真菌检验
《真菌检验》课件
真菌检验的主要方法
1
采样
选择适当的采样方法和工具以收集环境中的真菌样品
2
培养
将采样得到的样品培养在适当的培养基上以促使真菌生长
3
识别
利用显微镜和分类学知识对培养得到的真菌进行鉴定
真菌检验的应用领域
室内空气质量
了解室内真菌水平以评估空气质量和呼吸健 康风险
环境研究
研究真菌在生态系统中的角色和影响，以改 善环境保护
真菌检验的发展趋势
自动化技术
利用自动化设备和软件提高 真菌检验的准确性和效率
分子生物学
应用基因检测和测序技术以 更快速、精确地鉴定真菌，发现新的应用领域
总结与展望
真菌检验是一项关键的环境科学技术 随着技术的不断发展，真菌检验将在更多领域发挥重要作用 感谢您参与我们的《真菌检验》PPT课程
食品工业
监测食品加工过程中的真菌污染以确保食品 安全
医学诊断
帮助诊断真菌感染疾病，并确定适当的治疗 方法
真菌检验的优缺点
• 优点：提供精确的真菌信息，有助于保护健康和环境 • 优点：可以快速鉴定真菌，提高工作效率 • 缺点：需要专业知识和设备，成本较高 • 缺点：某些真菌难以培养和鉴定，可能导致结果不确定
真菌检验
欢迎来到《真菌检验》PPT课件 在本课程中，我们将探讨真菌检验的基本概念和实际应用案例
什么是真菌检验
真菌检验是一种用于检测和鉴定环境中真菌的方法 通过采样、培养和识别技术，我们可以确定真菌的种类和数量
为什么需要真菌检验
真菌是一类常见的微生物，广泛存在于我们的环境中 虽然大多数真菌对人类无害，但某些真菌可能引发健康问题 通过真菌检验，我们可以评估环境质量，并采取必要的控制措施
真菌检验
• 掌握白假丝酵母菌的鉴定
二、实验器材和试剂
• • • • 菌种：白假丝酵母菌 培养基：沙氏培养基，血琼脂 试剂：革兰染液， 其他：载玻片、小试管、 温箱等。
1.分离培养、菌落检查：将白假丝酵母菌和接种于 沙氏平板和血平板上，室温（ 25 ℃ 左右）培养后 观察其菌落特征。白假丝酵母菌的菌落均为酵母 型，表面光滑湿润．边缘整齐，灰白色或奶酪色。
2.显微镜检查：取白假丝酵母菌培养物制片， 经革兰染色，镜下观察其芽生孢子及是否有 假菌丝
3.芽管形成试验：将假丝酵母菌接种于0.5ml人或动 物血清中，37℃孵育1.5-4h，显微镜观察有无芽管形 成。白假丝酵母菌可由孢子长出短小的芽管。
五、实验结果
• 记录所观察到的菌落形态、染色情况 及相关试验结果。 • 完成实验报告
请确保油镜头擦拭干净！ 请安排同学留下值日
检验科真菌检验流程PIM
深部感染分布于自然界，如土壤、腐败有机物、粮食和饲料等，有时也存在 于正常人体的皮肤和粘膜表面。
（一）分类和命名
其中大多数曲霉只发现了无性阶段，它们归属于半知菌亚门、丝孢菌纲、 丝孢菌目、丛梗孢科，少数种具有性阶段归入子囊菌亚门、不整子囊菌 纲、散囊菌目、散囊菌科。其中对人致病的曲霉主要有烟曲霉
全国临床检验操作规程
真菌病原学检验程序
临床标本
直接检查
分子生物学检测 直接镜检
经固定标本染色 墨汁法 法：亚甲蓝染色 染色法 法、革兰染色法、 P法A。S、荧光染色脑 痰 脓
脊 液汁 液
动
分离培养
物
实
沙氏培养基 验
KOH法
25°C 37°C
毛发 指甲 皮屑 脓汁 痰液
观察菌落 菌丝型 酵母型
镜 小生 检 培化
曲霉可侵犯机体许多部位，尤其是呼吸系统，引起肺曲霉病。曲霉可局限在肺内感 染也可播散到其他器官，甚至引起全身性感染。曲霉还可诱发超敏反应引起过敏性 支气管肺曲霉病。
有些曲霉可产生毒素引起食物中毒，有的毒素如黄曲霉毒素、杂色曲霉素有致癌作 用，特别是黄曲霉毒素与人类原发性肝癌的发生密切有关。
深部感染真菌检验
养反 应
病
检
检
理
测
测
组
抗
抗
织
原
体
标
本
葡聚糖
PAS
HE 甘露聚糖
全国临床检验操作规程（第四版） 783页图4-6-1
2015年3月第一版
真菌鉴定程序
标本的采集、运送和保存
检验真菌的方法
检验真菌的方法
1. 直接镜检法：将短柄棉签蘸取患部分泌物、皮屑、毛发等样本，涂于玻璃片上，用40倍至100倍的显微镜下观察，检测真菌的形态和数量。
2. 细胞学检查法：可采用细胞学方法检查骨髓、淋巴结等组织样本中是否存在真菌，包括涂片法、细胞学初筛法、细胞学制片法等。
3. 培养法：将样本接种于含有丰富营养成分的培养基上，利用真菌的生长特点判定是否存在真菌的培养。
4. 核酸检测法：查找真菌的DNA或RNA序列，并使用PCR 技术的手段拓展浓度，最后用电泳技术侦察出真菌的情况。
5. 基于免疫学的检测：包括诸如ELISA和荧光法等方法，主要检测真菌产生的免疫球蛋白或抗原，以用于检测真菌是否存在。
真菌感染检验
浅部感染真菌检验-皮肤癣菌
❖ （三）真菌检验
❖ 1.标本的采集、运送和保存
❖ 1）甲标本 采集标本前用75%乙醇彻底清洁病甲，以 减少培养时的细菌污染，提高镜检的阳性率。钝刀用 高压或者火焰灭菌，从甲的变色、萎缩或变脆部位、 健甲与病甲的交界处取材，保证一定量与一定深度标 本。甲标本建议取材后立刻进行真菌镜检及培养，甲 标本应尽量剪碎后接种。对于伴有甲沟炎患者的取材 ，应采用棉拭子，75%乙醇清洁局部后沾取损害分泌 物，每位患者至少应取两个拭子，放入无菌试管中以 备镜检和培养。
