真菌学检验 PPT课件

❖ 真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法; ❖ 培养成功与否与采集的标本是否适当、是否新
鲜、培养基的选择、培养温度与时间等有关; ❖ 二相性真菌培养
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常用培养基及用途
培养基名称
用途
沙氏培养基（Sabourand） 用于深浅部真菌的常规培养
玉米粉聚山梨酯80琼脂
观察白色念珠菌的厚膜孢子
马铃薯葡萄糖琼脂 脑心浸膏琼脂（BHI） 沙比（Sabhi） 尿素琼脂
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二相性真菌（dimorphic fungus）：
某些真菌，可因环境条件改变，由一种形态转变成另 一种形态，在体内或含动物蛋白的培养基上37℃培养 时呈酵母型，在普通培养基上25-28℃培养时呈霉菌 型，如球孢子菌、组织胞浆菌及芽生菌。
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有隔菌丝
菌
菌 按有无
按生物
丝
丝 横隔
学功能 无隔菌丝
体
产色培养基
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3、药物敏感试验：对二性霉素B、5-FC敏感，但对后者易 耐药；
4、抗体检测：ELISA、免疫酶斑点试验测抗原或用乳胶凝 集、对流免疫电泳试验测抗体；
5、动物试验：1ml菌悬液注射兔耳静脉或0.2ml菌悬液注射 鼠尾静脉，观察5-7d，剖检。脏器多种小脓肿即为白假 丝酵母菌感染。
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真菌学检验
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病原真菌学概论
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一、真菌的分类
真菌门
接合菌亚门 子囊菌亚门 担子菌亚门 半知菌亚门
毛霉、根霉 酵母 鹅膏菌 表皮癣菌、隐球菌
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二、真菌与人类的关系
在自然界中分布广泛，约二十余万种，对 人致病的约150种。
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对人致病性的真菌分为：
➢ 病原性真菌 ➢ 条件致病性真菌 ➢ 产毒真菌 ➢ 致癌真菌
外阴炎。男性念珠菌龟头炎、包皮炎。
❖ 体弱婴儿鹅口疮；
❖ 假丝酵母菌性肠炎、肺炎等。
❖ AIDS最常见并发症之一。
白假丝酵母菌皮肤黏膜感染 （鹅口疮）
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微生物特性：
：典型❖类圆酵形母或型卵菌落园，形表；面光滑，呈
奶油色，有酵母气味。
，可看❖到出表芽层方为式卵圆繁形殖芽，生在细组胞织，底 假菌丝。内可见芽生孢子、假菌
殖器官，一条菌丝 上可长出多个孢子。 在环境条件适宜时， 孢子又可发芽生出 芽管，发育成菌丝 体。
孢子分有性孢子和无性孢子两大类： 有性孢子——由同一菌体或不同菌体
上的两个细胞融合而成。 无性孢子——由菌丝上的细胞分化生
成，并不发生细胞融合，包括：分生孢子、 叶状孢子和孢子囊孢子。
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（1）分生孢子（condium） 由生殖菌丝末端细胞分裂或收缩形成，也可在菌
起（如灰指甲可由毛癣菌或表皮癣菌引起）
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红色毛癣菌
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甲癣
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微生物学检验
1、标本采集：70%乙醇消毒
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2、直接镜检：
10%KOH（皮屑）； 25%KOH或 NaOH + 5%甘油（指甲）；
透明、有隔、有分支的菌丝及成链的关节孢子 发外型感染或发内型感染
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断发毛癣菌引起的 发内型感染的头发
形成链状排列的长方形节段。
（3）孢子囊孢子（sporangiospore）： 菌丝末端膨大成囊状，内含许多孢子。
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真菌菌落特性
