实验二蛋白质含量的测定凯氏定氮法1
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K2S04与CuS04.5H20以 3：1混合 3、30％氢氧化钠溶液 4、2％硼酸溶液 5、标准盐酸溶液(约0.01 mol／L) 6、混合指示剂(田氏指示剂)
1.凯氏烧瓶 2.凯氏定氮仪 3.分析天平 4.酸式滴定管 5.烘箱 6.消化炉
由50mL 0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL 7.容量瓶
滴定：标准HCl滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度
为止，根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩 尔数)，计算出样品中的总氮量。
NH4BO2 + HCl → HBO2+NH4Cl
消化 蒸馏、吸收
滴定
三、试剂与器材
1、消化液：H2O2：H2S04 ：H2O=3：2：1 2、粉末硫酸钾―硫酸铜混合物
V1为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均mL数； V2为滴定空白液用去的盐酸溶液mL数；
w为样品重量(1g)。
14为氮的相对量子质量。
消化液总量500ml, 蒸馏时消化液用量3ml
样品蛋白质含量(％)=总氮量×6.25
注意事项
冷凝水的开、关 自由夹：中间 酒精灯：加到2/3，防止燃烧中途不够 蒸汽发生器中：水到瓶颈凹陷处 火焰
小心照看，防止反应液喷出 防止烧到橡胶管
冷凝管末端不用时防在干净的烧杯中，防止NaOH污染 空白：蒸10分钟未变色，再蒸3分钟 铁架台：夹子口朝上
思考题
1、何谓消化？如何判断消化终点？ 2、在实验中加入粉末硫酸钾―硫酸铜混合物的作用是什么？ 3、固体样品为什么要烘干？ 4、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？ 5、如何证明蒸馏器洗涤干净？ 6、本实验应如何避免误差？
若样品为液体(如血清等)，可取一定体 积样品直接消化测定。
取凯氏烧瓶 标号。各加几颗玻璃珠; 1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂
2、消化
200 mg，消化液5 mL。3及4号瓶中 加样时应直接送人瓶底，不 各加相同量的催化剂和消化液-----对照， 要沾在瓶口和瓶颈上。
以Байду номын сангаас定试剂中可能含有的微量含氮物
4、滴定
全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量， 硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。
注意：使用前检查酸式滴定管漏不漏？漏的话，涂凡士林
滴定时一边滴一边摇，防止滴定过头！
及时记录读数
要求：空白液1次，样品消化液2次
总氮量 (％) =
5、计算
c为标准盐酸溶液摩尔浓度(0.0098M)；
加样:
移液管取3 mL消化液（空白液和样品消化液分别做），加入反应室，用小量筒
加NaOH溶液5mL，关闭自由夹，少量水封口。 蒸馏:
关闭自由夹，打开冷凝水。 点燃酒精灯，蒸馏开始，锥形瓶中溶液由淡紫色变绿时(约2-3分钟)开始计时，蒸
馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，继续蒸馏1分钟，取下锥 形瓶，表面皿覆盖。 蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。 重复3次。最后将自由夹同时 打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。
质。
消化开始时应控制火力，不使液体
冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开
始分解并放出SO2白烟后，适当加强火 力消化，直至消化液呈透明淡绿色。
定容：冷却后，加蒸馏水(慢加，随加 随摇)。将瓶中液体倾入50 mL或100 mL容量瓶，并以蒸馏水洗烧瓶数次， 洗液并入容量瓶，定容。
3、蒸馏吸收： 改进型凯氏定氮仪
３.清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛 有5 mL，2％硼酸溶液和1～2滴指示 剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装 置内部已洗涤干净。
蒸馏吸收
准备: 取50 mL锥形瓶3个，各加入5 mL 硼酸溶液和1滴指示剂，溶液呈淡紫色，表面 皿覆盖备用。 关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将锥形瓶放在冷凝器下， 冷凝器下端浸没在液体内。
CH2NH2COOH+3H2SO4
2CO2+3SO2十4H2O十NH3
2NH3+H2SO4
(NH4)2SO4
蒸馏吸收：浓碱使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，
借水蒸汽将产生的氨蒸馏到硼酸溶液中，硼酸吸氨后使溶
液中的氢离子浓度降低，指示剂变色
(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2H2O + 2NH3↑ NH3 + HBO2→ NH4BO2 （H3BO3 → HBO2 + H2O）
实验二 蛋白质含量的测定―凯氏定氮法
一 目的： 学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验原理 掌握蒸馏、滴定操作技术
三聚氰胺 C3N6H6
“蛋白精”
二、原理：蛋白质含N量约为16％，测出含氮量推知蛋白含量。
消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮-
--硫酸铵。添加硫酸铜和硫酸钾的混合物，前者为催化剂， 后者提高硫酸沸点。
0.1％甲基红乙醇溶液混合配成，棕色瓶贮存。
等等
酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色
范围很窄且灵敏。
7、待测样品
四、操作方法
1. 消化前样品处理 固体样品: 某一固体样品中的含氮量是 用100g该物质(干重)中所含氮的g数来 表示(％)。 固体样品105℃烘干至恒重。
用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至 室温后称重，按上述操作继续烘干样品。 每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量 数值不变，即达恒重。
特点：将蒸汽发生器、蒸 馏器和冷凝器组成一个整 体，体积小，安装容易， 操作简便。 1)水蒸汽发生器和反应室 2)冷凝器和通气室 3)排水柱
关键：搞清水管系统
蒸馏器的洗涤
１.接通冷凝水，向蒸汽发生器中加入 一定量的水(以排水口高度为宜)，酒 精灯加热烧开。