❖ 侵入表皮后，在皮肤角质层外2/3处生长、繁殖，引起一 种慢性、无症状或轻微症状的皮肤斑疹，呈灰白色、褐 色或淡黄色，上面附着细小糠皮样鳞屑，有时可融合成 片，似汗渍斑点，俗称汗斑即花斑癣（tinea versicolor）。皮损最常见于胸、背、臂的上半部皮脂 腺丰富部位。病程缓慢，多年不愈，对健康无碍，但影 响美观。油性皮肤易感，而且与遗传、免疫缺陷等因素 有关，诱发因素为高温多汗。近年大量研究显示，糠秕 马拉癣菌还可引起毛囊炎，可能为脂溢性皮炎的重要发 病原因之一。
浅部感染真菌检验-皮肤癣菌鉴定
❖ 1.毛癣菌属 在SDA（加CCG）上27+1℃培养，毛癣菌 属菌落生长速度慢到中等；质地光滑到毛状；表面呈 白色、黄色、米黄色或红紫色，背面呈苍白色、黄色 、褐色或红褐色。显微镜下大分生孢子呈多细胞、圆 柱状、棒状或香烟形，壁光滑，常缺乏。小分生孢子 呈单细胞、圆形、梨形或棒形，孤立或像葡萄状群生 。有时存在关节型孢子和厚膜孢子。
浅部感染真菌检验-皮肤癣菌
❖ （三）真菌检验
❖ 1.标本的采集、运送和保存
❖ 2）皮屑标本 采集标本前用75%乙醇清洁取材区域。 用高压或者火焰灭菌钝刀，从损害的边缘向外刮取或 用剪刀剪去疱顶。如果鳞屑量较少或婴幼儿患者，可 采用粘着透明胶带或粘着皮肤采样送检，将透明胶带 粘着面紧压于损害之上，然后剥下，将粘着面向下贴 在透明载玻片上送检。皮屑标本建议取材后立刻进行 真菌镜检及培养。
真菌培养检查方法
真菌培养检查方法真菌培养检查是医院常用的检查方法，用于检测和鉴定真菌感染。
以下是真菌培养检查的步骤和注意事项：1. 采集标本：根据感染部位的不同，采集不同的标本。
例如，对于皮肤真菌感染，可以从病灶边缘刮取皮屑；对于深部真菌感染，可能需要采集血液、尿液等标本。
采集的标本应该尽快送往实验室进行培养，以免影响检查结果。
2. 培养基选择：根据不同的真菌种类，选择不同的培养基。
常用的培养基有沙保弱培养基、孟加拉红培养基等。
培养基的选择应该根据实验室的具体要求进行选择。
3. 接种：将采集的标本接种在培养基上，接种时要避免污染。
接种后将培养基放入恒温箱中进行培养。
4. 观察：在培养期间，需要定期观察培养基上是否有菌落生长。
一般情况下，真菌在培养基上生长需要几天到几周的时间。
如果发现有菌落生长，需要进行形态学鉴定和生化反应等试验，以确定真菌的种类。
5. 鉴定：通过形态学鉴定和生化反应等试验，可以确定真菌的种类。
有时还需要进行其他检查，如药敏试验等，以确定真菌对不同药物的敏感性。
6. 报告：鉴定完成后，医生会将结果报告给患者。
报告中包括真菌的种类、药敏试验结果等内容。
根据报告，医生可以制定相应的治疗方案。
注意事项：1. 在采集标本前，应该注意个人卫生，避免污染标本。
2. 培养期间，应该保持恒温箱的温度和湿度，以确保培养基上的真菌能够正常生长。
3. 在鉴定真菌时，应该注意观察菌落的形态和颜色等特征，以及进行生化反应等试验，以确保鉴定结果的准确性。
4. 对于深部真菌感染，需要进行多次检查，以排除假阳性的可能。
真菌检验
蒸馏水100 ml配制：用蒸馏水将氯化钠溶解即可。 25、观察菌落形态时应注意什么？ 观察菌落形态时应注意：（1）菌落性质，是酵母菌还是霉菌；（2） 菌落大小，一般病原性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大；（3） 菌落颜色，一般病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深。（4）致病性 真菌菌落下沉，污染性真菌菌落不下沉；致病性真菌有时使培养基 开列，但污染霉菌很少引起培养基开列。 26、分离皮肤真菌的皮肤真菌实验培养基是什么？ 培养基是：（DTM）含蛋白胨、葡萄糖、酚红、放线菌酮、庆大霉素、 四环素等成分。由于皮肤真菌的代谢产物呈碱性，以致其生长周围 的培养基呈红色。 27、分离新生隐球菌的选择培养基是什么？ 分离新生隐球菌的选择培养基是左旋多巴-枸橼酸铁和咖啡酸培养 基，因新生隐球菌有酚氧化霉（Plrno oxidase）活性，此霉与左旋 多巴和枸橼算铁反映时，能氧化O-联苯酚形成黑素而呈褐色至黑色， 或酚氧化霉和咖啡酸作用而显棕色菌落。 28、真菌培养的方法有几种？各自优缺点是什么？ 培养方法有平皿培养、大试管培养和玻片培养等。平皿培养的优点 是表面较大可使标本散布，便于观察菌落形态，但水分易蒸发，只 能培养生长繁殖较快的真菌，如假丝酵母菌、隐球菌。大试管培养 的优点是水分不易蒸发，主要用于皮肤癣菌的培养和真菌菌种的保 存。玻片培养（为量培养、小培养）是将培养皿的真菌培养切成一 个1cm*1cm的小方块在无菌载玻片中央，然后将真菌点种于小方块培 养基的一侧，再盖上无菌盖玻片后培养，培养后将其盖玻片放入另 一载玻片上于显微镜下观察菌丝和孢子，可用于真菌菌种的鉴定。 29、真菌的生化反映有哪些？ 检验真菌常用的生化反映有糖（酵）类发酵试验、同化碳源试验、 同化氮源试验或利用硝酸钾试验、牛乳分解试验、酚氧化酶试验、 明胶液化试验和脲酶试验等。主要用于检验深部感染的真菌。 30、配置培养基的一般步骤是什么？ （1）按要求称取脱水培养基，倒入所要求量的蒸馏水中，反复搅拌 使各成分混合成均匀混悬液。（2）各成分混合均匀后以文火缓慢加 热并不断搅拌，煮沸1 min，不能过热，以免破坏有效成分。（3） 分装试管应在高压灭菌前，而分装平皿应在高压灭菌后，均待培养 基冷却至45-50度时分装。（4）高压灭菌一般为118-121度，6.81kg
真菌检验技术
真菌检验技术在医学领域，真菌检验技术是诊断真菌感染、保障患者健康的重要手段。