❖ 酵母型菌落：单细胞真菌的菌落，较大，光滑、湿润、
柔软、边缘整齐。
❖ 霉菌型菌落：多细胞真菌的菌落，棉絮状，绒毛状，
粉末状、产生色素。如皮肤癣菌。
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真菌感染的实验诊断
不
染 生理盐水
显色
致密难以透明 观察出芽现象
毛发、指（趾） 甲、鳞屑
微 革兰染色
镜
检
染 色
查检
乳酸酚棉蓝 墨汁染色
查
G+ 菌丝、孢子
酵母菌、白色念 珠菌
皮肤癣菌
用于有荚膜的真菌 新型隐球菌
瑞氏染色
骨髓、外周血
荚膜组织胞浆菌
荧光染色
吖啶橙和 KOH染色
培养涂片、组织 切片
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直接镜检评价
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真菌是医院感染常见微生物
❖院内感染的——7.5%-15%
❖血液感染的——第四位
❖肿瘤病人发病率——为8% ❖严重创伤、烧伤病人——高达16%
❖病死率——达55%-70%
•条件致病菌感染——呈上升趋势，为继发性感染 （呼吸道、皮肤、消化道粘膜损伤）
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三、真菌的基本特性
真菌（fungus）属真菌界,真核细胞型微生物。 ❖ 典型的细胞结构 ❖ 无根、茎、叶，不含叶绿素。 ❖ 腐生或寄生方式摄取营养。 ❖ 细胞壁含几丁质（chitin）、
有性 孢子
孢无 子性
孢 子
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由同一菌体或不同菌体上的二个细胞融 合形成
叶状孢子 分生孢子
芽生孢子 厚膜孢子 关节孢子 大分生孢子
孢子囊孢子
小分生孢子
菌丝末端形成膨大的 囊状结构，孢子囊，
内含众多孢子
营养菌丝体 气中菌丝体 生殖菌丝体 多为非致病性真菌
隐球菌、念珠菌 新生隐球菌
小孢子菌属，表皮癣菌 属
二、真菌学检验
❖ 直接镜检：形态学检查是重要依据 ❖ 抗原的检测： ❖ 分离培养与鉴定： ❖ 核酸检测： ❖ 毒素检测：
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真菌标本直接检查
1.直接镜检：方法简便，快速 角质标本 10%KOH 低倍/高倍镜检查
（皮肤癣菌） 微加热 有无菌丝/孢子
直接观察/染色后观察
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标本直K接OH检查 10~20%
毛癣菌属 根霉菌
菌丝按结构可分为：有隔菌丝与无隔菌丝
（1）有隔菌丝：
大部分真菌的菌 丝在一定间距见有 横隔，称隔膜。将 菌丝分成一连串的 细胞。
（2）无隔菌丝：
菌丝中无横隔 将其分段，整条菌 丝就是一个细胞。 在一个细胞内含有 许多核，是一种多 核单细胞。
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孢子(spore)： 孢子是真菌的繁
❖ 检验真菌常用的生化反应有糖(醇)类发酵试验、同化 碳源试验、同化氮源试验或利用硝酸钾试验、牛乳分 解试验、酚氧化酶试验、明胶液化试验和脲酶试验等。
❖ 试验方法同细菌试验，主要用于检验深部感染真菌如 假丝酵母菌、隐球菌等。
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分类
根据侵犯的部位不同分为： 浅部感染真菌 深部感染真菌
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浅部感染真菌
二、隐球菌
隐球菌属，17个种，7个变种。
❖ 广泛分布于自然界，也可存在于人的体表、口腔 和肠道。
❖ 外源性感染，经呼吸道侵入。侵犯肺、脑、脑膜， 也可侵犯皮肤，骨和关节。
❖ 在国外，是AIDS的最常见并发症之一，是AIDS 死亡的首要原因。
❖ 在我国已被列为乙类传染病。 ❖ 致病物质为荚膜。
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电镜下新生隐球菌的荚膜
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2、分离培养与鉴定
① 沙氏培养基，25℃或37 ℃培养1-4d，可见奶油色菌 落。镜检可见假菌丝和芽生孢子。
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2、分离培养与鉴定
② 芽管形成试验：细菌接种在0.2-0.5ml人或
动物血清，37℃ 1.5-4h可见芽管；设立阴性 对照。
