T-a克隆说明书
T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因的研究中期报告
T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因的研究中期报告
研究目的：
本研究旨在利用T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因，以深入了解水稻基因的功能和调控机制。
研究进展：
1.构建T-DNA(Ds)基因库
利用T-DNA插入物Ds，构建了一个水稻基因库。
通过PCR筛选，初步鉴定出有潜在功能的插入突变体共计500个，其中包括生长发育异常、叶片变异、花和果实发育受阻等表型。
2.筛选和鉴定候选基因
对上述500个插入突变体进行了细致的鉴定和筛选，最终确定了10个有潜在功能的基因。
使用RT-PCR技术检测了这些基因的表达情况，发现它们在水稻不同器官和阶段都有相应的表达。
3.克隆目标基因
在10个候选基因中，选择了其中表达量较高的一个基因进行深入研究。
通过PCR扩增、克隆和DNA测序，成功克隆出了该基因的DNA序列。
4.功能分析
利用生化和细胞学方法，对克隆出的基因进行了功能分析，发现其编码的蛋白质可能参与了水稻抗逆和光合作用等方面的调控。
进一步的实验证明了其参与抗逆和光合作用的功能。
结论：
本研究利用T-DNA(Ds)标签法成功克隆出了一个潜在的抗逆和光合作用相关的水稻基因。
该基因可能在水稻生长发育和逆境应答过程中起
着重要的调控作用，为深入了解水稻基因功能和调控机制提供了新的研究思路和方法。
同时，该研究还为今后利用T-DNA标签法克隆和研究其他作物基因提供了参考和借鉴。
TA克隆方法克隆果蝇Cyt-c-p基因 分子实验设计
TA克隆方法克隆果蝇Cyt-c-p基因摘要：细胞色素c (cyt-c)是生命体中一种重要的水溶性氧化还原血红蛋白,在线粒体电子传递、细胞凋亡中起重要作用，本研究目的是探究其克隆方法。
基因克隆的方法之一是在体外将目的基因同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究。
通过PCR法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。
本实验应用RT-PCR技术从黑腹果蝇RNA中扩增Cyt-c-p 基因cDNA片段，并克隆到质粒载体pMD18-T，鉴定测序。
关键词：基因克隆；T-A克隆；黑腹果蝇；Cyt-c-p基因基因Drosophila Melanogaster (fruit fly) Cyt-c-p gene cloning（Original TA Cloning Kit）(College of Life Science, Beijing Normal University, Beijing 100875, China)Abstract: Cytochrome c (Cyt-C) is one of the important water soluble redoxhemoglobin,play an important role in mitochondrial electron transfer and apoptosis, the purpose of this study is to explore the cloning method of CYt-c-p.Gene cloning is connected gene with thecarrier to replicateitself, and diverted it to express and further studies. Amplification of target gene fragments by PCR method in the process due to the often unclear target gene sequencesof DNA, andmethods of obtaining the objective piece usually requires a TA cloning, recombinant t-carrier, through the sequencing of known DNA sequences.Experimental application of RT-PCR amplified cDNA Cyt-c-p gene in the Drosophila melanogaster RNA fragment and cloned into the plasmid vectorpMD18-T, identification of sequencing.Key words: Gene cloning ;T-A cloning; Cyt-c-p gene1 引言1.1 研究背景细胞色素c (cyt-c)是生命体中一种重要的水溶性氧化还原血红蛋白，整个分子由一条肽链包裹着一个血红素(中心卟啉铁)组成，广泛存在于原核生物和真核生物细胞的线粒体内膜上，是生命体内氧化还原反应电子传递中的一个环节。
实验四_T_A_克隆及转化
PCR产物的连接及转化
一、实验目的
• • • • 弄清T载体的结构和T-A克隆的原理； 弄清蓝白斑筛选的原理； 学会PCR产物连接方法； 学会连接产物转化大肠杆菌感受态方法。
二、实验原理
• 1、T-A克隆原理
通过PCR的方法扩增目的基因片断，为了后续实验的需要，
往往需要将获得的目的片断通过TA克隆的方法，重组到T-载体 中。外源DNA与载体分子的连接称之为DNA重组，这样重新组 合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在T4 DNA连 接酶作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分 子与外源DNA分子进行连接。
• • • • • • （低温、加温）水浴锅 离心机 PCR扩增仪 恒温培养箱 摇床 超净工作台等
主要试剂
• • • • pMD 18-T Vector试剂盒 PCR扩增回收纯化的片段 200 mg/ml的IPTG 过滤除菌 20 mg/ml的X-gal 溶于二甲基甲 酰胺，避光保存。（低温、加 温）水浴锅 • LB培养基（ 含IPTG，X-gal， 50mg/ml 氨苄青霉素)