真菌作为一类广泛存在于自然界中的微生物，有时会引发各种疾病，从轻微的皮肤感染到严重的系统性感染都有可能。
因此，准确、及时的真菌检验对于疾病的诊断、治疗和预防至关重要。
真菌检验技术多种多样，首先要提到的是直接镜检法。
这种方法相对简单快捷，医生通常会从患者的感染部位采集样本，比如皮肤鳞屑、指甲碎屑、痰液、脑脊液等。
然后将样本制作成涂片，经过染色处理后，在显微镜下直接观察。
如果能看到真菌的孢子、菌丝等结构，就可以初步判断存在真菌感染。
但直接镜检法也有一定的局限性，比如真菌数量较少时可能会漏检，而且不能准确鉴定真菌的种类。
培养法是真菌检验中另一种常用的技术。
将采集到的样本接种在适合真菌生长的培养基上，然后在一定的温度、湿度和氧气条件下培养。
经过一段时间后，如果培养基上长出了真菌菌落，就可以进一步进行鉴定和药敏试验。
培养法的优点是可以获得纯培养的真菌，便于进行更详细的鉴定和药敏分析，但它也有缺点，那就是培养周期较长，一般需要数天甚至数周的时间，而且有些真菌在常规培养基上不易生长，可能导致假阴性结果。
随着科技的不断发展，分子生物学技术在真菌检验中也得到了越来越广泛的应用。
聚合酶链反应（PCR）技术就是其中之一。
通过设计针对真菌特异性基因片段的引物，对样本中的真菌 DNA 进行扩增，然后通过检测扩增产物来判断是否存在真菌感染。
这种方法具有高度的敏感性和特异性，能够快速检测出微量的真菌 DNA，而且还可以对真菌进行种属鉴定。
此外，还有一些基于核酸杂交和基因测序的技术，也为真菌的准确鉴定提供了有力的手段。
血清学检测也是真菌检验的重要组成部分。
例如，检测患者血清中针对特定真菌的抗体或抗原。
当人体感染真菌后，免疫系统会产生相应的抗体。
通过检测这些抗体的水平，可以辅助诊断真菌感染。
但血清学检测也存在一些问题，比如在感染的早期，抗体可能还未产生，或者在某些免疫功能低下的患者中，抗体反应可能不明显。
真菌临床检验技术
真菌临床检验技术真菌临床检验在诊断和治疗真菌疾病中扮演着至关重要的角色。
由于真菌感染菌种构成的变化，新的条件致病真菌的出现，以及真菌感染率的提高，我们需要更为精细和深入的检测工作，以便确定真菌种类和其对抗真菌药物的耐药性。
对真菌进行精确的识别和耐药性分析，可以为临床治疗提供重要依据，从而有助于患者的快速恢复。
这里就带大家一起来了解常见的真菌临床检验技术。
1.标本采集标本采集是检验的基础，需根据病人的具体情况和疾病种类，选择合适的采集方法。
如果疑似浅表真菌感染，例如体癣，可刮取病变部位的边缘痂皮。
对于疑似深部真菌感染，需要采集的标本包括脓液、痰液、脑脊液、血液等。
无论何种情况，标本的采集都需要在尚未使用药物治疗前完成。
如果已经用药，需要停药一周后才能再次采集标本。
另外，标本的采集必须足量，一般情况下，活体组织需要两份（一份用于显微检查和培养，一份送给病理科进行检查），皮屑需要两块，胸腔液为20毫升，脑脊液和血液为5毫升。
在操作过程中，需要保证无菌，避免二次感染。
采集完成后的标本要尽快送检，保存时间不超过两小时，特别是对于深部真菌标本。
2.直接检查法真菌直接检验主要在显微镜下进行。
首先，取一部分患者的标本，放置在玻璃载片上，加入适量的载液。
在平均分布标本后，用另一块玻片覆盖。
待片刻，利用火焰迅速烘烤载玻片，但不可持续加热以避免结晶。
随后，轻压盖玻片，除去气泡的同时使标本尽可能压薄。
清理周围的溢液后，可以用显微镜观察。
初步选择低倍镜，观察是否存在孢子或菌丝。
确定存在后，使用高倍镜进行细致观察，描绘出孢子和菌丝的排列、大小、位置、特征和形态等。
真菌直接检查是一种较为快速和直接的检测方法，其结果可以明确患者是否被真菌感染。
如果结果为阳性，可以确诊患者的真菌感染；如果结果为阴性，仍不能排除真菌感染的可能性。
通过显微镜，我们可以明确部分病原菌种，如花斑癣菌、新型隐球菌等，也能够确定某些特定的菌属，如念珠菌属。
真菌检验操作生物安全要求
真菌检验操作生物安全要求真菌检验是一项涉及到生命科学和生物安全的重要实验。
在进行真菌检验操作时，实验人员需要遵守一定的生物安全要求，以保障自身安全并避免对环境造成负面影响。
实验人员生物安全要求1. 培训在进行真菌检验操作之前，实验人员应接受培训，掌握真菌实验操作、生物安全基本知识以及应急处理措施。
2. 个人防护实验人员在进行真菌检验操作时，应穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、手套、口罩等。
更换实验服、洗手、戴好手套等操作时都应注意生物安全。
3. 安全操作实验人员在进行真菌检验操作时，应遵循规范的实验操作流程，如操作要求仔细阅读实验手册，操作前应先确认所需试剂和设备齐全。
4. 废弃物处理实验人员在进行真菌检验操作后，应妥善处置废弃物，并避免将实验室中的废弃物外带，避免对环境造成污染。
实验室生物安全要求1. 实验室设置真菌检验的实验室应配备通风设备、安全柜等设备，保证室内循环空气。
实验室的温度、湿度等也需要严格控制，符合实验要求。
2. 实验室管理实验室管理人员需要对实验人员进行生物安全及实验操作规范知识培训，监督实验人员的操作，保证实验室安全、卫生环境良好。
3. 实验室清洁实验室应每日定期清洁，特别是实验室表面、设备表面、实验台等需要定期清洁、消毒，遵循规范的操作流程。
4. 实验室设备维护实验室里的设备应在定期进行维护，保证设备的完好性，避免操作中出现设备失效等问题，影响实验过程。