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C. albicans (green)白念 C. tropicalis (blue)热带 C. parapsilosis (white)近平滑 C. glabrata (pink). 光滑/克柔
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微生物特性
❖ 圆或卵圆形、4-6μm，有荚膜，较菌体大 1-3倍。
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微生物学检验
1、标本直接检查 （1）直接镜检: 墨汁负染，PAS染色 （2）抗原检测：乳胶凝集试验、ELISA、单
克隆抗体法
（3）核酸检测：PCR探针、DNA探针
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（新生隐球菌的酵母被一个很宽的荚膜包围） 脑脊液的印度墨汁染色标本
丝侧面出芽形成，有两种：
大分生孢子（macrocondium）： 小分生孢子（microcondium）：
多细胞组成，梭状、棍棒状；
单细胞组成。
芽生孢子 关节孢子
厚膜孢子
（2）叶状孢子（thallospore）： 芽生孢子——出芽形成； 厚膜孢子——胞浆浓缩，胞壁
增厚而成； 关节孢子——菌丝胞壁增厚，
1、菌落的性质：酵母菌还是霉菌； 2、菌落的大小：病原性真菌菌落小，条件致病
性真菌则大； 3、菌落颜色：病原性真菌色淡，污染性真菌色深； 4、致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂，污染性
真菌菌落不下沉，很少引起培养基开裂。
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真菌鉴定
❖ 全面生化反应、分子生物学鉴定，必要时将菌种送有 关单位鉴定。
丝；
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❖ 假菌丝 (pseudohypha): 指酵母菌菌种进行一 连串的芽殖后，长大的子细胞仍不脱落分离， 并继续出芽，细胞成串排列，在分隔处缢缩, 这种菌丝状的细胞串就称为假菌丝。
微❖ 在生玉物米特粉性培养：基中可产生假菌丝和厚膜孢子。
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厚膜孢子形成试验
微生物检验
1、标本直接检查：
a、直接显微镜检查：G＋ b、抗原检测：ELISA、免疫印迹 c、核酸检测：PCR扩增其DNA后以分子探针检测。
肤 甲发
子
子
菌丝
螺旋状、鹿角
细长、棒 梨形、棒 状、结节状、
+ + + 形、壁薄， 形，
球拍状、破梳
少见或无 较多见
状，单纯细菌
丝
纺锤形， 棒形，卵
+ - + 壁较厚， 圆形，
较多见
较少见
球拍状及破梳 状菌丝
梨形、壁 + + － 较薄，
无
单纯菌丝
多见
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毛癣菌属
菌落蜡状，开始为白色继续培养呈灰黄或深褐色、皱折。有大、小分生孢子、厚孢子。 48
新生隐球菌菌落
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粘液样新型隐球菌在血琼脂
上生长（发亮的表面是由于酵母形成
而产生大量的荚膜多糖）
小结
1、真菌的分类、微生物学特征。 2、真菌的微生物学检查主要有：标本直接涂 片镜检、分离培养和鉴定； 3、浅部感染真菌直接镜检的标本处理方法； 4、深部感染真菌： （1）白假丝酵母菌芽管形成试验，厚膜孢子形 成试验； （2）隐球菌印度墨汁负染色镜检。
表皮癣菌属
菌落棕黄色，扁平至放射状皱折、粉状或绒状，反面黄褐色。棒状壁光滑 大分生孢子，陈培养中厚孢子增多。
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小孢子菌属
生长快，菌落浅黄褐色、粉末或绒毛状，反面黄橙色；梭形厚壁大分生孢子 50
皮肤癣真菌引起癣症的特点：
❖ 接触传染
❖ 同种皮肤癣菌可在不同部位引起病变
❖ 相同部位的病变也可由不同的皮肤癣菌引
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1. 临床标本的采集
临床标本的类别
❖ 皮肤的角质性物质； ❖ 各种分泌物和排泄物； ❖ 血液和体液； ❖ 脓汁及渗出物。
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采集标本注意事项
1、采集的标本要适宜：不同真菌感染应采取不
同的临床标本。
2、用药前采集标本： 3、采集的标本量要足：血液和脑脊液5ml，
胸腔液20ml 4、严格无菌操作： 28 5、采集的标本立即送检：
观察真菌菌落的色素、鉴别深 部真菌，使二相型真菌呈酵母 型
刺激真菌孢子形成
血琼脂
多数病原性真菌
皮肤真菌实验培养基（DTM） 分离皮肤真菌