四、实验步骤
• 1、
产生不同末端的DNA聚合酶
• α互补 原理
许多载体（包括pMD18-T）都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子和编码 其N端氨基酸（α肽链）的片断基因。宿主具有编码β半乳糖苷酶的C端基因。当 二者产物组合在一起，就具有活性酶的产生，此现象称为α互补。由α互补形成 的具有功能活性的β半乳糖苷酶,可以用X-gal显色测定出来，它能将无色的化合 物X-gal切割成半乳糖和蓝色底物。当外源DNA片断插入到多克隆位点后，就会
破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽
【国家自然科学基金】_t-a克隆_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140802
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47
科研热词 克隆 原核表达 金黄色葡萄球菌 真核表达载体 生物信息学分析 松辽黑猪 基因克隆 启动子 高迁移率族蛋白 鞘磷脂酶类溶血素 问号钩端螺旋体 重组表达 转录水平 趋化 腺病毒载体 腺病毒科 脱落酸 绿色荧光蛋白 紧密连接 空肠弯曲菌 真核表达 溶血活性 溶菌糖基转移酶 活性基因 株1s 接受甲基趋化蛋白 快速扩增技术 序列分析 幽门螺杆菌 家蝇抗菌肽 基因治疗 功能预测 副结核分枝杆菌 乳腺癌 synoviolin sirt2 oschlh igf-ⅰ基因 igf-i基因 hsp65基因 fnbp配体结合区 fnba eef1a2 diptericin基因 claudin-6 cdna cag致病岛
科研热词 推荐指数 克隆 2 鞘磷脂酶类溶血素 1 防御素 1 问号钩端螺旋体 1 重组表达 1 重组 1 酵母表达载体 1 酪氨酸羟化酶 1 遗传学技术 1 遗传 1 转染 1 苦瓜 1 肝癌 1 肌动蛋白 1 聚合酶链反应(pcr) 1 细胞凋亡 1 真核表达载体 1 白纹伊蚊 1 甲基化 1 甲型副伤寒杆菌 1 猪囊尾蚴 1 溶血活性 1 植物蛋白质类 1 梯度降落pcr 1 核糖体蛋白质类 1 条件优化 1 抗原cc1 1 截短 1 幽门螺杆菌 1 实时定量聚合酶链反应 1 实时定量pcr 1 天然免疫 1 多克隆抗体 1 基因克隆 1 基因 1 哮喘 1 原核表达 1 内参照物 1 免疫原性 1 免疫保护性 1 信号传导及转录活化因子 1 亚硫酸氢钠测序法 1 t细胞免疫球蛋白黏蛋白-4(tim-4)1 t-a克隆法 1 sph2基因/重组表达/瞬时表达 1 pgem-t载体 1 pegfp-c3 1 overlap-pcr 1 ompa基因 1 map30 1 gp45 1 eiav_(fddv) 1
PCR说明书-天根
反应举例
注意：以下举例仅供参考，实际反应条件因模 板、引物等的结构不同而各异，需根据实际情 况，设定最佳反应条件。 1. 用2×Taq Plus PCR MasterMix产品，以人基
因组DNA为模板，扩增1 kb的片段，反应体系 为25 µl（如反应体系不同，可按此比例增加 或减少用量）。
组成成份
版本号: KT121221
2×Taq Plus PCR MasterMix
目 录 号：KT205 储存条件: -20℃可长期保存，多次冻融不会影响
活性。如需经常使用，可存放于4℃。 产品内容：
产品组成
2×Taq Plus PCR MasterMix ddH2O Loading dye in MasterMix
产品组成（2×）
0.1 U Taq Plus Polymerase/µl 500 µM dNTP each 20 mM Tris-HCl (pH8.3) 100 mM KCl 3 mM MgCl2 其它稳定剂和增强剂
质量控制
经检测无外源核酸酶活性；能有效地扩增人基因 组中的单拷贝基因；室温(15-25℃)存放一周，无明 显活性改变。
适用范围
基因检测：本产品不同批次之间误差很小，特别 适合大规模基因检测，半定量PCR实验和微量DNA 的检测。
保真度较高的DNA扩增和一些有特殊结构的复 杂模板如GC含量高（>60%），有二级结构等的扩 增：DNA片段的PCR扩增、DNA标记、引物延伸、 序列测定等。PCR产物如需克隆，纯化后可直接进行 T/A载体克隆，如需提高克隆效率，建议加A后再进 行T/A载体克隆。
体积
Template
< 1 µg
Primer 1(10 µM)
T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因的研究开题报告
T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因的研究开题报告题目：T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因的研究研究背景：现代农业发展需要应用高效的基因工程技术，以快速获取适应新环境和抗病虫害的新品种。
水稻是人类主要粮食作物之一，其基因组已经被完全测序。
基于水稻基因组序列，利用T-DNA(Ds)标签法对水稻基因进行定向克隆是目前最常用的方法之一。
研究内容：本文旨在应用T-DNA(Ds)标签法将水稻基因进行克隆，并对克隆后的基因进行分析。
具体内容包括：1.构建T-DNA(Ds)标签载体和转化水稻本研究计划设计特定的T-DNA(Ds)标签载体，并通过Agrobacterium 菌体介导法将其转化到水稻中。
转化后的水稻株系将筛选、鉴定，获取阳性转化株系，并使用PCR等技术验证T-DNA(Ds)标签的插入和稳定性。
2.利用T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因根据T-DNA(Ds)标签载体的设计，利用PCR和Southern分析等技术对转化获得的水稻植株中的T-DNA(Ds)标签位置和基因插入情况进行确定。
通过PCR扩增并克隆标签处的DNA序列，并进行基因注释和同源性分析，得到克隆的水稻基因信息。
3.对克隆后的水稻基因进行功能和表达分析通过生物信息学分析和转基因水稻杂交等筛选方法，验证克隆基因在水稻中的生物学功能。