总结实验人员在进行真菌检验操作时，应注意生物安全要求，遵循规范的实验操作流程，保障自身安全并避免对环境造成负面影响。
实验室管理人员需要对实验室进行管理，定期进行清洁、维护、培训等，确保实验室环境安全、卫生、稳定。
真菌感染的常规检验方法
真菌感染的常规检验方法真菌的临床实验室检查一般包括标本采集、直接镜检、染色镜检、分离培养、生化反应及免疫学试验等。
以直接镜检和分离培养最重要。
1标本采集不同真菌感染应采用不同的临床标本。
浅部真菌感染可以采集毛发、皮屑、指(趾)甲、痂等，标本在分离前常先用75％的乙醇消毒。
深部真菌感染的检查可取痰、尿液、口腔或阴道分泌物、脑脊液、各种穿刺液和活检组织等。
采集标本时应注意无菌操作。
采集标本后应及时转运至实验室进行检查，一般不超过1～2h，以免标本变质污染。
标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。
2检查方法2.1 直接检查法直接镜检是最简单也是很有价值的实验室诊断方法。
其优点在于简便、快速，无菌部位的阳性结果可直接确定真菌感染。
但是，除了少数真菌外，多数不能确定其种类。
由于阳性率较低，阴性结果亦不能排除诊断，有时需反复检查或做其他方法检查以进一步确定。
直接镜检对于浅表和皮下真菌感染最有帮助。
2.1.1 不染色标本检查取皮屑、毛发、指(趾)甲屑等标本置于载玻片中央，滴加100～200g／L KOH溶液1～2滴，以盖玻片覆盖后在火焰上微微加热，使组织或角质溶解、透明后，先于低倍镜检查有无真菌菌丝或孢子，再以高倍镜检查其特征，可初步诊断真菌感染。
2.1.2 染色标本检查有些真菌如深部真菌需要染色后才能更清楚地观察，常用的染色方法如下。
(1)革兰染色法：多用于白假丝酵母菌、孢子丝菌和新近感染的组织胞浆菌等。
所有真菌均为革兰阳性。
(2)乳酸酚棉蓝染色法：取标本于载玻片上，滴加染液，加上盖玻片后于镜下观察，真菌被染成蓝色。
该法适用于各种真菌的直接检查，培养物涂片检查及小培养标本保存等。
(3)荧光染色法：用0.1％吖啶橙对标本涂片和组织切片进行染色，在荧光显微镜下观察，白假丝酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌为黄绿色，新型隐球菌、鼻孢子菌为红色，组织胞浆菌为红黄色，曲霉菌为绿色。
2.2 分离培养法真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。
检验科真菌学常见检测与分析方法
检验科真菌学常见检测与分析方法在检验科真菌学中，常见的检测与分析方法有多种，本文将详细介绍其中的几种方法。
一、直接镜检法直接镜检法是最常用的真菌检测方法之一。
该方法通过将待检样品直接放置在显微镜下观察，利用显微镜放大功能，检测并鉴定真菌的存在。
该方法操作简便，可以迅速获取初步结果，但其只能观察到菌丝、孢子等大型的真菌结构，对于微小的真菌可能存在漏检的情况。
二、培养法培养法是真菌学研究中较为常用的方法之一。
通过将待检样品放置于培养基上，促使真菌生长繁殖，从而观察和鉴定真菌的种类和数量。
培养法可以提供更多的细节信息，如真菌的形态、颜色、生长速度等，有助于进一步分析和鉴定。
然而，培养法需要较长的时间，一般需要数天至数周，且对于一些难以培养的真菌无法得到准确的结果。
三、PCR技术PCR（聚合酶链反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术。
在真菌学中，PCR技术可以用来检测和分析真菌DNA，从而确定真菌的存在和种类。
该方法的优势在于其高度敏感性和快速性，能够快速检测到微量真菌，并且可以对样品中的复杂菌群进行分析。
然而，PCR技术需要专门的实验设备和试剂，且对实验操作要求较高。
四、质谱分析质谱分析是一种基于质荷比的分析方法，可以用于真菌学中的检测和鉴定。
通过将待检样品进行质谱分析，可以得到真菌的分子质谱图谱，进一步进行真菌的鉴定和分类。
质谱分析具有高灵敏性和高分辨率的特点，可以准确地确定真菌的种类。
然而，质谱分析设备昂贵且操作复杂，需要专业的技术人员进行操作和解读结果。
综上所述，真菌学的常见检测与分析方法包括直接镜检法、培养法、PCR技术和质谱分析。
每种方法都有其优势和局限性，选择合适的方法需要根据具体情况和实验目的进行综合考虑。
在真菌学研究和检测过程中，通过运用这些方法，可以对真菌进行准确的检测和分析，为疾病的防控和治疗提供重要的科学依据。
真菌培养及鉴定方法有哪些
真菌培养及鉴定方法有哪些真菌培养及鉴定方法有哪些真菌的营养要求不向。
在一般细菌培养基上均能生长。
真菌培养及鉴定有哪些的呢?本文是店铺整理真菌培养及鉴定的资料，仅供参考。
真菌培养及鉴定1.采集标本体表真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等，标本在分离前常先用75%的乙醇消毒。
深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴-道分泌物、血液、脑脊液、各种穿刺液和活检组织，采集标本应注意无菌操作。
2.培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。
标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基(Sabouraud agar)上，置室温或37℃培养1～3周。
