不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 共33页
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶
两单体构成的人工合成凝胶 丙烯酰胺（Acr） N，N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）
作为电泳介质的优点 自由调节孔径；韧性好；性质稳定； 无电渗作用；无色透明。
合成聚丙烯酰胺凝胶的两种方法
化学合成系统 过硫酸铵（AP） 四甲基乙二胺（TEMED）
实验结果的分析
相关理论
表-1 血清中各蛋白质的相关特性
种类
分子量(万） PI
分 布(%)
清蛋白
6.9
6.1
55
1-球蛋白 2.1~30.8 7.3
5.0
2-球蛋白 4.1~72.5 6.8
9.0
-球蛋白
1.2~25 7.6
13.0
-球蛋白
15.6
8.0
11.0
-球蛋白
-球蛋白 2-球蛋白 1-球蛋白 清蛋白 前清蛋白
光学合成系统 核黄素 四甲基乙二胺（TEMED）
聚丙烯酰胺凝胶浓度与交联度
凝胶总浓度T=[(a+b)/m]×100% 交联剂百分比C=[b/(a+b)] ]×100%
a为Acr克数，b为Bis克数， m为缓冲液体积（ml) a:b＜10 凝胶变脆、硬、呈乳白色 a:b＞100易断裂 （一般a:b=30左右，根据T可适当调整））
蛋白质聚丙烯胺凝胶电泳
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（圆盘电泳）
电泳的概念
带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场 的作用下在特定的介质中向与其电荷性 质相反的电极方向定向泳动的现象。
广泛应用于生物大分子的分离和鉴定
电泳的基本原理
利用物质的两个差异来分离物质
电荷差异
电荷性质 电荷数量
电泳技术-聚丙烯酰胺凝胶电泳
.电泳技术.第一节第二节电泳技术概述常见电泳技术.常见电泳技术第二节纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳梯度凝胶电泳等电聚焦电泳二维聚丙烯酰胺凝胶电泳印迹电泳毛细管电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(m ethylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。
polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE.PAGE应用围广，可用于蛋白质、酶、核酸等的分离、定性、定量及少量的制备，测定相对分子质量、等电点等。
.1、聚丙烯酰胺凝胶的特点①可用于分离不同分子量的生物大分子聚丙烯酰胺凝胶的特点②更高的灵敏度：10－9～10－12 mol/L③化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”④电泳分离的重复性好⑤透明度好，便于照相和复印⑥机械强度好，有弹性，便于操作和保存.⑦无紫外吸收⑧可用作固定化酶的惰性载体2、凝胶聚合的原理及有关特性（1）聚合反应凝胶单体丙烯酰胺加速剂四甲基乙二胺AcrTEMED交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺Bis催化剂过硫酸铵(AP) 或核黄素.（2）凝胶孔径的可调性及其有关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系T(Acr和Bis总浓度)（%）= C(交联剂百分比)（%）= abmbab100100其中a=Acr克数，b=Bis克数，m=缓冲液体积(mL)a/b(W/W)与凝胶的机械性能密切相关a/b＞100 a/b=30 凝胶脆易碎，坚硬呈乳白色凝胶呈糊状，易于断裂完全透明而又有弹性C=6.5−0.3T不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，Davis的实验发现Acr＜2%，Bis＜0.5%，凝胶就不能聚合。
当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度。
动物医学 生化实验《实验四 SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS–PAGE)》课件
【原理】
带电的颗粒（蛋白质）在电场的作 用下发生迁移，移动的速度决定于各蛋 白质的带电量和自身分子的大小。若使 各蛋白质成分的带电量相近似时，则各 蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋 白质成分自身分子的大小 。
SDS能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键， 使蛋白质变性成为松散的线状。同时大多数蛋白 质的每个氨基酸能与固定量的SDS相结合形成 SDS–蛋白质复合物。由于SDS解离后带有很强的 负电荷，致使SDS–蛋白质复合物都带上了相同密 度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有 的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质同原有的 电荷差异。SDS与蛋白质结合后，改变了蛋白质 原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似 椭圆柱形。
【 操 作】 （一）安装夹心式垂直板电泳槽 （二）配胶及凝胶板的制备 1．配胶： 分离胶（浓度为15％）
水 凝胶贮液
1.5 mol/L Tris-HCl pH8.8 10％SDS 10%过硫酸铵 TEMED 总计
4.6ml 10ml 5.0ml 0.2ml 0.2ml
8 uL 20ml
2．凝胶板的制备：用细长头滴管将胶混 合液加到两块玻璃板的缝隙内直至距离 短玻璃板上缘0.5cm处，插入梳形样品 槽模板 。大约30min胶聚合，继续放置 20~30min后 ，小心拔出梳形样品槽模 板 ，将凝胶板装入电泳槽中。
在电泳槽中倒入电极缓冲液，连接 电泳仪与电泳槽，上槽接负极，下槽接 正极。打开电源，待染料前沿迁移至距 硅橡胶框底边1~1.5cm处，停止电泳 。
Байду номын сангаас
（五）凝胶板剥离与固定
