牛液把混合液稀释至10-3及10-4
5.取10-3及10-4稀释度0.2mL涂布EMB平板,于37C培养至少48hr,观察结果
3、凝集反应
按图加抗原和抗体及对照，静置5~10min，先用肉眼观察，后用显微镜在低倍镜下观察。
[注意事项]
1.素琼脂一定要保持在50C水浴中，防止凝固
2.转导频率测定时一定要稀释到合适浓度后才能涂平板，保证培养后长出单菌落
3.凝集反应观察时防止干燥
4.沉淀反应时加样时不要加到孔外
5.紫外线照射时注意保护眼睛与皮肤。
6.紫外线诱导时间不要过长。
7.所用敏感菌必须是纯种，加入培养皿中的敏感菌繁殖液应该在皿中均匀形成菌层。
4、沉淀反应
将琼脂糖凝胶融化后滴加到干净的载玻片上，凝固后按下图位置打孔并在孔中滴加相应的抗原和抗体。
将载玻片放到一个培养皿中，并放入一个湿棉球；
将培养皿置于37 C培养12~24h。
[实验结果]
一、噬菌体效价的测定
图1：含噬菌斑的平板，稀释浓度为
噬菌斑为透明的小斑点，对光观察较为明显，图中黑点为人为观察记录时的标记。
注：①色泽可能由于主观原因得到不同的形容。
②λdg是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因(gal)。
（2）转导频率的测定
在转导频率测定实验中，发生转导的菌落为紫色带金属光泽的菌落，大部分没有发生转导的菌落为浅红色菌落。转导频率一般较低，主要原因是：受体菌的生理状态；噬菌体悬液中只有一半（λdg）可以引起转导，λdg能否进入受体菌细胞；λdg进入细胞后能否发生基因重组等。
噬菌斑数：左边16个，右边13个。
图2：含噬菌斑的平板，稀释度为
噬菌斑数：左边39个，右边46个。
二、细菌转导的测定
（1）点滴法
三角形区域没有明显现象；涂布F菌的长方形中长满了紫色带金属光泽的菌落；在阳光下，涂布F菌的长方形区域与涂布噬菌体的圆形区域的重合处偶见深紫色带有金属光泽的菌落。
（2）转导频率的测定
阳性反应在抗原和抗体之间形成白色沉淀线。
沉淀反应：人IgG—兔抗人IgG（左：中心为抗原，右：中心为抗体）
[分析与讨论]
一、噬菌体效价的测定
溶原性细菌经紫外线照射诱导后，使原噬菌体从细菌染色体上脱离而进入裂解周期，在宿主菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。细菌被裂解，释放出游离的噬菌体粒子，通过离心，获得噬菌体裂解液。将经过适当稀释的噬菌体裂解液与大量敏感菌混合后倒入固体培养基平板的上层，每个噬菌体侵染一个宿主菌后在其中进行复制并最终导致该细菌的裂解。释放出的噬菌体继续侵染周围的细菌，最终形成一个肉眼可见的透明斑，即噬菌斑，每个平板内噬菌斑的数量控制在100~300个为宜。由于E. coliK 12 F是双重溶源菌，植被的噬菌体裂解液中含有λ和λdg两种噬菌体。只有λ能形成噬菌斑。
2、细菌转导的测定
转导可以分为两种类型，即普遍性转导和局限性转导。本实验为局限性转导，以双重溶原性细菌E. coli K12 F(λ)gal-为供体，经紫外线（UV）诱导，在噬菌体裂解液中将含有两种类型的噬菌体（λ和λdg）。λdg是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因(gal)，当缺陷型噬菌体λdg再次侵染敏感菌大肠杆菌K12 S时，会将发酵半乳糖的基因转移到S菌，使S菌获得基因gal，从而使S菌获得发酵半乳糖的能力。利用转导子在EMB培养基上发酵半乳糖的特征进行转导频率的计算和分析。
2）噬菌体裂解液的制备
取0.5mL前述制备的噬菌体裂解液，用每管4.5mL牛液将噬菌体裂解液稀释到10-4