必要时可行小培养协助鉴定。
菌种鉴定常根据菌落的形态及显微镜下形态判断。
对某些真菌，有时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、分子生物学方法确定。
真菌培养的方法与直接镜检法相比较而言，更能对大部分真菌感染的灰指甲作出准确的鉴定，也是诊断灰指甲的一个很重要的手段。
下面我们就从培养基的选择、培养时间、菌种鉴定三方面来了解一下灰指甲的真菌培养法。
1.培养基的选择通常培养真菌会同时选用两种培养基，如果单用一种培养基，则容易忽略其它种类的真菌诊断。
常见的两种培养基，一种为沙氏葡萄糖琼脂培养基中加抗菌剂，常为氯霉素和放线菌酮;另一种是沙氏葡萄糖琼脂培养基中仅加氯霉素，不加放线菌酮。
2.培养时间各种真菌的生长速度不同，所以报告的时间也不同。
一般皮肤癣菌生长较缓慢，在26℃-28℃的环境下需要培养2-4周才能发报告，但是，皮肤癣菌含盖的菌种较多也需要区别对待;酵母菌生长较快，通常2-3就可以发报告，如果为阴性则需要观察1周;霉菌生长也比较快，一般2-4天就可以发报告。
3.菌种鉴定(1)丝状真菌：包括皮肤癣菌和霉菌，根据菌落形成所需要的时间，在不同条件下生长的情况，菌落表面及背面的形态、色素，培养基中有无色素，培养物用乳酚棉蓝染色后镜检找特征性标志结构。
(2)酵母菌：分为形态学鉴定及生化试验。
真菌检验技术—真菌的培养技术(微生物检验课件)
❖ 通过培养可确定菌种，辅助直接检查的不足； ❖ 通常用沙保氏培养基（SDA）（22～28℃）； ❖ 深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37℃培养；
❖ 温度 :22 ℃ ～ 28℃(深部真菌:28 ℃ / 37℃)需氧、 湿度高;PH :4.0～6.0 (弱酸性)
真菌的分离培养
真菌培养是目前鉴定真菌的惟一方法。培养 真菌的温度为28℃，但深部真菌为37℃。菌落是 鉴别真菌的方法。注意以下几点：
①菌落性质：酵母菌还是霉菌； ②菌落大小:病原性真菌菌落小，而条件致病性真
菌菌落大；
③菌落颜色:病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；
④致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污
❖ 生长速度 : 慢(1～4周见典型菌落) ❖ 菌落特征 :酵母/酵母样菌 :光滑 柔软、湿润;丝状
菌:疏松 (绒毛状、棉絮状、粉末状);颜色 (正 / 背 面)
常用培养方法
❖ 试管法---初代培养、菌种保存 ❖ 大培养---纯种的培养、研究 ❖ 小培养---菌种鉴定 (玻片法 钢圈法 方块法)
真菌检验【送检】SOP--标本采集及处理课件
2h 内常温送检
4°C保存
24
眼(角膜刮片、玻璃体液等)标本采集及处理
. 角膜刮片或针吸玻璃体液。 . 15 分钟内常温送检。若不能及时送检，则常温保存。角膜刮片直接接种
至不含抑制剂的培养皿中，采用 X 或 C 型涂菌方式，玻璃体液离心后取
沉淀物接种。
15min 内常温送检
不含抑制剂的培养皿 接种培养
不能送检时，常温保存
19
无菌体液 (脑脊液、心包液、腹水和关节液) 标本处理二
. 标本大于 2ml，则 2000g 离心10 分钟，取沉渣接种。 . 若标本量少于 2ml，则将标本直接接种于培养基。
. 推荐使用细胞离心机对无菌体液进行涂片镜检。脑脊液可直接接种于血培养瓶。
离心10min
接种培养
涂片镜检
3
2. 最小抑菌浓度 MIC
按照标准操作规程进行体外真菌稀释法或连续浓度梯度稀释法药物敏感性 试验时，在特定培养时间及温度的条件下，能导致特定程度肉眼可见真菌 生长抑制的最低药物浓度。
4
3. 剂量依赖敏感 S-DD
. 给予高于常规给药剂量，且达到最大血药浓度时，临床有效。
4. 最低有效浓度 MEC
9
血液标本采集
. 推荐在抗真菌药物使用前，发热初期或寒颤期、采静脉血或骨髓液。 . 立即注入血培养瓶内并轻轻摇匀。至少采集 2 套。 . 标本与培养基比例为 1/10-1/5 (成人每瓶 8-10ml)、必须包括需氧瓶或
真菌瓶。
10
血液标本处理
. 2h 内常温送检。若不能及时送检，则常温保存。
2h 内常温送检
6
6. 消化液 lysis solution
. 粘液溶解作用，用于呼吸道标本等的前处理，常用N-乙酰-L-半胱氨酸、 5%草酸或二巯基苏糖醇等。
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真菌检验医学真菌学检查是诊断真菌病的重要依据,随着真菌感染病例的日益增多,对实验室的诊断也提出了更高的要求.不论是患者浅部或深部感染诊断,几乎全依赖于临床标本的真菌学检查.特别是系统性真菌感染,其早期特异的诊断方法是挽救患者生命的关键,而病原真菌的形态结构十分多样,在不同条件下同一真菌也可有不同特点的形态.因此,在真菌的实验室检查中,必须熟练掌握各类真菌的形态特征以及在不同条件下的演变规律,才能获得对致病真菌正确的诊断.目前真菌感染的实验室检查方法主要包括常规检查法和特殊检查法两类.常规检查法主要包括①形态学检查(直接镜检+染色镜检).②培养检查.③组织病理学检查.特殊检查主要包括①血清学方法.②分子生物学方法.