电泳结束后，取凝胶板，卸下硅橡胶 框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板 ， 将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液， 固定10min 。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白
03
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳具有高分辨率和分离范围广的优点，广泛应用于蛋 白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
03
实验材料与设备
实验材料
01
02
03
04
05
血清样品
丙烯酰胺和N,N'- 分离胶和浓缩胶 甲…
电泳缓冲液
Байду номын сангаас
染色液和脱色液
用于电泳分离的血清样品 ，应保证新鲜、无菌，且 无杂质。
用于制备凝胶的原材料， 应保证纯度高、无杂质。
电泳仪
用于电泳分离的设备，应保证 性能稳定、精度高。
电源
用于提供电泳仪所需的电流和 电压，应保证安全、稳定。
电子天平
用于称量实验材料，应保证精 度高、稳定性好。
04
实验步骤与操作
实验前的准备
准备试剂
准备凝胶板
确保所有试剂都已正确配制，包括丙烯酰 胺、N,N'-甲叉双丙烯酰胺、TEMED、 Tris-HCl、甘氨酸、过硫酸铵等。
用于电泳分离的不同浓度 的凝胶，应保证性能稳定 、无杂质。
用于维持电泳过程中的pH 值和离子强度，应保证质 量稳定、无杂质。
用于染色和脱色分离后的 凝胶，应保证无毒、无害 、无污染。
实验设备
垂直电泳槽
用于放置凝胶和电泳缓冲液的 容器，应保证密封性好、不易 变形。
离心机
用于制备血清样品，应保证性 能稳定、易于操作。
结合其他技术
结合质谱分析、免疫印迹等其他技术，对分离出的蛋白质进行定性和 定量分析，以更深入地了解蛋白质的性质和功能。
应用于临床研究
进一步研究血清中特定蛋白质与疾病之间的关系，探索其在临床诊断 和疾病监测中的应用价值。
sds-垂直板聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳实验报告论文格式
sds-垂直板聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳实验报告论文格式SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳姓名：同组人：xxx学号：xxxx日期：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。
本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。
2 材料和方法2.1 实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。
通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是用化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。
在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。
叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis 高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。
不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[实验目的]学习和掌握不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法和测定蛋白质相对分子质量的基本原理和实验技术。
[实验原理]SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的高级结构，强还原剂β-巯基乙醇能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
[器材与试剂]一、器材垂直板电泳槽、电泳仪（直流稳压）、电子天平、移液器、烧杯、量筒、离心管、灭菌tip头、大培养皿、漏斗、滤纸、镊子、玻棒、电炉二、试剂1、30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中，验证其pH值不大于7.0。
置棕色瓶中，4℃保存。
2、1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液3、10% SDS溶液4、10%过硫酸铵：新鲜配制5、TEMED溶液：4℃保存6、1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液7、2×样品溶解液：2%SDS，5%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/L Tris-HCl （pH8.0）缓冲液。
8、5×Tris-甘氨酸电极缓冲液：每1000ml该溶液中，含15.1g Tris，94g甘氨酸和50ml 10%（W/V）SDS贮存液。
【课件】实验八不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳ppt
2.2 电泳的基本原理
利用物质的两个差异来分离物质
1.电荷差异 (1)电荷性质 (2)电荷数量
2.分子差异 (1)分子大小 (2)分子形状
2.3 电泳分离蛋白质的原理
1. 蛋白质两性解离与等电点
若向蛋白质溶液中加入适量的酸或碱，使羧基和氨基的解离度相同， 此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（PI）。
电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应
（2）不连续系统——不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓
度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应， 分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较 前者佳。
