切片技术

⑶核酸:
显示DNA的传统方法为孚尔根反应(Feulgen reaction) .切片 先经稀盐酸处理,使DNA分解;再用希夫试剂处理,形成紫红色反
应物.
如果同时显示DNA和 RNA,则用甲基绿-派 若宁反应.甲基绿与 细胞核DNA结合呈蓝 绿色,派若宁与核仁 及胞质内的RNA结合 呈红色.
光学显微镜技术
显微镜 17th 18th
光学显微镜技术
显微镜 18/19th 19th
Eye Pieces
Objectives Stage
Controls
Light source
On-off Button
Fine focus control Coarse focus control
Vol. control
石蜡切片HE染色操作步骤
1、取材 2、固定 3、漂洗 4、脱水 5、透明 6、透蜡 7、包埋 8、修块 9、切片 10、染色
• 常规石蜡切片H．E染色程序
(一)脱蜡至水
1．二甲苯Ⅰ 2．二甲苯Ⅱ 3．无水乙醇 4．95％酒精 5．80％酒精 6．70％酒精 7．自来水洗 5-15分钟 5-15分钟 3分钟 3分钟 3分钟 3分钟
一般组织化学术
一般组织化学术 基本原理是在切片 上加某种试剂,和组织中的待检物质发 生化学反应,其最终产物或为有色沉淀 物,以用光镜观察,或为重金属沉淀,以 用电镜观察.
⑴糖类:常用过碘酸希夫反应(periodic acid Schiff reaction ,PAS 反应)显 示多糖和糖蛋白的糖链.糖被强氧化剂. 过碘酸氧化后,形成多醛;后者再与无色 的品红硫酸复合物(即希夫试剂)结合,形 成紫红色反应产物.
• 取材 – 根据教学和科研的具体要求确定材料、部位 和方法 – 材料新鲜 – 组织块的大小：使固定液能迅速而均匀地渗 入组织内部。如制作病理外检、科研切片， 取0.1～0.2cm即可 – 勿挤压组织块 – 保持组织原有形态、保持组织清洁
• 固定
为了阻止组织细胞的死亡后变化，防止自溶与腐败，保持组 织内细胞原有的形态结构，切取组织块后应立即进入固定液， 常用的固定方法有：
乙醇、丙酮等不溶于石蜡，还要经过一个能溶于石蜡 的溶剂替代过程，此过程称为透明。常用的透明剂有 二甲苯、三氯甲烷、冬青油等。
Dehydration脱水透明
• 浸蜡 已透明的组织移入已熔化的石蜡中，使蜡充分浸入组织内， 此过程称为浸蜡又称透蜡。浸蜡时应注意以下几点： – 浸蜡熔点：石蜡分为软石蜡与硬石蜡两种，熔点为42～ 54℃一般称为软蜡，熔点为56～62℃称为硬蜡。浸蜡时， 应先经软蜡再经硬蜡，（常用的浸蜡熔点为52～54℃、 54～56℃、56～58℃Ⅲ级浸蜡），使组织中含有的透明 剂完全去尽。 – 浸蜡温度：浸蜡的温度应高于熔点的2～5℃为宜，温度 过高可致组织过度收缩或变脆，如在温箱内浸蜡，要将 温度控制在60～65℃的范围。 – 浸蜡时间： 可根据组织块的大小及其组织种类而定。 30min~几小时
染色
…manually …automated
HE染色
• 注意事项
– 任何石蜡切片必须经过二甲苯进行脱蜡后才能染色，石蜡切片要求 平板烘干，以便组织与玻片粘贴牢固。组织切片脱蜡的好坏，与二 甲苯的温度及时间有关，二甲苯使用时间过长，应及时更换。 – 在H．E染色过程中，其成败的关键在于分化，如果分化不当致使应 该分化脱色的部分末予脱去，或分化不足致染色不均匀，复染对也 不能得到对比鲜明的色彩，另外流水冲洗时间的长短对组织返蓝色 彩鲜艳与否也有一定的关系。须要提及的是，染色的成败除染色技 术以外，组织材料的过分陈旧或长期固定在甲醛中的组织，由于过 度酸化都会影响染色；或组织固定不当，固定不足组织发生自溶等 均会使染色模糊。 – 伊红染色后必须经梯度酒精脱水，特别需要经过无水乙醇，脱水一 定要彻底，否则，影响透明。 – 脱水后，经二甲苯进行透明，才能封固。透明应注意时间充足，才 能达到良好效果。封片时，中性树胶不能滴加太多或太少。封固好 的切片应平放在摊片盘上，及时放置于恒温箱中40-50℃烘烤15小时 左右，有利于切片的保存。
裱片
冰冻切片（frozen section）
是一种在低温条件下使组 织快速冷却到一定硬度， 然后进行切片的方法：低 温恒冷箱冰冻切片法
冰冻切片