一,进行真菌实验室诊断的注意事项①应有独立实验室,不应与其他细菌,病毒等实验室共用,以防发生相互污染.②在每天工作前与工作后,工作台均要以消毒水例如5%石碳酸或0.5%过氧乙酸擦拭,如遇操作台被真菌或标本污染,应即覆盖纸巾,并用5%石碳酸消毒20min,切忌工作台污染后即用水冲洗,以免污染扩散.③培养菌检体及真菌污染的物质在丢弃前,必须高压灭菌或焚烧.④在进行真菌检查时,不可试着闻平板培养基特殊的气味.⑤不可对Histoplasma capsulatum 以及Coccidioides immitis进行载玻片培养技术,因为其等具有高度感染性的孢子能够随着空气传播.⑥实验室禁止任意养花,草,动物等生物,以防实验污染.⑦工作环境应定期消毒.一般紫外线照射不能杀灭真菌,应用40%甲醛(可于每4㎡空间用35ml 40%甲醛加18g高锰酸钾)在密闭情况下熏蒸24h,或用环氧乙烷进行消毒,每2～4周消毒1次.⑧如果用平板培养基接种标本,必须将平板培养基密封,以免发生危险,在不常做真菌检测的实验室,最安全的培养方法是利用含有棉花塞的试管培养基(使空气能够循环).⑨美国梅育诊所主张利用平板培养基进行真菌的分离,步骤如下平板培养基必须在生物安全箱内操作及检查.平板培养必须用胶带封好,平板培养基必须含30ml的量,并保持培养箱60%以上的湿度,同时增加琼脂的浓度至2%,以免脱水.⑩真菌的诊断,需要经验的累积及备有良好的图谱参考书.二,分离及鉴定真菌的培养基配制培养基的一般原则①各成分混匀后以文火缓慢加热,并不断搅拌,煮沸1min,过热会破坏有效成分.②分装试管应在高压灭菌前,而分装平皿应在高压灭菌后.③高压灭菌一般在118～121磅,10～15min.④需加血液或不能高压的成分如抗生素,应在培养基冷却至50 左右时加入混匀.⑤试管分装量约7~8ml,平皿约15ml,如需培养4～6周,平皿内应有35～40ml的量.培养基中抗生素的浓度和添加方法氯霉素,庆大霉素和放线菌酮能耐热,可在培养基高压灭菌前加入,其他抗生素均在培养基高压灭菌后冷却至45℃～50℃时加入.青霉素20～100μgml,链霉素40～200μgml,氯霉素50μgml,放线菌酮500μgml,庆大霉素5μgml.分离和鉴定真菌的培养基各种医学真菌所用培养基的成分,又可根据不同要求,分成分离,富集,选择,特性研究等含不同成分培养基,具体见表.表分离鉴定真菌培养基分类表培养基种类分离用培养基使用目的1.Brain heart infusion agar 分离腐生性及病原性真菌2.Brain heart infusion agar with antibiotics 分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌3.Brain heart infusion biphasic bloodCulture bottles 从血液中分离真菌4.Dermatophyte test medium 分离皮肤丝状菌,建议仅做筛检用5.Inhibitory mold agar 分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌6.Mycosel or mycobiotic agar 分离皮肤丝状菌7.Ssbouraud dextrose agar 分离腐生性及病原性真菌8.Yeast estract phosphate agar 分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌区分试验培养基1.Ascospore agar 检测产子囊孢子酵母菌2.Cornmeal agar with Tween 80 and trypan blue 检测产厚膜孢子酵母菌3.Cottonseed conversion agar 使双相型真菌由霉菌型转变为酵母型4.Czapek's agar 分离及区分Aspergillus spp5.Niger seed agar 鉴定Cryptococcus neoformans6.Nitrate reduction medium 检测Cryptococcus spp.还原nitrate能力7.Potato dextrose agar 证实Trichophyton rubrumm 产色素能力制作载玻片培养技术8.Yeast fermentation broth 测定酵母菌的发酵能力9.Yeast nitrogen base agar 测定酵母菌的糖类同化能力三,临床样本的采集与处理皮屑边缘,疱壁,脓液,深层趾(指)间皮屑或活动边缘皮屑,取材前75%酒精消毒,作KOH涂片,同时种于沙氏琼脂加氯霉素2管,置25℃培养2周.甲屑用细挫或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑,标本用酒精浸泡待干燥后种于沙氏(SDA)培养4周,并同时作KOH涂片.毛发取病发(变色,无光泽,弯曲,脆易折断,松动易拔除)15根,75%酒精消毒,3～5根作直接镜检,5～10根种于沙氏琼脂(加氯霉素),划破斜面掩埋.(四)脓液无菌采集,注意颗粒,用无菌蒸馏水稀释后寻找.可作G染色或抗酸染色,常规的KOH 涂片及SDA接种培养也是必要的.CSF 采集于无菌试管3～5ml,立即送检.置冰箱不宜超过1h.离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1ml,作墨汁涂片镜检和培养(SDA)25℃或37℃4周.