利用实时荧光定量PCR技术，研究基因在不同生理和生态环境下的表达模式及其规律。
并探究基因参与水稻的生长和发育、抗逆性等生物学过程。
预期结果：本研究计划应用T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因，探究基因的生物学功能和表达模式及其对水稻的生长和发育、抗逆性等生理生化习性的影响。
期望为水稻基因组研究提供新的思路与途径，进一步推动水稻育种繁育工作的进展。
T载体克隆连接原理、制备及载体序列
T载体克隆连接原理、制备及载体序列T载体的定义：T载体（T-Vector）是一种高效克隆 PCR 产物（TA克隆）的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。
T载体的作用原理：大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性（下图红色框内所示位置）。
因此，人们在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基（下图两个红色箭头所示），从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对，提高了PCR产物连接和克隆的效率。
T载体进行TA克隆的优势：相对于另一种非定向克隆——平末端克隆，使用T载体进行TA克隆是一种快速、高效、一步到位的非定向克隆法。
有研究曾证明，平末端克隆的连接效率仅为粘端连接的1/50，且自身环化率高。
T载体的制备：：1 商业化T载体：一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶72～75℃反应，进行末端的加T。
2 自制T载体：一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段，最常用的内切酶为XcmI，其识别和切割特点如下：其中XcmI的识别序列分别为两端的CCA和TGG，而切割序列则为中间三角箭头所指的N（N代表任意碱基）。
由于N可以是任意碱基，所以如果将切割位置的N设置为T，那么在该酶的切割下，就可以产生一个3’ T末端。
相似的，在其互补链上设置另一个相同或者类似的XcmI酶切位点（保证切割位点为T即可）就可以产生另一个T末端。
一般可以在商业化的T载体基础上进行改造，通过PCR或者合成Oligo的方式插入上述两个XcmI位点。
连接成功的质粒可按需要自行扩增和保存，使用时用XcmI进行完全酶切（这里的酶切必须保证完全，否则载体易自连，所以XcmI酶最好过量，或者适当延长消化时间），就可以制备得到T载体。
[3]常见T载体及序列：虽然上面提到可以自制T-Vector，但实际上现在的商业化载体已经做到比较便宜，而且批次间稳定性保持的不错。
TA克隆(pMD18-T载体)
pMD18-T Vector:●制品说明pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。
本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。
因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
由于本载体以pUC18载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。
此外，本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。
本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control反应。
●制品内容pMD18-T Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支Control Insert（50 ng/μl） 10 μl×1支Solution I* 30 μl×5支* 使用时请于冰中融解。
●保 存： -20℃●纯 度■ Control Insert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。
■ Control Insert经克隆后，用双脱氧测序法确认多克隆酶切位点及T 碱基的存在。
●用 途■ 进行TA克隆，克隆PCR产物。
■ 对克隆后的PCR产物使用BcaBESTTM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。
目的基因T载体克隆实验步骤
目的基因T载体克隆实验步骤pcr产物的t载体克隆一.重组质粒的构建：重组的dna分子就是在dna连接酶的促进作用下，存有mg切的载体分子与外源dna分子进行连接。
dna连接酶存有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠杆菌dna连接酶。
两种dna连接酶都存有将两个具有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，而且t4噬菌体dna连接酶除了一种大肠杆菌dna连接酶没的特性，即为能够并使两个平末端的双链dna分子连接起来。
但这种相连接的效率比粘性末端的相连接率为高，通常可以通过提升t4噬菌体dna 连接酶浓度或减少dna浓度去提升平末端的相连接效率。
t4噬菌体dna连接酶催化剂dna 连接反应分成3步：首先，t4dna连接酶与辅因子atp构成酶-atp复合物；然后，酶-atp 复合物再融合至具备5’磷酸基和3’羟基切口的dna上，并使dna腺苷化；最后产生一个代莱磷酸二酯键，把切口封出来。
连接反应通常将两个相同大小的片断相连。
很多dna聚合酶在进行pcr扩增时会在pcr产物双链dna每条链的3’端加上一个突出的碱基a。
pucm-t载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的t。
这样，pucm-t载体的两端就可以和pcr产物的两端进行正确的at配对，在连接酶的催化下，就可以把pcr产物连接到pucm-t载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有助于连接酶的活性。