2. 根据蛋白质样品变性与否，分为： （1）变性电泳——也就是SDS-PAGE，蛋白质失去二三级结构； （2）非变性电泳 ——蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子
实验八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
贾跃腾 罗世翔
实验八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
贾跃腾 罗世翔
一、 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验操作及注意事项 （P138）
1.1 分离胶的配制
实验分组（每人做一管，每组配一份胶）
认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）
封管
分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，A1C2H2G5，每组总 体积为10ml，灌胶高度为7-8cm）
封正丁醇3mm（手法、高度、15min左右出现折光线时可进行 下一步操作）
注意事项：
1、封管要严，防止漏液。 2、固定玻璃管要竖直，防止夹碎。 3、每组配一份胶，试剂与移液管对号，准确加量。 4、配胶后立即灌胶（用滴管灌胶，用后立即清洗） 5、正丁醇沿管壁缓缓加入
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白
一、实验目的 1．掌握凝胶电泳的三个效应。 1．掌握凝胶电泳的三个效应。 2．了解该电泳的特点及适用范围。 ．了解该电泳的胺凝胶电泳的三种效应： 讲解聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应： 1、浓缩效应。 1、浓缩效应。 2、电荷效应。 、电荷效应。 3、分子筛效应。 、分子筛效应。
实验思考
1、解释聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应。 、解释聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应。 2、由本次实验结果解释醋纤薄膜电泳分离后 、 各条区带清晰度的差别。 各条区带清晰度的差别。
四、实验材料
1．圆盘电泳槽。 ．圆盘电泳槽。 2．电泳仪。 ．电泳仪。 3．玻璃管（10×0.6 cm）。 ．玻璃管（ × ）。 4．50l微量注射器、5ml注射器。 微量注射器、 注射器。 ． 微量注射器 注射器 5．10 cm长的局麻针头，10号针头。 长的局麻针头， 号针头 号针头。 ． 长的局麻针头 6．试剂 ．
三、实验原理
本实验利用聚丙烯酰胺凝胶作电泳支持物。 本实验利用聚丙烯酰胺凝胶作电泳支持物。电 荷数和分子大小不一的各种血清蛋白质通过浓缩效 电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。 应、电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。由于 具有以上三种效应，所以此方法分离效果好， 具有以上三种效应，所以此方法分离效果好，分辨 率高，血清蛋白在纸上电泳仅能分成5～ 个组分 个组分， 率高，血清蛋白在纸上电泳仅能分成 ～7个组分， 而在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出12～ 个 而在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出 ～30个 组分。 组分
五、实验方法
（一）凝胶柱的制备 1．凝胶玻璃管的准备 ． 2．分离胶的制备 ． 3．浓缩胶的制备 ． 4. 装柱
(二)加样 二 加样 (三)电泳 三 电泳 (四)剥胶 四 剥胶 (五)固定和染色 五 固定和染色 (六)漂洗 六 漂洗
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
试剂配制
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙 烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置 棕色瓶中。 4℃，1-2月 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取 Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏水定容至100ml （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取 Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水定容至100ml （5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取 Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0， 最后用蒸馏水定容至100ml
当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样 品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =－b m
R
+
K
其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移 率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均 为常数 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较， 就可以得出未知蛋白的分子量
聚丙烯酰胺具有神经毒性， 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套
？
• 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后, 需在其上加一层水,为什么? • 电极缓冲液中甘氨酸的作用? • 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶 中均含有TEMED和AP,试述其作用? • 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分 钟?