２.水的自动喷出： 将蒸馏水从加样室加入反应室 将酒精灯移开片刻，反应室内水 自动喷出到蒸汽发生器 打开蒸汽发生器出水口，放水。 如此反复清洗3-5次。
1.凯氏烧瓶 2.凯氏定氮仪 3.分析天平 4.酸式滴定管 5.烘箱 6.消化炉
由50mL 0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL 7.容量瓶
滴定：标准HCl滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度
为止，根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩 尔数)，计算出样品中的总氮量。
NH4BO2 + HCl → HBO2+NH4Cl
消化 蒸馏、吸收
滴定
三、试剂与器材
1、消化液：H2O2：H2S04 ：H2O=3：2：1 2、粉末硫酸钾―硫酸铜混合物
V1为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均mL数； V2为滴定空白液用去的盐酸溶液mL数；
w为样品重量(1g)。
14为氮的相对量子质量。
消化液总量500ml, 蒸馏时消化液用量3ml
样品蛋白质含量(％)=总氮量×6.25
注意事项
冷凝水的开、关 自由夹：中间 酒精灯：加到2/3，防止燃烧中途不够 蒸汽发生器中：水到瓶颈凹陷处 火焰
小心照看，防止反应液喷出 防止烧到橡胶管
冷凝管末端不用时防在干净的烧杯中，防止NaOH污染 空白：蒸10分钟未变色，再蒸3分钟 铁架台：夹子口朝上
思考题
1、何谓消化？如何判断消化终点？ 2、在实验中加入粉末硫酸钾―硫酸铜混合物的作用是什么？ 3、固体样品为什么要烘干？ 4、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？ 5、如何证明蒸馏器洗涤干净？ 6、本实验应如何避免误差？
若样品为液体(如血清等)，可取一定体 积样品直接消化测定。
取凯氏烧瓶 标号。各加几颗玻璃珠; 1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂
2、消化
200 mg，消化液5 mL。3及4号瓶中 加样时应直接送人瓶底，不 各加相同量的催化剂和消化液-----对照， 要沾在瓶口和瓶颈上。
以Байду номын сангаас定试剂中可能含有的微量含氮物
4、滴定
全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量， 硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。
注意：使用前检查酸式滴定管漏不漏？漏的话，涂凡士林
滴定时一边滴一边摇，防止滴定过头！
及时记录读数
要求：空白液1次，样品消化液2次
总氮量 (％) =
5、计算
c为标准盐酸溶液摩尔浓度(0.0098M)；
加样:
移液管取3 mL消化液（空白液和样品消化液分别做），加入反应室，用小量筒
加NaOH溶液5mL，关闭自由夹，少量水封口。 蒸馏:
关闭自由夹，打开冷凝水。 点燃酒精灯，蒸馏开始，锥形瓶中溶液由淡紫色变绿时(约2-3分钟)开始计时，蒸
馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，继续蒸馏1分钟，取下锥 形瓶，表面皿覆盖。 蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。 重复3次。最后将自由夹同时 打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。
质。
消化开始时应控制火力，不使液体
冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开
始分解并放出SO2白烟后，适当加强火 力消化，直至消化液呈透明淡绿色。
定容：冷却后，加蒸馏水(慢加，随加 随摇)。将瓶中液体倾入50 mL或100 mL容量瓶，并以蒸馏水洗烧瓶数次， 洗液并入容量瓶，定容。
3、蒸馏吸收： 改进型凯氏定氮仪
３.清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛 有5 mL，2％硼酸溶液和1～2滴指示 剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装 置内部已洗涤干净。
蒸馏吸收
准备: 取50 mL锥形瓶3个，各加入5 mL 硼酸溶液和1滴指示剂，溶液呈淡紫色，表面 皿覆盖备用。 关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将锥形瓶放在冷凝器下， 冷凝器下端浸没在液体内。
CH2NH2COOH+3H2SO4
2CO2+3SO2十4H2O十NH3
2NH3+H2SO4
(NH4)2SO4
蒸馏吸收：浓碱使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，
借水蒸汽将产生的氨蒸馏到硼酸溶液中，硼酸吸氨后使溶
液中的氢离子浓度降低，指示剂变色
(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2H2O + 2NH3↑ NH3 + HBO2→ NH4BO2 （H3BO3 → HBO2 + H2O）
实验二 蛋白质含量的测定―凯氏定氮法
一 目的： 学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验原理 掌握蒸馏、滴定操作技术
三聚氰胺 C3N6H6
“蛋白精”
二、原理：蛋白质含N量约为16％，测出含氮量推知蛋白含量。
消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮-
--硫酸铵。添加硫酸铜和硫酸钾的混合物，前者为催化剂， 后者提高硫酸沸点。
0.1％甲基红乙醇溶液混合配成，棕色瓶贮存。
等等
酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色
范围很窄且灵敏。
7、待测样品
四、操作方法
1. 消化前样品处理 固体样品: 某一固体样品中的含氮量是 用100g该物质(干重)中所含氮的g数来 表示(％)。 固体样品105℃烘干至恒重。
用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至 室温后称重，按上述操作继续烘干样品。 每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量 数值不变，即达恒重。
特点：将蒸汽发生器、蒸 馏器和冷凝器组成一个整 体，体积小，安装容易， 操作简便。 1)水蒸汽发生器和反应室 2)冷凝器和通气室 3)排水柱
关键：搞清水管系统
蒸馏器的洗涤
１.接通冷凝水，向蒸汽发生器中加入 一定量的水(以排水口高度为宜)，酒 精灯加热烧开。
２.水的自动喷出： 将蒸馏水从加样室加入反应室 将酒精灯移开片刻，反应室内水 自动喷出到蒸汽发生器 打开蒸汽发生器出水口，放水。 如此反复清洗3-5次。