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❖ 平皿培养：只能培养生长繁殖较快的真菌; ❖ 大试管培养:用于皮肤癣菌的培养和真菌菌种的保存; ❖ 玻片培养(微量、小培养):可用于真菌菌种的鉴定。
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观察菌落形态应注意：
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定义：侵犯皮肤、毛发、指甲等角化组织。 分类：皮肤癣真菌(临床最多见）
表皮感染真菌 皮下组织感染真菌
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皮肤癣真菌
侵犯皮肤、毛发、指甲等角蛋白组织引起癣症 （发癣、体癣、甲癣等），分三属，约45种
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皮肤癣菌的特征
属名
种 数
毛癣 21 菌属
小孢子 癣菌属
15
表皮癣 菌属
1
侵犯部位
形态特征
皮 指 毛 大分生孢 小分生孢
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2、分离培养与鉴定
（1）分离培养：沙氏培养基25℃和37℃，25d观察。非致病性隐球菌在37℃不生长。
（2）鉴定： A、酚氧化酶试验：棕黑色菌落 B、脲酶试验：培养基由黄转粉红色 C、糖同化及发酵试验：同化葡萄糖、半乳
糖、蔗糖和肌醇，但不发酵糖类、不同化硝酸 盐 。非致病性隐球菌不同化肌醇。
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阳性结果意义 1.有诊断意义； 2.代表组织相、确定某些致病性真菌属或种； 3.判断某些真菌种的致病性等
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直接镜检局限性
1.阴性结果不能排除真菌感染; 2.有假阳性结果。
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2.抗原检测: 采用免疫学方法检测真菌抗原，常用的方法有胶 乳凝集试验、ELISA、半定量放射免疫测定法。
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3.分 离 培 养
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其它浅部真菌
花斑癣
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糠秕马拉色菌
着色真菌
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花瓶型分生孢子
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孢子丝菌
孢子丝菌
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深部感染真菌
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定义：能侵袭深部组织和内脏及全身的真菌. 主要致病菌： 假丝酵母菌 隐球菌 曲霉菌 毛霉菌 组织胞浆菌 卡氏肺孢菌
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一、假丝酵母（Candida）
俗称念珠菌，有81种，11种对人致病； ❖ 引起女性的假丝酵母菌性阴道炎、
纤维素。 ❖ 有性和（或）无性繁殖。
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真菌的形态特性 单细胞：酵母型（yeast）、类酵母型（yeast-like ）
真菌
圆、卵圆，出芽方式繁殖 新生隐球菌，白假丝酵母菌
多细胞：霉菌型( mold ) 菌丝(hypha)、孢子(spore), 交织成团，称丝状菌 癣菌、霉菌
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出芽生长
单细胞真菌呈圆形，以出芽方式繁殖，芽生孢子成熟后脱 落成独立个体
疣状毛癣菌感染的 大孢子发外型感染 的头发
犬小孢子菌引起的 小孢子发外型感染 的头发
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3. 分离培养与鉴定
标本处理及培养：
❖ 皮屑、甲屑和病发标本，用70%乙醇处理，接种 在沙氏琼脂斜面，25℃培养，直至第四周。挑菌 落镜检菌丝和孢子。
鉴定试验：
❖ 如毛发穿孔试验、脲酶试验等。
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被石膏样毛癣菌穿孔的毛发