3）倒平板
牛肉膏蛋白胨培养基：5个平版
EMB培养基：5个平板
4）将素琼脂溶化，保温于50℃，向每支素琼脂中接入0.5mLK12Sgal-，混匀，再分别取噬菌体裂解液0.5mL（ 、 ），加入到素琼脂中，摇匀后立刻倒在牛肉膏蛋白胨平板上。
2、UV诱导及增殖培养
加0.2mL氯仿，震荡30S，静置5分钟；
离心（3000rpm, 10min），
收集上清（噬菌体裂解液）。
3、菌种保藏
原则：干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养、添加保护剂等。
二、噬菌体效价的测定、细菌转导的测定
1、噬菌体效价的测定
1）受体菌（E. coli k12Sgal-）活化
[实验目的]
1、了解温和噬菌体与宿主菌之间的溶原关系。
2、学习利用溶原性细菌制备噬菌体裂解液的方法。
3、了解菌种保藏的基本原理和方法。
4、学习微生物大小的测量。
5、学习噬菌体效价测定的方法
6、了解转导原理、学习转导实验方法
7、学习凝集反应和沉淀反应的实验方法
8、了解血清学反应在实际中的应用
9、了解凝集反应的基本原理
微生物学实验
实验名称噬菌体裂解液的制备和菌种保藏
噬菌体效价的测定、细菌转导的测定
凝聚反应、沉淀反应
姓名
学号
系别
班级
实验日期
同组姓名
[实验原理及摘要]
1、噬菌体效价的测定
溶原性细菌经紫外线照射诱导后，使原噬菌体从细菌染色体上脱离而进入裂解周期，在宿主菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。细菌被裂解，释放出游离的噬菌体粒子，通过离心，获得噬菌体裂解液。噬菌体的效价是指1mL噬菌体裂解液中所含噬菌体的数量在含有敏感宿主菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，根据噬菌斑形成单位（plague-for ming units, pfu）进行噬菌体效价的测定，一般用双层琼脂平板法测定。
4、沉淀反应
沉淀反应与凝集反应的基本原理相同。不同的是沉淀反应所采用的抗原是可溶性的，如血清、细菌渗出物等。由于抗原是可溶的，抗原与抗体反应的结果时形成很细微的沉淀。沉淀反应可以在液体中进行，也可以在凝胶中进行。以液体形式在试管中进行时，抗原与抗体在交界面处形成环状的乳白色沉淀物，故称环状沉淀反应。双向琼脂扩散法是将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶版小孔中，两者互向对方扩散，相遇后若特异性结合且比例适当，形成乳白色沉淀线。
5）培养
待平板凝固后于37 ℃，培养12~16h；
根据噬菌斑数量计算噬菌体效价。Baidu Nhomakorabea
（因所测噬菌体裂解液中λdg不能形成噬菌斑，且其数量与λ数相等，故计算时乘2.）
2、细菌转导的测定
（1）点滴法
1.倒EMB平板取已灭菌的EMB培养基熔化并冷却至不烫手（约50℃），然后倒平板，冷却后翻转平板，温箱放置使表面干燥。
3、凝聚反应
凝集反应是指颗粒型抗原与相应抗体混合时，在电解质的影响下，形成肉眼可见的凝集块。电解质的作用主要是消除抗原-抗体复合物表面的电荷，使其失去同种电荷相斥的作用，抗原-抗体复合物失稳而相互凝聚。温度升高加速分子运动使凝集反应速度加快，一般反应在37℃或56℃水浴中进行。发生明显凝集反应（反应强度为++）的最高稀释度的倒数值为该免疫血清的效价。凝集反应试验可分为玻片凝集试验和试管凝集试验。前者的优点是简便快速，是鉴定传染病标本细菌的重要手段。后者是一种定量方法，可利用已知抗原鉴定相应抗体的效价。