• 取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大 者难以切完整，最好为24×24×2mm。 • 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻 台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻， 形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 • 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转 动旋钮，将组织修平。 • 调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄 切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 • 调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要 求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片 时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平 整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片， 将其附贴上即可。 • 应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主 要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组 织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- 15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃ 左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时， 应调至-30℃。
细胞培养
光镜标本制备
？？？
光学显微镜技术
常见标本制备：HE染色，石蜡切片
特点：石蜡切片是使石蜡充分浸入组织，组织 块变硬，有利于切薄，制作的切片能完好地 保存组织原有的结构，透明度好，并可长期 保存，有利于显微镜下观察组织图像。这种 方法包括以下几个步骤：
步骤

取材固定：福尔马林 脱水：酒精 透明：二甲苯 包埋：石蜡 切片：切片机 染色：HE
显微技术(Ⅰ光镜)
江苏大学 基础医学与医学技术学院 组织胚胎学系
卢小东
Resolving power
Naked Eye
1 meter
Organisms
100 mm
10 mm 1 mm Organs
Light Microscope
100 um 10 um 1 um 100 nm
Cells (20u) Nucleus (2 u) Bacteria (0.5 u) Organelles Viruses Macromolecules Atoms . . .
普通生物显微镜的放大倍数
10X4 低倍观察 10X10 中倍观察 10X40 高倍观察
10X100 油镜
光学显微镜原理
荧光显微镜是用以观察细胞及组织内荧光物质的分布。
相差倒置显微镜是用以观察培养细胞。一般光镜不易 分辨无色透明的活细胞，需用相差显微镜（phase contrst microscope）才能观察。相差显微镜可将厚细 胞不同或度及细胞内各种结构对光产生的不同折射，转 换为光密度差异（明暗差），从而使镜下结果反差明显， 影像清晰。
小块组织固定法：标本：固定液为1：4～20；最常用的方法，但组织 块不易过大过厚，最好置入冰箱冷藏室内固定，冷藏固定时间适当延 长，特别是组织化学实验用的材料，冷藏固定效果会更好。 – 注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部， 或需要整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注 固定法。将固定液注入血管，经血管分支达整个组织和全身，从而得 到充分的固定的目的。 – 固定液：单纯固定液（10%甲醛固定液和95`%乙醇） 混合固定液： • 酒精 -甲醛固定液（ 95%酒精9份、40%的甲醛1份）； • Zenken氏液（重铬酸钾2.5g，升汞5.0g，蒸馏水100ml,冰醋酸5 ml）； • Bouin氏液（苦味酸饱和水溶液25 ml,40%甲醛25 ml，冰醋酸5 ml）