但是在这个温度下黏末端的氢键融合就是不稳定的。
因此实行折衷的温度，即12-16℃，相连接12-16h（过夜），这样既可以最大限度地充分发挥连接酶的活性，又兼具至较长时间接合结构的平衡。
2、atp存有的相连接缓冲器系统中，将分别经酶二.感受态制备原理细菌在0ccacl2低渗溶液中胀变成球形，遗失部分膜蛋白，沦为难稀释外源dna的状态。
三.β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理lacz基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。
T-A基因克隆的技术要点.ppt
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外源DNA的重组与转化
▪DNA的体外连接重组
▪ 其本质是一个酶促反应过程，即在一定的条件下，DNA连接酶 催化两个双链DNA片段的5’端磷酸和3’端羟基之间相互作用， 形成磷酸二酯键的过程。
▪ DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶。
▪ lacZ 编码半乳糖苷酶的N端，它可以和宿主菌株产生的半乳糖苷酶C端互
补，形成有活性的β-半乳糖苷酶。
▪ Xgal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 ，β–半乳糖苷酶的底物，水解后呈
蓝色
▪ IPTG 异丙基硫代半21
蓝白斑
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T-A基因克隆的技术要点.ppt
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3’-A突出的PCR产物
▪ 使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃10分钟 一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A 。
▪ 使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，其不能在扩增产物的3 末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，在回收纯化后进 行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的 普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟 。
混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细 胞表面，经42˚C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物 。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化 过程中获得新的表型（如Amp+等）得到表达，然后将此细菌 培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上进行培养获得阳 性克隆。
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▪ 如果使用ddTTP，效果会更好。
TA克隆-T载体
TA克隆概述TA克隆载体即T载体，是目前克隆PCR产物最简便、快捷的方法。
随着基因组计划的进行，以及分子生物学技术、基因芯片技术在生命科学研究、生物工程和医学等领域的应用，对TA载体的需求量会逐步扩大TA克隆方法(OriginalTACloningKit)即利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3'端自动添加一个3'-A突出端。
利用TaKaRa的T载体，直接高效地连接PCR产物。
所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将PCR产物进行优化，不需把PCR产物做平端处理，不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。
TA克隆的策略摘要：对于亚克隆来说，酶切-连接可谓是最经典的方式。
虽说效果不错，可着实有些麻烦。
载体和片段分别酶切、跑胶、回收，再加上连接和转化，一星期转眼就过去了。
新的克隆方法也在不断涌现。
速度更快，片段更长。
生物通近期就将盘点一下市场上一些非一般的克隆。
从TA克隆开始，我们着重于一些容易忽视的问题。
TA克隆的idea最初来自1994年。
几位学者发现TaqDNA聚合酶会在PCR产物的3'末端加上一个脱氧腺苷（A）,而且这种特性与模板无关。
之后，Invitrogen公司发明了TA克隆技术，并拥有全球TAcloning商标的专利权，直至2013年。
（这个就够他们赚得盆满钵满了。
）线性化的T载体在3'末端拥有一个脱氧胸苷（T），与PCR产物的A尾巴互补。
原理就是这么简单。
不过由于价格的原因，Invitrogen的T载体在国内却不是销量最好的。
Promega的pGEM-T（easy）和Takara的pMD18-T因性价比高，更加深入人心。
TA克隆的步骤无需赘述，相信大家都很清楚。
无非就是PCR、连接、转化、鉴定这几个步骤，不过还有一些不得不说的问题，值得大家注意。
用什么样的聚合酶？不是所有的聚合酶都会在PCR产物末端加A。
具有3'到5'外切酶活性的高保真酶就不会产生A尾巴。
T-A克隆操作规程
T-A克隆操作规程一、实验用品的查看和准备PCR模板：待测混合菌引物：sgR、sgF SP6、T7大肠杆菌JM109 高敏感受态、新鲜LB或SOB培养基酶和生化试剂：Taq DNA聚合酶、氨卞抗生素（Amp）、X-Gal、IPTG、 DNA Maker DL2000 、DNA Maker λ Hind Ⅲ、胶回收试剂盒、 T4 DNA连接酶、T-vector二、实验操作1、PCR扩增目的DNA片段按《单菌16S扩增操作规程》进行混合菌16S的扩增。