菌种：大肠杆菌E.coliK12 Fgal+（双重溶源菌，含有λ噬菌体和缺陷型噬菌体λdg的基因组，发酵半乳糖）；大肠杆菌E. coliK12Sgal-（非溶源菌，对噬菌体敏感，不发酵半乳糖）
培养基：牛肉膏蛋白胨固体及液体培养基、加倍肉汤培养基、半固体素琼脂、磷酸盐缓冲液（0.1mol/L,pH7.0）、无菌水、氯仿、EMB培养基
四、沉淀反应
在沉淀反应中，我组为观察到明显现象，他组偶见沉淀线，借此可以排除抗原或抗体变性或不能特异性结合的可能。由教材克制，双向琼脂扩散法是将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶版小孔中，两者互向对方扩散，相遇后若特异性结合且比例适当，形成乳白色沉淀线。因此我组不能得到沉淀线的可能原因为：①抗原与抗体的比例不合适；②素琼脂层太薄，孔洞太浅不能盛装足够的抗原与抗体，导致二者不能扩散直至相遇形成沉淀。
从实验结果易得：由 ， 两个稀释度的噬菌体悬液所获得的噬菌斑算出的噬菌体效价存在显著差异。可能原因：①10倍系列稀释操作不当造成所获得的裂解液的噬菌体浓度不成10倍关系；②接种噬菌体前未将稀释好的噬菌体悬液摇匀，导致所取悬液的噬菌体浓度并非想要的浓度。
二、细菌转导的测定
（1）点滴法
该实验为定性实验。在点滴法转导实验中，F菌标记处是阳性对照，长出的菌落为紫色带金属光泽的菌落。λ标记处是空白对照，只有噬菌体，没有受体菌，不能长出菌落。S菌标记处是阴性对照，由于S菌不能发酵半乳糖，形成的菌落是浅红色的菌落。在裂解液与S菌的交叉处可出现紫色带金属光泽的菌落。
在光下观察，4个培养皿中均未发现深紫色带有金属光泽的菌落存在，实验较为失败。失败的可能原因：①稀释后的裂解液太稀，噬菌体含量太少，而且本身细菌转导频率较低，综合之下转导失败；②对菌体色泽的判断因人而异，没有客观标准。
三、凝集反应
在凝集反应中，能较明显地观察到抗血清端形成的凝集颗粒，而加磷酸盐缓冲液的一端则无明显现象，这证明了在电解质的影响下，抗原与相应抗体混合可以形成肉眼可见的凝集块。
仪器及用具：试管、三角瓶、离心机、离心管、振荡器、培养皿、紫外灯（UV灯，30W）、磁力搅拌器、涂布器、酒精灯、恒温水浴箱、培养箱等
其他材料：
E. coli及其抗血清
人IgG及兔抗人Ig G
载玻片、1%琼脂糖、打孔器等
[实验内容及步骤]
一、噬菌体裂解液的制备和菌种保藏
1、菌种活化
弃上清，用等体积PB（2mL）悬浮细胞，制成菌悬液
8.从诱导、离心、接种、稀释至铺双层平板等一系列操作过程，必须无菌操作。
9.噬菌体对温度敏感，一般噬菌体在60℃5min绝大部分失活。加入上层培养基的温度应不超过50℃。
10.观察噬菌斑的培养16~24h为宜。
在光下观察，4个培养皿中均未发现深紫色带有金属光泽的菌落存在。
三、凝聚反应
右侧为对照组，滴加磷酸盐缓冲液（代替生理盐水）与E. coli，无明显反应。
左侧为实验组，滴加抗血清与E. coli，在室温下静置数分钟后形成肉眼可见的凝集块。
四、沉淀反应
两个载玻片菌没有观察到明显现象，没有白色沉淀线生成。
注：理想条件下，应出现如下图所示现象。
2.按右图所示在皿底用记号笔画好标记。
3.接种无菌操作，取矢量培养活化的K12 S gal-菌一环，涂于S标记处；取适量活化的K12 F gal+菌液，划线接种于F标记处；取适量噬菌体裂解液，涂于λ标记处。
4.将接好的平板静置，所有菌液被培养皿吸收后再倒置，放37℃培养48~72h，观察结果。
（2）转导频率的测定
1.取0.5mLE.coli K12S,37C预热10分钟
2.取0.5mL裂解液,37C预热10分钟
3.把上述S菌和裂解液混合均匀，37C预热10分钟