血液无菌抽血3～5ml立即于无菌抗凝管中,BHIB血标本量为培养基量的110,37℃5～7d出现浑浊或菌团,挑取镜检同时移种SDA(注每天检查完毕后需摇动培养基,37℃震荡培养可加速真菌的生长,提高检出率.不作直接检查,因其直接检查阳性率低.体液,痰液,尿液,粪便①体液标本量10ml离心沉淀取2ml沉淀液做直接镜检培养.②晨痰3～5ml集于无菌瓶中(无菌生理盐水漱口数次后),挑取黏液或脓性部分KOH涂片培养.③早晨中段尿或清洁尿10ml,离心取沉淀液1ml做KOH涂片培养(SDA每管种0.5ml).④拭子一般尽量不用,缺点 A.不能得到足量的标本;B.采集的标本也不易从棉花纤维上分离下来;C.容易干竭.采集标本后应迅速放入内装1~2ml无菌蒸馏水的试管送检KOH涂片培养.⑤纸盒送检,挑取黏液,脓血,乳酪样部分KOH涂片培养(加抗生素)注单纯培养阳性,不一定有临床意义,KOH涂片发现菌丝,有诊断意义.组织标本置无菌平皿中立即送检,置无菌匀浆器加2ml蒸馏水,研磨成浆或1～2mm3的小块,KOH涂片培养.四,真菌学检验的基本技术直接镜检是最简单也是最有用的实验室诊断方法,常用的方法有①氢氧化钾复方氢氧化钾法标本置于载玻片上,加一滴浮载液,盖上盖玻片,放置片刻或微加热,即在火焰上快速通过2～3次,不应使其沸腾,以免结晶,然后轻压盖玻片,驱逐气泡并将标本压薄,用棉拭或吸水纸吸去周围溢液,置于显微镜下检查.检查时应遮去强光,先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子,然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态,特征,位置,大小和排列等.浮载液A.10%~20%的KOH.配方氢氧化钾10～20g,蒸馏水加至100ml,待氢氧化钾完全溶解后揺匀存放在塑料瓶内,适用于皮屑,甲屑,毛发,痂皮,痰,粪便,组织,耵聍等的检查.B.复方氢氧化钾溶液配方氢氧化钾(AR)10g,二甲基亚砜(AR)40ml,甘油50ml, 蒸馏水加至100ml,配制方法将氢氧化钾先加入30ml蒸馏水中溶解后,再依次加入DMSO,甘油揺匀后,用蒸馏水加到100ml,装入塑料瓶内.此配方的优点是配方中加DMSO,能促进角质的溶解,有甘油涂片不易干,不易制成氢氧化钾结晶,氢氧化钾的浓度相对低,腐蚀性亦低,为进行大面积普查或大批量采集标本作镜检带来了方便.②胶纸粘贴法用1cm×1.5cm的透明双面胶带贴于取材部位数分钟后自取材部位揭下,撕去复带在上面的底板纸贴在载玻片上,使原贴在取材部位的一面暴露在上面,再进行革兰染色或过碘酸锡夫染色,在操作过程中应注意双向胶带粘贴在载玻片上时不可贴反,而且要充分展平,否则影响观察.③涂片染色检查法在载玻片上滴1滴生理盐水,将所采集的标本均匀涂在载玻片上,自然干燥后,火焰固定或甲醇固定.再选择适当的染色方法,染色后,以高倍镜或油镜观察.常见镜检染色方法有①革兰染色.所有真菌,放线菌均为革兰染色阳性,被染成蓝黑色.适用于酵母菌,孢子丝菌,组织孢浆菌及诺卡菌,放线菌的感染.②乳酸酚棉蓝染色用于各种真菌培养物的镜检.③印度墨汁用于检测脑脊液(CSF)中的新生隐球菌.④抗酸染色用于抗酸菌及诺卡菌的诊断.⑤瑞氏染色用于组织胞浆菌和马内菲青霉的检测.⑥过碘酸锡夫染色(PAS)用于体液渗出液和组织匀浆等.真菌胞壁中的多糖染色后呈红色,细菌和中性细胞偶可呈假阳性,但与真菌结构不同,不难区别.⑦嗜银染色(GMS)真菌可染成黑色,主要用于测定组织内真菌.真菌培养从临床标本中对致病真菌进行培养,目的是为了进一步提高对病原体检出的阳性率,以弥补直接镜检的不足,同时确定致病菌的种类.真菌培养检查除需要一般细菌检验用到的器具外,还应准备真菌专用的接种针,接种环,或接种钩(用铂丝或镍丝制成),微型小铲,刀片,针头等,常规分离鉴定使用的培养基为沙氏葡萄糖琼脂(SDA)斜面培养基,加0.05%氯霉素,还有多种性质的培养基(见第二部分)以满足各种不同的需要,可酌情选用接种的方法,根据不同的临床标本,大体可分为点植法和划线法两种.①点植法适用于皮屑,甲屑,毛发,痂皮,组织等有形固体标本,将标本直接与培养基表面点状接触.②划线法适用于痰,分泌物,脓液,组织液,组织块的研磨液等液体标本,用接种针(环)划线接种在培养基表面.培养方法有多种,接临床标本接种时间分为直接培养法和间接培养法;按培养方法分为试管法,平皿法(大培养)和玻片法(小培养).①直接培养采集标本后直接接种于培养基上.②间接培养采集标本后,暂保存,以后集中接种.③试管培养是临床上最常用的培养方法之一,培养基置于试管中,主要用于临床标本分离的初代培养和菌种保存.④大培养将培养物接种在培养皿或特别的培养瓶内,主要用于纯菌种的培养和研究.⑤小培养主要用于菌种鉴定,大致分为三种玻片法,方块法和钢圈法.A.玻片法在消毒的载玻片上,均匀地浇上熔化的培养基,不宜太厚.凝固后接种待鉴定菌株,置于平皿中,保湿.待有生长后,盖上消毒的盖玻片,显微镜下直接观察,常用米粉吐温琼脂培养基观察白念珠菌的顶端厚壁孢子和假菌丝.B.方块法适用于霉菌菌落的培养.取无菌平皿倒入约15ml熔化的培养基,待凝固后用无菌小铲或接种刀划成1cm2大小的小块.取一小块移在无菌载玻片上,然后在小块上方四边的中点接种待鉴定菌株,盖上消毒的盖玻片,放入无菌平皿中的V形玻棒上,底部铺上无菌滤纸,并加入少量无菌蒸馏水,孵育,待菌落生长后直接将载玻片置显微镜下观察.C.