2、PCR产物回收按《切胶操作规程》进行大小为1.5KB的目的DNA片段的切取和回收，电泳验证。
3、连接短暂离心载体和对照插入DNA ，使沉于管底。
取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管，按以下连接体系加入各种物质，胶回收产物量视电泳结果和吸光度而定，用无菌水补足体积到10 μL。
用枪混匀后在微量离心机上将液体全部甩到管底，于14-16℃保温8-24小时或4℃过夜。
16S胶回收产物X uL5.0 µL2X Rapid ligationbufferT-Vector 1.0 µLT4 DNA ligase 1.0 µLddH2O(3-X) uL4、转化1)、取足够量的冰制成冰盒，从-80℃冰箱拿出大肠杆菌JM109高效感受态置于冰盒中5 min 使其融化，轻轻摇晃混匀。
3uL 连接产物2）、将 1uL pET-28a （阳性对照）分别加到对应的感受态细胞中，轻轻摇匀。
什么都不加（阴性对照）3）、置于冰上放置20 min-30 min。
4）、42℃（精确）热激90 S，不要摇动。
5）、立刻置于冰上2 min。
6）、加入950 uL SOB或LB培养基（无抗生素），阳性对照加900 uL。
7）、37℃ 150rpm左右摇床培养1-1.5h。
在这期间取出SOB或LB平板，其中一个Kan抗性，其余为Amp抗性。
在酒精灯附近取40 uL 20mg/mL X-gal和7 uL 200 mg/mL IPTG用玻璃棒均匀的涂布在平板上。
载体构建技术经验分享
载体构建技术经验分享一、PCR 过程中的经验教训做分子克隆，构建表达载体的过程中，目的片段必须跟genebank 中的序列完全一致才行，所以在 PCR 过程中酶的选择首先应选择高保真酶，尤其是当目的片段较长的时候更是如此。
这样才能在 PCR 过程中减少错配情况。
高保真酶常常对退火温度有要求，对一般的酶来说，退火温度是 Tm-5 度，但如 NEB 的高保真酶的退火温度是 Tm 值+3 度。
PCR 循环数不宜太大，20-30 即可。
我就曾经用普通的酶进行过PCR，扩增时出现非特异条带，T-A 克隆后送去测序，发现碱基有错配，而且每次都不一样。
二、PCR 产物直接酶切后连接不成功当你获得 PCR 产物后，首先是进行纯化、酶切、纯化，然后与酶切后胶回收的载体连接，如果连接成功，当然是恭喜了。
但往往会出现连接不成功的，原因以 PCR 产物没有酶切成功可能性大，这可能与引物设计的好坏有关。
因为这个时候 PCR 产物是否酶切成功是无法鉴定的，所以你反复尝试几次还不成功的话，就赶紧做个 T-A 克隆吧三、T-A 克隆应注意的问题T-A 克隆应该时间很简单的事，但知者不难，难者不知啊，还是有很多问题要注意的。
T-A 阳性率高，简单易操作，所以在质粒构建过程常常用来选择做为一个亚克隆，既可以用来测序，又有利于进一步酶切，确实很方便。
但要注意，首先是T 载体的选择，尽量避免选择含有目的片段酶切位点的T 载体，这样会切成多个片段，有时候可能对后面的胶回收会有影响。
其次，因为在 PCR 产物是用高保真酶扩增的，所以首先要进行加 A 反应。
这时候应购买 T-A 快速克隆平末端加A 试剂盒。
进行加A 时反应体系不要太小，因为太小是酶量加的可能不准确。
我开始就是这样，想着节约，说明书写的是PCR 产物加15ul,我没舍得，加了3ul,加A 反应液、酶都相应减量，后面就是转化不成功。
后来我 PCR 产物加为 6ul,就成功了，屡试不爽。
TA克隆-T载体
TA 克隆概述TA 克隆载体即 T 载体，是目前克隆 PCR 产物最简便、快捷的方法。
随着基因组计划的进行，以及分子生物学技术、基因芯片技术在生命科学研究、生物工程和医学等领域的应用，对 TA 载体的需求量会逐步扩大TA 克隆方法（ Original TA Cloning Kit ）即利用 Taq 聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条 PCR 扩增产物的3` 端自动添加一个 3`-A 突出端。
利用 TaKaRa 的 T 载体，直接高效地连接 PCR 产物。
所以 TA 克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将 PCR 产物进行优化，不需把 PCR 产物做平端处理，不需在 PCR 扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。
原理如下：TA克隆的策略摘要：对于亚克隆来说，酶切-连接可谓是最经典的方式。
虽说效果不错，可着实有些麻烦。
载体和片段分别酶切、跑胶、回收，再加上连接和转化，一星期转眼就过去了。
新的克隆方法也在不断涌现。
速度更快，片段更长。
生物通近期就将盘点一下市场上一些非一般的克隆。
从TA克隆开始，我们着重于一些容易忽视的问题。
TA 克隆的idea 最初来自1994 年。
几位学者发现Taq DNA 聚合酶会在PCR 产物的3’末端加上一个脱氧腺苷（A），而且这种特性与模板无关。
之后，Invitrogen 公司发明了TA 克隆技术，并拥有全球TA cloning 商标的专利权，直至2013 年。
（这个就够他们赚得盆满钵满了。
）线性化的T 载体在3’末端拥有一个脱氧胸苷（T），与PCR 产物的 A 尾巴互补。
原理就是这么简单。
不过由于价格的原因，Invitrogen 的T 载体在国内却不是销量最好的。
Promega 的pGEM-T（easy）和Takara的pMD18-T 因性价比高，更加深入人心。
TA 克隆的步骤无需赘述，相信大家都很清楚。
无非就是PCR、连接、转化、鉴定这几个步骤，不过还有一些不得不说的问题，值得大家注意。
擎科pClone007 Versatile Simple Vector Kit 使用说明说明书
pClone007 Versatile Simple Vector Kit目录号产品简介本产品利用Vaccinia topoisomerase I 能在瞬间完成连接反应的优良特性，结合本公司最新开发的载体制备工艺，能够兼容T-A 克隆与平末端克隆。