4.用牛液把混合液稀释至10-3及10-4
5.取10-3及10-4稀释度0.2mL涂布EMB平板,于37C培养至少48hr,观察结果
3、凝集反应
按图加抗原和抗体及对照，静置5~10min，先用肉眼观察，后用显微镜在低倍镜下观察。
[注意事项]
1.素琼脂一定要保持在50C水浴中，防止凝固
2.转导频率测定时一定要稀释到合适浓度后才能涂平板，保证培养后长出单菌落
3.凝集反应观察时防止干燥
4.沉淀反应时加样时不要加到孔外
5.紫外线照射时注意保护眼睛与皮肤。
6.紫外线诱导时间不要过长。
7.所用敏感菌必须是纯种，加入培养皿中的敏感菌繁殖液应该在皿中均匀形成菌层。
4、沉淀反应
将琼脂糖凝胶融化后滴加到干净的载玻片上，凝固后按下图位置打孔并在孔中滴加相应的抗原和抗体。
将载玻片放到一个培养皿中，并放入一个湿棉球；
将培养皿置于37 C培养12~24h。
[实验结果]
一、噬菌体效价的测定
图1：含噬菌斑的平板，稀释浓度为
噬菌斑为透明的小斑点，对光观察较为明显，图中黑点为人为观察记录时的标记。
注：①色泽可能由于主观原因得到不同的形容。
②λdg是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因(gal)。
（2）转导频率的测定
在转导频率测定实验中，发生转导的菌落为紫色带金属光泽的菌落，大部分没有发生转导的菌落为浅红色菌落。转导频率一般较低，主要原因是：受体菌的生理状态；噬菌体悬液中只有一半（λdg）可以引起转导，λdg能否进入受体菌细胞；λdg进入细胞后能否发生基因重组等。
噬菌斑数：左边16个，右边13个。
图2：含噬菌斑的平板，稀释度为
噬菌斑数：左边39个，右边46个。
二、细菌转导的测定
（1）点滴法
三角形区域没有明显现象；涂布F菌的长方形中长满了紫色带金属光泽的菌落；在阳光下，涂布F菌的长方形区域与涂布噬菌体的圆形区域的重合处偶见深紫色带有金属光泽的菌落。
（2）转导频率的测定
阳性反应在抗原和抗体之间形成白色沉淀线。
沉淀反应：人IgG—兔抗人IgG（左：中心为抗原，右：中心为抗体）
[分析与讨论]
一、噬菌体效价的测定
溶原性细菌经紫外线照射诱导后，使原噬菌体从细菌染色体上脱离而进入裂解周期，在宿主菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。细菌被裂解，释放出游离的噬菌体粒子，通过离心，获得噬菌体裂解液。将经过适当稀释的噬菌体裂解液与大量敏感菌混合后倒入固体培养基平板的上层，每个噬菌体侵染一个宿主菌后在其中进行复制并最终导致该细菌的裂解。释放出的噬菌体继续侵染周围的细菌，最终形成一个肉眼可见的透明斑，即噬菌斑，每个平板内噬菌斑的数量控制在100~300个为宜。由于E. coliK 12 F是双重溶源菌，植被的噬菌体裂解液中含有λ和λdg两种噬菌体。只有λ能形成噬菌斑。
2、细菌转导的测定
转导可以分为两种类型，即普遍性转导和局限性转导。本实验为局限性转导，以双重溶原性细菌E. coli K12 F(λ)gal-为供体，经紫外线（UV）诱导，在噬菌体裂解液中将含有两种类型的噬菌体（λ和λdg）。λdg是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因(gal)，当缺陷型噬菌体λdg再次侵染敏感菌大肠杆菌K12 S时，会将发酵半乳糖的基因转移到S菌，使S菌获得基因gal，从而使S菌获得发酵半乳糖的能力。利用转导子在EMB培养基上发酵半乳糖的特征进行转导频率的计算和分析。
2）噬菌体裂解液的制备
取0.5mL前述制备的噬菌体裂解液，用每管4.5mL牛液将噬菌体裂解液稀释到10-4