一抗
1 2 3 4 5 把膜从冰箱中取出，RT ，30min。 注： 封闭 液可回收 四个角蘸点水铺好保鲜膜后，加1：100的一抗 500ul（抗体稀释液495ul+5ul mouse p65抗体） 于保鲜膜上 蛋白面朝下，使尼龙膜和一抗充分接触。注避免 产生气泡，如有气泡，可用镊子将膜的四角轻轻 提起，排出气泡 盖上玻璃平皿，RT下孵育2hours TBST 10min×2 ； TBS 10min×1
不连续凝胶电泳示意图PPT共33页
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
不连续凝胶电泳示意图
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6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
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7、心急吃不了热汤圆。
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8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
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9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总说 工具不 好)。
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10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
2010实验八不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳-文档资料
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四、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）
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SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术 最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加 入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分 子量的大小（可以忽略电荷因素），其原理在于： 1.去电荷：由于SDS（十二烷基硫酸钠）产生的十二烷基硫酸根带负电， 使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋 白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别； 2.破坏结构：SDS能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋 白分子的二、三级结构。如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中 可能会形成分别对应于各个亚基的几条带； 3.统一构象：SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质-SDS复合 物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长 度都一样，约为18A； 这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原来的 电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小。
当进入 pH8.9 的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移 率超过蛋白质；
3.电位梯度的不连续性。
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3%胶
Gly - Pro - ClGly Pro ClGly Pro ClGly Pro Cl-
1.3 安装、加样、电泳
安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、 不漏水、除气泡） 加buffer（没过上下管口） 样品处理并加样（20ul） 电泳（6mA/管，距底1cm时停止） 剥胶 固定（时间5min） 染色（时间2min）
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浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，每组总体积为8ml， 灌胶高度为1.5cm,留1cm空隙加样） 倒掉正丁醇 灌浓缩胶
封正丁醇3mm（观察界面，判断凝固时间）
安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏 水、除气泡）
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注意事项：
1、封管要严，防止漏液。 2、固定玻璃管要竖直，防止夹碎。 3、每组配一份胶，试剂与移液管对号，准 确加量。 4、配胶后立即灌胶（用滴管灌胶，用后立 即清洗） 5、正丁醇沿管壁缓缓加入
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二、电泳基本原理及相关知识
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电泳的概念
带电粒子（胶体颗粒、离子等）在 电场的作用下在特定的介质中向与其电 荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。
广泛应用于生物大分子的分离和鉴定
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电泳的基本原理
利用物质的两个差异来分离物质
电荷差异 电荷性质 电荷数量
分子差异 分子大小 分子形状
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电泳分离蛋白质的原理
蛋白质两性解离与等电点 溶液pH与蛋白质PI决定蛋白质电荷性质与数 量 不同蛋白质分子大小和分子形状的差异
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聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样
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加buffer 样品处理并加样（20ul） 电泳（6mA/管，距底1cm时停止）
剥胶
固定（时间5min） 染色（时间2min） 漂洗脱色至背景透亮
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注意事项：
1、倒掉正丁醇，用滤纸吸干再灌浓缩 胶。
2、配胶后立即灌胶（用滴管）
3、灌胶后立即清洗滴管，防止胶凝固 于管中。
4、撕掉封口膜，用胶塞将玻璃管固定 于电泳槽上（竖直，防漏）
5、加电极缓冲液（注意液面）
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原理
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 是 由 单 体 丙 烯 酰 胺 (acrylamide ， 简 称 Acr) 和 交 联 剂 N,N- 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 (N ， N—methylenebisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二 胺 (N ， N ， N ， N—tetramethyl ethylenedia mine ， 简 称 TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8， 简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作 用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的 电 泳 称 为 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通
过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷
效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的 分辨率。
5-10
5×105
2-5
核酸(RNA)
104
15–20
104–105
5-10
10partment/biochemistry
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凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。 分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围
适用的凝胶浓度/(%) 蛋白质
104
20-30
1-4×104
15-20
1-5×104-1×105
10-15
1×105
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实验分组（每人做一管，每组配一份胶）
认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）
封管
分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，每组总体积为 10ml，灌胶高度为7~8cm）
封正丁醇3mm（手法、高度、观察界面变化和判断凝固、 时间掌握25min）
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实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类）
纸电泳
醋酸纤维膜电泳 凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳
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中山医学院 生物化学与分子生物学教研室
生化与分子生物学技术
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不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
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一、 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验操作及注意事项