TSV-007VSTSV-007VSm产品应用产品特点产品组成组分007VSm （10次）007VS （60次）5×pClone007 Versatile SimpleVector Mix Control Template （50 ng/µL ）*pUC19（10 pg/µL ）**20 µL 10 µL 10 µL40 µL×310 µL 10 µL* 阳性对照片段，用于检测目的产物的质量，大小为1,000 bp ；** 阳性对照质粒，用于检测感受态细胞的质量，抗性为Amp 。
本品适用于≤3000 bp 目的片段的T-A 克隆与平末端克隆。
· 5×Mix ，只需补加片段与水。
· T-A 克隆与平末端克隆均适用。
· 低背景，阳性率可达95%。
· 无多克隆位点，连接300 bp以下小片段可避免测序中断的情况发生。
使用方法1. 目的片段准备· 引物要求：引物不能磷酸化；· 产物末端：平粘末端均可；· 产物鉴定：PCR 产物需进行凝胶纯化回收，推荐使用擎科DNA 凝胶回收试剂盒（目录号：TSP601）；胶回收产物经电泳检测质量与浓度后再进行连接反应。
2. 反应体系配制：推荐10 µL 体系组分用量目的片段1 µL~8 µL2 µL Up to 10 µL5×pClone007 Versatile Simple Vector MixddH O注：所有溶液直接加入管底后用移液器吹打混匀。
t载体克隆原理
t载体克隆原理
T载体克隆的原理主要基于DNA连接酶的作用。
在连接缓冲系统中，当Mg2+和ATP存在时，DNA连接酶能够将经过酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接，形成重组的DNA分子。
这个过程是将两个不同大小的DNA片段相连，通常用于克隆和基因工程中的DNA操作。
T载体，也称为T化物载体，是聚合酶链反应产物的克隆运载体。
这种载体在经过线性化后，其两侧的3′端各多出一个脱氧胸苷酸(T)。
由于PCR产物两侧的3′端通常含有单个脱氧腺苷酸(A)，因此PCR产物与T化物载体之间的A-T互补性可以大大提高PCR产物克隆的效率。
在这个过程中，T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶都起到了关键作用。
这两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能。
特别是T4噬菌体DNA连接酶，它还能将两个平末端的双链DNA分子连接起来，尽管这种连接的效率比粘性末端的连接率低。
为了提高平末端的连接效率，可以通过增加T4噬菌体DNA连接酶的浓度或增加DNA的浓度来实现。
总的来说，T载体克隆的原理是基于DNA连接酶的作用，通过将PCR产物与线性化的T载体进行连接，从而实现高效、准确的基因克隆和克隆基因的操作。
T载体-B载体与PCR克隆困扰
T载体-B载体与PCR克隆困扰盘古基因李万波PCR技术给基因工程带来了巨大的变革，生物学家可以配合DNA内切酶随意放大、克隆基因。
一、T-载体与B-载体PCR产物的克隆技术也得到了长足发展，T/A克隆载体（简称“T载体”）就是上世纪末发展起来的。
Taq酶是第一个被克隆的嗜热菌DNA聚合酶，由于发现了Taq酶具有不依赖DNA模板的核苷酸末端转移酶活性，能够给双链DNA 的3’-末端添加1个碱基，所以T/A克隆技术应运而生。
Taq酶在dNTP俱全的情况下，优先添加1个A碱基（3’-A Protruding）, 当只有其它某个碱基时，她就退而求其次，也能加上1个其它碱基，比如“dTTP”。
PCR产物的平端连接效率本来很低，这是因为常规合成的寡核苷酸引物5’-端不带磷酸，T4 DNA连接酶只能将DNA链的3’-OH和另一DNA链的5’-P(磷酸基团)相连。
DNA内切酶切开的平末端5’带有磷酸基，只有这条链能与PCR产物的3’-OH发生连接反应，另一条链没有粘性。
T/A克隆时也一样，只能连接单链，另一条链上的缺口（Nick）需要受体菌（Host Bacteria）体内的激酶和连接酶帮助修补，才能成为完整的环状质粒，完成滚环复制，抵抗筛选压（抗生素毒性）。
所以，如果质粒转化感受态菌后的37℃温育不够1小时，菌落数是会减少的。
上世纪80年代，拓扑异构酶1B的发现使得PCR产物的平端克隆技术（Blunt-end cloning vector, B-载体）取得了巨大改进。
拓扑异构载体对平末端的连接速度和效率至今无可匹敌。
这类载体有盘古基因的pACK4a系列、原核表达载体Topoied系列、哺乳类载体Topoied系列，此外还有Invitrogen 和全式金的相应载体。
该类载体由于Topoisomerase Ib的微弱的记忆功能，需要PCR引物的5’第一个碱基尽量与载体处理前切除的5’端碱基相同，这样才能获得近乎100%的克隆率。
Taq DNA Polymerase说明书
Taq DNA Polymerase说明书货号：PC1100规格：500U/1000U/2500U浓度：5U/ul保存：-20℃保存,有效期至少一年。
产品简介：Taq DNA Polymerase是从克隆有Thermus aquaticus DNA Polymerase基因的大肠杆菌经诱导表达后分离纯化的，其分子量为94KD。
该酶具有5’-3’DNA聚合酶活性和5’-3’核酸外切酶活性，无3’-5’外切酶活性。
在PCR反应中，Taq DNA Polymerase延伸速度为1-2kb/分钟，产物3’端带A，可直接用于T/A 载体克隆。
该酶无外源核酸酶和细菌基因组DNA的污染，稳定性好，特异性强。
活性定义：1单位(U)Taq DNA Polymerase活力定义为在74℃，30分钟内，以活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板，将10nmol脱氧核苷酸掺入到酸不溶物质所需的酶量。
质量控制：SDS-PAGE检测Taq DNA Polymerase纯度大于99%；经检测无外源核酸酶活性；PCR方法检测无宿主残余DNA；能有效地扩增人类基因组中的单拷贝基因；室温存放一周，无明显活性改变。
酶贮存缓冲液：20mM Tris-HCl(pH8.0);0.1mM EDTA;1mM DTT;100mM KCl;50%glycerol;稳定剂适用范围：用于小于6kb的对保真度要求不高的DNA片段的PCR扩增、DNA标记、引物延伸、序列测定、平末端加A等，产物可以直接用于T/A载体克隆。