• 包埋： 将浸蜡后的组织置于融化石蜡中，石蜡凝固后，组织即 被包在其中，称蜡块，此过程称为包埋。包埋用的石蜡 和加温的镊子均不能温度过高，防止组织被烫伤，破坏 组织结构。包埋用的石蜡温度应与组织块本身的温度相 等，如温度不一，可造成组织与周围石蜡脱裂的现象。 包埋所用的石蜡要求无杂质，并有一定的粘韧性。蜡的 熔点与组织块相适应，过硬的组织（如骨组织、肌肉组 织、皮肤等）可用硬度较高的石蜡包埋。包埋用的石蜡 可以重复使用，
• 冰冻切片染色
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ 切片固定30秒－1分钟。 水洗。 染苏木素3－5分钟。 分化。 于碱水中返蓝20秒。 伊红染色10－20秒。 脱水，透明，中性树胶封固。
涂片
磨片
HE染色
• 苏木精 Hematoxylin –碱性染料 –被苏木精染成蓝色的特性称嗜碱性 Basophilic，如：细胞核，核糖体，粗面内 质网等 • 伊红 Eosin –酸性染料 –被伊红染成红色的特性称嗜酸性 Acidophilic 如：细胞质、膜性结构（线粒体、溶酶体、滑 面内质网） • 中性或嫌色性
• PAS反应阳性 过碘酸Schiff反应(periodic acid Schiff reaction) ， 是确定组织或细胞中有无多糖存在的一种方法。 氧化 Schiff试剂 多糖 → → 醛 → → → → 紫红色沉淀
⑵脂类:标本用甲醛固定,冷冻切片,用油 红O、尼罗蓝或苏丹类脂溶性染料染色, 使脂类(脂肪、类脂)呈相应颜色.亦可用 锇酸固定兼染色,脂质呈黑色.
10 nm
Electron Microscope 1 nm 0.1 nm
分辨率： 光镜：0.2 µ m 电镜：0.1nm
显微长度单位
•millimeter (mm)= 10-3 meter
•micrometer (µm )= 10-6 meter •nanometer (nm) = 10-9 meter
组织化学术(histochemistry )
组织化学术(histochemistry )为应用化 学、物理、生物化学、免疫学或分子生物 学的原理和技术,与组织学技术相结合而 产生的技术,能在组织切片定性、定位地 显示某种物质的存在与否、以及分布状态. 还可进一步用显微分光光度计或图象分析 仪测定光镜切片中该物质反应的强度,获 得定量的信息.应用这种技术于游离细胞 的样品(如细胞涂片),则称细胞化学术 (cytochemistry ).
Embedding 包埋
切片机
石蜡切片机
冰冻切片机
How does a microtome work?
Microtome Arm Tissue Block Tissue Section
Microscope Slide
Knife
切片
…on Cryostat (frozen)
…on Microtome (wax)
(二)染色
1．Harris苏木素液 2．自来水洗 3．1％盐酸溶液分化 4．自来水洗 5．1％氨水返蓝 6．自来水洗 7．95％酒精 8．1％伊红酒精溶液 5-7分钟 5分钟 30秒 5分钟 10秒 15-20分钟 3分钟 1-2分钟
wk.baidu.com
(三)脱水、透明和封固 l．95％酒精 2分钟 2．无水酒精Ⅰ 2分钟 3．无水酒精Ⅱ 2分钟 4．二甲苯Ⅰ 5分钟 5．二甲苯Ⅱ 5分钟
–
•脱水与透明
标本经过固定和冲洗后，组织中含有较多的水分，必 须将组织块内的水分置换出来，这一过程叫做脱水。 脱水的步骤是： 80%、90%、95%、100%各种浓度 乙醇2小时，此过程可用脱水机自控完成。 丙酮也是一种脱水能力很强的脱水剂，但因其脱水能 力很强，对组织有剧烈收缩作用，在制作科研、教学 切片时一般不用该试剂。但因其沸点低，脱水力强， 加温至沸点时在短时间内可脱水彻底，故病理外检快 速石蜡切片时可用丙酮脱水剂。

组织学的研究技术
• 显微镜技术: 光镜：light microscopic, LM
电镜：electronic microscopic, EM
–透射电镜（transmission electron microscope, TEM）：观察细胞内部结构 –扫描电镜（scanning electron microscope, SEM)：观察组织或细胞表面 的立体结构