钢圈法先将固体石蜡加热熔化,取直径约2cm,厚度约0.5cm有孔口的不锈钢小钢圈,火焰消毒后趁热浸入石蜡油,旋即取出冷却,石蜡油即附着于小钢圈中.再取一无菌载玻片,火焰上稍加热,将小钢圈平置其上,孔口向上.小钢圈上石蜡油遇载玻片的热即熔化后凝固,钢圈就会固定在载玻片上.用无菌注射器经孔口注入熔化的培养基,培养基量约占小钢圈容量的12,注意避免气泡.待培养基凝固后取一消毒盖玻片,火焰上加热后,趁热盖在小钢圈表面,也即固定其上.最后用接种针伸入孔口进行接种.这种方法的优点是形成一种封闭式培养,在显微镜下直接观察菌落时可避免孢子吸入人体,而且不易被污染,盖玻片也可取下染色后封固制片保存.培养检查标本接种后,每周至少检查2次,观察以下指标①菌落外观A.生长速度缓慢生长菌7～14d,快速生长菌2～7d.一般浅部真菌超过2周深部真菌超过4周仍无生长,可报告阴性.B.外观a.扁平.b.疣状.c.折叠规则或不规则.d.缠结或垫状.e.其他.C.大小菌落大小用cm来表示,菌落大小与生长速度和培养时间有关.D.质地 a.平滑状.b.粉状.c.粒状.d.棉花状.e.粗毛状.f.皮革状.g.粘液状.h.膜状.E.颜色不同的菌种表现出不同的颜色,呈鲜艳或暗淡.致病性真菌的颜色多较淡,呈白色或淡黄色,而且其培养基也可变色,如马尔尼菲青霉等,有些真菌菌落不但正面有颜色,其背面也有深浅不同的颜色.菌落的颜色与培养基的种类,培养温度,培养时间,移种代数等因素有关.所以,菌落的颜色虽在菌种鉴定上有重要的参考价值,但除少数菌种外,一般不作为鉴定的重要依据.F.菌落的边缘有些菌落的边缘整齐,有些不整齐.G.菌落的高度和下沉现象有些菌落下沉现象明显,如黄癣菌,絮状表皮癣菌等,更有甚者菌落有时为之裂开.H.渗出物一些真菌如青霉,曲霉的菌落表面会出现液滴.I.变异有些真菌的菌落日久或多次传代培养而发生变异,菌落颜色减退或消失,表面气生菌丝增多,如絮状表皮癣菌在2～3周后便发生变异.②显微镜检查小培养可置普通显微镜下直接观察,而试管和平皿培养的菌落则需挑起后做涂片检查. 五,组织病理学检查真菌病的组织病理检查与直接镜检培养同样具有相当重要的价值,尤其对深部真菌病的诊断意义更大,如用特殊染色可提高阳性率.真菌的组织病理反应与其他一些疾病的组织病理反应极其相似,往往只有在仔细研究了病理切片并发现了真菌之后才考虑到真菌病的诊断.而在这种情况下,标本已被固定,培养有时已不可能进行,组织病理切片就成了真菌感染的主要依据.所以临床上在送病理标本的同时,要尽可能考虑到真菌感染的可能,以便同时采集标本送真菌实验室进行真菌学检查.真菌在组织内一般表现为①孢子酵母和双相型真菌在组织内表现为孢子.②菌丝许多真菌在组织中只表现为菌丝.组织中发现无色分隔,分支的菌丝多为念珠菌和曲霉.粗大,不分隔少分支的菌丝为接合菌,多为毛霉,根霉,犁头霉等.粗大,少分支有隔的菌丝为蛙粪霉菌.棕色菌丝为暗色丝孢霉病,由暗色孢科真菌引起.③菌丝和孢子,主要见于念珠菌感染.④颗粒为组织内由菌丝形成的团块.⑤球囊或内孢囊球囊内含有内孢子,为球孢子菌或鼻孢子菌在组织内的特征性结构.组织病理片中根据形态和染色能基本确定种名的真菌为荚膜组织胞浆菌,杜波伊斯组织胞浆菌,副球孢子菌,皮炎芽生菌,链状芽生菌,粗球孢子菌,新生隐球菌和鼻孢子菌等.根据组织病理中真菌的形态能确定属而不能确定种的病为放线菌病,奴卡菌病,无绿藻病,念珠菌病,曲霉病和不育大孢子菌病等.多个属的真菌感染可引起相同的临床表现,在组织病理中真菌的形态无法区别的病有皮肤着生芽生菌病,暗色丝孢霉病,接合菌病,皮肤癣菌病和足菌肿等.足菌肿的颗粒若染色适当,很易确定为放线菌性或真菌性的,也能区别出细菌性颗粒.真菌性颗粒中的菌丝又分为无色或暗色两大类.各种病原菌基本上形成各自颜色,大小,形成和结构的颗粒,可以初步区别,但最后确定必须依靠真菌培养.六,血清学方法随着诊断技术的进展,以免疫学方法检测真菌病已成为可能,引起深部真菌感染的病原菌主要有白念珠菌,曲霉菌和隐球菌等,传统的检测方法主要为血培养和组织活检,但血培养历时太长,且深部真菌感染的病原菌常不易培养成功,阳性率较低.而深部真菌感染的临床征象错综复杂,又使得组织活检缺乏典型改变,影响正确诊断,这些都使得这些方法所起的作用极为有限,真菌的抗原,抗体及代谢产物的血清学检查用于深部真菌感染的实验室检测,可取得很好的效果.目前常用的免疫诊断方法有①特异性抗原的检测A.乳胶凝集试验(LA).B.酶联免疫试验(EIA).C.荧光免疫测定法(FA).②特异性抗体检测由于受检者都为免疫低下患者,因其致阳性率低,故现已少用.七,分子生物学方法近年来随着分子生物学的发展,已有聚合酶链反应(PCR)扩增,分子探针,限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP),DNA指纹图谱,随机扩增DNA多态性(RAPD)等方法.用于深部真菌病的诊断和分型研究,形成了以PCR技术为基础的一系列分子诊断方法.从这些新技术对多种致病真菌鉴定的应用过程中发现,此类方法具有操作简便,省时省力,特异性,敏感性高的优点.特别是从分子水平对真菌从遗传进化角度阐明菌种间内在的分类学关系,真正达到人们追求已久的自然分类的目的.我们有理由相信,随着PCR及相关技术在临床的应用及更广泛深入的研究,将会对真菌感染的诊断和鉴定产生根本的影响.(摘自《中国真菌学杂志》,2006年第2期)。