建议PCR条件：PCR体系（以50μl反应体系为例）Template<0.5μg上游引物（10μM）1μl下游引物（10μM）1μl10×Buffer（含Mg2+）5μldNTP（各2.5mM）4μlTaq DNA Polymerase0.5-1μlddH2O up to50μl注意事项：1、PCR反应体系加样时，最后一步加入Taq DNA Ploymerase，整个过程宜在冰上操作。
pGEM-T载体说明书
pGEM-T载体使用说明概述经Taq DNA聚合酶扩增后的PCR产物末端都带有单个A。
正是基于这一原理，pGEM质粒经EcoR V切成平端后，在开口端加上一个T制成T载体，一方面避免了自身环化，另一方面由于T-A互补，从而提高了T载体与PCR产物之间的连接效率。
由于T-A克隆只需纯化PCR产物，因而操作较为简便。
pGEM-T vector含丝状噬菌体f1的复制起始区，用于产生环状ssDNA；含有T7和SP6 RNA聚合酶启动子；在多克隆区域具有编码β-半乳糖苷酶的基因(LacZ)，插入失活α-肽可在指示平板上通过蓝、白菌落直接筛选重组菌落。
pGEM-T Vector图谱The promoter and multiple cloning sequence of the pGEM-T Vector产品特点1. 克隆PCR产物2. 通过多克隆区域两侧的T7和SP6 RNA聚合酶启动子进行体外转录3. 产生ssDNA4. 通过蓝、白菌落筛选重组体5. 多克隆区域提供选择克隆的酶切位点包装及组成pGEM-T载体(50ng/µl) 20µl20次操作方法A. 连接在0.2ml或0.5ml反应管中加入下列成分pGEM-T 50ng纯化的PCR产物10-50ngT4连接酶 2-3weiss units10×连接缓冲液1µl补超纯水至总体积为10µl，可以16℃或4℃过夜。
B. 转化1、将50µl感受态细胞JM109或DH5α于冰浴上解冻。
2、将5µl连接产物与感受态细胞混匀，冰浴30分钟。
3、42℃热休克90秒，立即冰浴3-5分钟。
4、加入400µl 预冷的LB液体培养基，37℃轻摇培养45-60分钟。
5、取200µl在LB固体培养基（+Amp/IPTG/X-Gal）上铺板，自然干燥5-10分钟，37℃倒置培养过夜。
C. 鉴定经12-16小时培养后，培养皿上生长着许多白色和蓝色菌落，蓝色菌落只含有载体，而白色菌落为DNA重组子（载体+插入片段）。
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pUCm T-载体试剂盒组成编号规格SK2211 1 µgSK2212 5 µg保存方法及注意事项该产品低温运输，-20°C保存，有效期为一年。
产品介绍pUCm-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T Cloning）的专用载体。
本载体由pUC系列载体改建而成，在pUC载体的多克隆位点处插入特殊的限制性内切酶识别位点，酶切后能在载体的3’端形成悬挂的“T”末端。
很多DNA 聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。
这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。
大大提高了3’末端A突出PCR产物的连接、克隆效率。
pUCm-T载体图谱及多克隆位点序列pSG-TS19载体试剂盒组成编号规格SK2221 1 µgSK2222 5 µg保存方法及注意事项该产品低温运输，-20°C保存，有效期为一年。
产品介绍pSG-TS19 Vector是用于克隆含有A末端PCR产物的理想载体。
该载体基于pUC19的T simple载体，与现行T载体相比，消除了多克隆位点区大多数酶切位点，避免载体上存在的位点和插入片段中设计的位点发生干扰。
在T突出两端设计两个Hin d III位点，可以用单一的酶Hin d III进行插入子鉴定，该位点的设计使得载体具有如下特点：A、对于有插入片段的载体，Hin d III酶切后将切下和插入片段大小一致的片段；B、对于掉T自连的载体，Hin d III不能切割；C、对于酶切不完全自连的载体，Hin d III酶切后掉下25 bp片段，大小可以在琼脂糖凝胶上分开。
由于Xcm I酶切不完全或者因为两端掉T的情况，载体自连所产生的转化子均为蓝斑，从而降低假阳性率。
插入位点两侧的距离经过优化，如使用M13通用引物进行测序，在获得良好的序列读取的同时，尽量减少载体序列残留。
pSG-TS19载体图谱及多克隆位点序列pUCm-B载体试剂盒组成编号规格SK2231 2 µg 1.5 ml 选择液SK223210 µg7.5 ml 选择液保存方法及注意事项该产品低温运输，-20°C保存，有效期为一年。
产品介绍pUCm-B Vector是一种高效快速克隆平末端DNA片段的载体。
它是由Sma I酶切后产生的即用型线性载体。
Sma I位点位于自杀基因之中，载体自身连接转化后不能生长，最后得到的转化子几乎都是含有平末端DNA 插入片段的重组子。
该试剂盒使用方便，可以直接用于连接反应，免去繁琐的酶切、电泳检测、纯化、去磷酸化、再纯化等步骤。
可用于克隆酶切产生的平末端DNA、Pfu酶扩增的PCR片段、cDNA 片段、3'和5'RACE 片段、Taq酶扩增的PCR 片段(部分为平末端）等。
pUCm-B 载体图谱及多克隆位点序列Acc I MluT-载体PCR产物克隆试剂盒试剂盒组成组分SK2213，20次SK2214，100次T Vector 1 µg 5 µg10×Ligation Buffer50 µl200 µl50% PEG 400050 µl200 µlT4 DNA Ligase, 5 U/µl100 U500 USterilized ddH2O 1 ml 1 ml操作手册1份1份保存方法及注意事项该产品低温运输，-20°C保存，有效期为一年。
产品介绍pUCm-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。
本载体由pUC系列载体改建而成，在pUC载体的多克隆位点处插入特殊的限制性内切酶识别位点，酶切后能在载体的3’端形成悬挂的“T”末端，大大提高了3’末端A突出PCR产物的连接、克隆效率。
本载体在插入位点两端独特设计了两个Pst I 识别位点，可以用Pst I 单酶切对插入片段进行检测，大大方便了客户的酶切检测步骤。