3）倒平板
牛肉膏蛋白胨培养基：5个平版
EMB培养基：5个平板
4）将素琼脂溶化，保温于50℃，向每支素琼脂中接入0.5mLK12Sgal-，混匀，再分别取噬菌体裂解液0.5mL（ 、 ），加入到素琼脂中，摇匀后立刻倒在牛肉膏蛋白胨平板上。
2、UV诱导及增殖培养
加0.2mL氯仿，震荡30S，静置5分钟；
离心（3000rpm, 10min），
收集上清（噬菌体裂解液）。
3、菌种保藏
原则：干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养、添加保护剂等。
二、噬菌体效价的测定、细菌转导的测定
1、噬菌体效价的测定
1）受体菌（E. coli k12Sgal-）活化
[实验目的]
1、了解温和噬菌体与宿主菌之间的溶原关系。
2、学习利用溶原性细菌制备噬菌体裂解液的方法。
3、了解菌种保藏的基本原理和方法。
4、学习微生物大小的测量。
5、学习噬菌体效价测定的方法
6、了解转导原理、学习转导实验方法
7、学习凝集反应和沉淀反应的实验方法
8、了解血清学反应在实际中的应用
9、了解凝集反应的基本原理
微生物学实验
实验名称噬菌体裂解液的制备和菌种保藏
噬菌体效价的测定、细菌转导的测定
凝聚反应、沉淀反应
姓名
学号
系别
班级
实验日期
同组姓名
[实验原理及摘要]
1、噬菌体效价的测定
溶原性细菌经紫外线照射诱导后，使原噬菌体从细菌染色体上脱离而进入裂解周期，在宿主菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。细菌被裂解，释放出游离的噬菌体粒子，通过离心，获得噬菌体裂解液。噬菌体的效价是指1mL噬菌体裂解液中所含噬菌体的数量在含有敏感宿主菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，根据噬菌斑形成单位（plague-for ming units, pfu）进行噬菌体效价的测定，一般用双层琼脂平板法测定。
4、沉淀反应
沉淀反应与凝集反应的基本原理相同。不同的是沉淀反应所采用的抗原是可溶性的，如血清、细菌渗出物等。由于抗原是可溶的，抗原与抗体反应的结果时形成很细微的沉淀。沉淀反应可以在液体中进行，也可以在凝胶中进行。以液体形式在试管中进行时，抗原与抗体在交界面处形成环状的乳白色沉淀物，故称环状沉淀反应。双向琼脂扩散法是将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶版小孔中，两者互向对方扩散，相遇后若特异性结合且比例适当，形成乳白色沉淀线。
5）培养
待平板凝固后于37 ℃，培养12~16h；
根据噬菌斑数量计算噬菌体效价。Baidu Nhomakorabea
（因所测噬菌体裂解液中λdg不能形成噬菌斑，且其数量与λ数相等，故计算时乘2.）
2、细菌转导的测定
（1）点滴法
1.倒EMB平板取已灭菌的EMB培养基熔化并冷却至不烫手（约50℃），然后倒平板，冷却后翻转平板，温箱放置使表面干燥。
3、凝聚反应
凝集反应是指颗粒型抗原与相应抗体混合时，在电解质的影响下，形成肉眼可见的凝集块。电解质的作用主要是消除抗原-抗体复合物表面的电荷，使其失去同种电荷相斥的作用，抗原-抗体复合物失稳而相互凝聚。温度升高加速分子运动使凝集反应速度加快，一般反应在37℃或56℃水浴中进行。发生明显凝集反应（反应强度为++）的最高稀释度的倒数值为该免疫血清的效价。凝集反应试验可分为玻片凝集试验和试管凝集试验。前者的优点是简便快速，是鉴定传染病标本细菌的重要手段。后者是一种定量方法，可利用已知抗原鉴定相应抗体的效价。