经本载体克隆的PCR片段，可以用M13通用引物和T7启动子引物进行测序。
16实验准备☑ PCR产物3’末端带有突出的A碱基：Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶扩增的PCR产物3’末端均带有突出的A碱基。
建议扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行回收，再进行连接转化实验，可以使用生工产品柱式DNA胶回收试剂盒（SK8131/8132）。
如果PCR扩增产物特异性很高，可直接使用生工产品柱式PCR产物纯化试剂盒（SK8145/8146）纯化PCR产物。
☑ PCR产物3’末端没有突出的A碱基：Pfu、Pwo、Tli或DeepVent等DNA聚合酶具有3’→5’外切酶活性，其扩增的PCR产物末端可能不带有3’ A，要对这种平末端PCR产物进行克隆，应先对其进行3’末端加A，再进行连接转化实验。
建议选用生工产品dA-T ailing Kit（SK2291/2292）进行加Ａ实验。
☑ 自备试剂：SOC培养基、IPTG、X-gal等。
标准操作步骤1.在0.2 ml PCR管中配制下列连接体系：反应组分10 µl 反应体系插入的目的片段X µl（0.2 pmol）pUCm-T Vector 1 µl（50 ng）10×Ligation Buffer 1 µl50% PEG 4000 1 µlT4 DNA Ligase 1 µlSterilized ddH2O补足至10 µl2.16 °C连接1-12 h。
3.将100 µl感受态细胞置于冰上解冻后，加入上述10 µl连接液，轻轻混匀，冰上放置30 min。
4.42°C水浴热激90 sec，再冰上放置5 min。
5.加入900 µl SOC培养基，37°C振荡培养1 h。
6.4000 rpm离心3 min，用枪头吸掉750 µl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。
7.将细菌悬液均匀涂布在含20 µl IPTG（100 mM ）和100 µl X-gal（20mg/ml）的氨苄青霉素抗性的LB平板上。
8.将平板于37°C培养1 h，然后倒置培养过夜。
9.用牙签挑取白色菌落，以M13通用引物或基因特异性引物进行PCR扩增，确认载体中插入片段的长度大小。
或将白色菌落挑至含氨苄青霉素的液体培养基中37°C培养过夜，提取质粒后进行酶切鉴定。
16操作提示1.PCR产物的纯度A.连接反应前需用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，如果电泳检测PCR产物条带弥散，或出现非特异条带，则需要切下目的条带，用胶回收试剂盒对目的片段进行回收。
若PCR产物电泳检测只有预期大小的明显条带，也应使用PCR产物纯化试剂盒直接纯化PCR产物，以除去引物二聚体。
不经纯化的PCR 产物在某些条件下可直接用于连接，但由于引物二聚体和PCR产物中其它物质的影响，造成含有插入片段的阳性克隆数减少，因而需要筛选很多克隆方可得到含有目的PCR产物的阳性克隆。
2.平端PCR产物A.具有校正活性的热稳定性DNA 聚合酶如Pfu、Pwo、Tli在进行PCR扩增时产生平端PCR产物。
这种平端PCR 产物可以进行3’末端加A尾后连接到pUCm-T载体中，采用这种方法进行连接，可大大提高克隆的效率。
3.优化插入片段和载体的摩尔比A.pUCm-T载体优化的插入DNA片段和载体的摩尔比为3:1，采用3-10:1 的连接比例也可成功进行连接。
如果你的PCR产物开始连接的不理想，则有必要优化连接比例。
B.PCR 产物的量可采用以下公式进行换算：PCR片段的量（ng）= [ 加入载体的量（ng）×插入片段大小（kb）/载体大小（kb）] × 插入片段和载体的摩尔比4.筛选含插入片段的转化子A.插入片段成功克隆到pUCm-T载体中，可阻断β 半乳糖苷酶的编码序列，因而重组克隆可在指示培养基上通过颜色进行筛选。
大多数情况下含有PCR产物的克隆菌为白色，如果PCR片段和LacZ 基因在同一读码框内，即PCR片段碱基数是3的整数倍（含3’-A），并且读码框无终止密码子，则重组克隆菌可能为蓝色。
快速DNA连接试剂盒试剂盒组成组分SK2241SK2242Fast DNA Ligase20 µl100 µl5×Rapid Ligation Buffer200 µl 1 mlSterilized ddH2O 1 ml 5 ml操作手册1份1份保存方法及注意事项该产品低温运输，-20°C保存，有效期为一年。
产品介绍快速DNA连接试剂盒是通过T4 DNA连接酶催化双链DNA的3'-OH 和5'-P形成磷酸二脂键，把载体DNA和要克隆的目的DNA片段连接在一起，T4 DNA连接酶对粘末端DNA和平末端都能进行有效连接，成为一个完整的重组分子。
本试剂盒操作简单、快速。
全过程只需30分钟即可完成。
实验准备☑ 连接反应体系中，插入DNA与载体DNA的浓度比率为1:10，可获得相当数量重组体DNA。
☑ 自备试剂：载体等。
标准操作步骤1.在1.5 ml 无菌干净的离心管中配制下列连接体系：反应组分20 µl 反应体系5×Rapid Ligation Buffer 4 µl插入片段0.5 µg载体50 ngFast DNA Ligase 1 µlSterilized ddH2O补足至20 µl2.在离心机上微离3-5 s，室温放置20 min。
3.将混合物置于冰上，可直接用于转化，也可-20°C保存备用。
16双链DNA补平和连接试剂盒试剂盒组成组分SK2245，10次SK2246，20次Klenow DNA polymerase, 3 U/µl15 µl30 µl10×Klenow Reaction Buffer100 µl200 µl0.5 mM dNTP Mix20 µl40 µlT4 DNA Ligase, 2 U/µl20 µl40 µl10×Ligation Buffer100 µl200 µl50% PEG 4000300 µl600 µl Sterilized ddH2O 1.5 ml 1.5 ml操作手册1份1份保存方法及注意事项该产品低温运输，-20°C保存，有效期为一年。