第8章 细菌的遗传分析

2、重组作图法 1）适用范围： 在中断杂交试验中，根据基因转移的 先后次序，以时间为单位求出各基因间 的距离－－时间单位法。两基因转移时 间间距小于2分钟时，中断杂交法的图距 不精确，应采用传统的重组作图法。
2）原理 如果两基因紧密连锁，那么在知道这 两个基因转移的先后顺序的前提下，后 转移进去的基因发生了重组，那么先转 移进去的基因一定也已经转移进去。在 此基础上，用选择性培养基进一步挑选 重组子中的重组子。
在细菌接合过程中接合管连接F+和F细胞。
接合管
根据F因子存在的方式，E.Coli
可以分为
4种菌株： F-菌株：不带有F因子的菌株，作为受 体接受遗传物质。 F+菌株：带有F因子的菌株，作为供 体提供遗传物质。 Hfr菌株：高频重组菌株，F因子通过 配对交换，整合到细菌染色体上。 F’菌株：带有F’因子的菌株，既可转 移供体的染色体片段又可转移F因子。
一、接合
经细菌细胞直接的接触，把一个细 胞(供体)的遗传物质传递给另一个细胞( 受体)，从而实现遗传重组。 1)细菌经典的杂交实验 细菌的重组最初是在E.coli中发现的。 1946年Lederberg & Tatum通过E.coliK12 菌株杂交实验首次证明E.coli的有性生殖 和基因重组。
从Hfr菌株的基因在F－细菌中出现开 始，随着时间的推移，具有这一基因的 菌落逐渐增加，直到某一百分数为止。 基因出现的时间愈早，它所达到百分数 也愈高。 上述四个基因在混合后24分钟内，以 一定的顺序和时间间隔，先后从Hfr进入 F－的细菌中去。
染色体从一端开始，这一端称为原点 (origin)或O，以线性方式进入F－细胞中 ，基因离开原点越远，进入F－细胞越迟 。根据中断杂交技术，用杂交后Hfr基因 最初在受体细菌中出现的时间作为指标 ，可以作连锁图。这里距离的单位是分 钟，如ton在azi开始进入F－细胞后2分钟 进入，那么azi和ton相隔2单位。
三、中断杂交与重组作图
1、中断杂交实验法：(Wollman & Jacob，1950) Hfr：thr+leu+azirtonrlac+gal+strs， F-：thr-leu-azistonslac-gal-strr 中断 杂交 实验 的 步骤 ①接合 ②中断接合 ③杀死Hfr
④检查F-所含供体基因
大肠杆菌基因组长4.7×106 bp，在松弛状况：1 300 μ m长，是其细胞长度的1 000倍，必须压缩最少1 000倍后才能装入细胞中。实验证明：在DNA分子进行 折叠和螺旋化过程中还依赖于RNA分子的作用。
除了含有 一条染色体外 ，大部分细菌 还含有小的环 状的DNA分子( 质粒)。质粒 的复制独立于 细菌染色体。
二、F因子
F因子 Hayes提出在E.coli两个品系间遗传 物质的转移是通过一个Sex factor F（ 致育因子）介导进行的。携带F因子的菌 株称为供体菌或雄性，用F＋表示。未携 带F因子的菌株为受体菌或雌性，用F－表 示。 现在已经证实F因子是一种质粒，大 约包含100个基因。


F因子的遗传结构 1)原点：转移的起点； 2)形成接合管的基因群：与接合有关； 3)DNA复制酶基因：与自我复制有关； 4)插入序列：与其插入细菌染色体的过 程有关。
问题： 1）这种原养型细菌的出现可能是培 养上的互补，即一些物质从一个品系的 细胞中泄漏出来而被另一个品系的细胞 所吸收呢？ 2）另一种可能是一个品系的DNA片 段逸出细胞后，携带着相应的基因进入 另一个品系的细胞，因为这种转化作用 而产生了上述的营养型？
1950年Davis的U型管实验 他用一个U型管，在底部用一块细菌 过滤器隔开。U型管两臂中分别为营养缺 陷型品系A和B，使它们繁殖到饱和状态 ，同时在U型管的一端交替地吸和压，使 两臂中的培养液充分混合，但细菌的两 个品系的细胞却不会接触。在U型管中培 养一些时间后，再从两端分别取细菌进 行培养，没有发现一个细菌能在基本培 养基上生长。
不同营养缺陷型的大肠杆菌： A菌株：Met-bio-thr+leu+，需加甲硫氨 酸和生物素。 B菌株：Met+bio+thr-leu-，需加苏氨酸 和亮氨酸。 A菌株和B菌株营养缺陷型，不能在基 本培养上生长。 A菌株和B菌株混合培养在完全培养基 上，几小时后离心，涂布在基本培养基上 ，长出原养型(Met+bio+thr+leu+)菌落。
结论： Hayes 认为E.coli遗传物质的传递 不是交互进行的，而是一种单向转移的 结果。其中品系A作为遗传物质的供体， 品系B的细胞则是遗传物质的受体。当两 个亲本细胞接触后，供体A的遗传物质进 入受体B的细胞中，紧接着遗传重组现象 就在受体品系B的细胞中发生。供体品系 相当于雄性，受体品系则相当于雌性。
3、抗性突变型 细菌由于某基因的突变而对某些噬菌 体或抗生素产生抗性，对噬菌体的抗性 突变往往是以某种方式改变细菌的膜蛋 白，从而某种噬菌体不能吸附或吸附在 这种突变细菌上的能力降低。细菌对各 种抗生素的抗性机制各不相同。抗链霉 素突变型的核糖体30S亚基的S12蛋白不 再和链霉素结合，因此抗性突变细菌可 以在链霉素存在的情况下，进行正常的 翻译作用和正常的分裂繁殖。
规律： 任一行中任何一对相邻的基因在其 他各行中也是相邻的。例如：his基因总 是一边为gal，另一边为gly。每个Hfr菌系 的基因排列顺序都是相同的，所不同的 是O点的位置都有改变，基因转移的方向 不尽相同，致育因子（F）最后转移。
结论： 1）F因子的插入方向将决定Hfr染色体的极性。
2）插入F因子的一端将是origin （原点）， 从原点Hfr染色体的转移开始；在F因子的另一 端为终止点（terminus）可能并不被转移，除 非整个染色体都被转移。
细菌接合重组的特点: 1) F-受体细胞只接受供体的部分染 色体，这样的细胞称为部分二倍体。在 这种部分二倍体细胞中，供体提供的部 分基因组称为外基因子，而受体提供完 整的基因组，受体完整的基因组统称内 基因子。这种重组不同于真核生物的完 整二倍体重组。

2）如果内外基因子之间发生单交换 ，则环状染色体被破坏，形成的线状染 色体不能复制，因而含有这种线状染色 体的细胞不能繁殖。 3）偶数次交换才能产生有活性的重 组子和线状片段。线状片段不能复制， 随着细胞分裂而被丢失。因此不会出现 相反的重组子。
细菌结构 简单：其基本 结构，包括细 胞壁、细胞膜 、染色体、核 糖体、细胞质 及内含物。特 殊结构如荚膜 和鞭毛。
细菌染色体不凝缩，没有着丝粒，也没有纺锤体 结构。 细菌繁殖：双链环形DNA分子随着细胞伸长而采取 二分分裂（binary fission）的方式分开。
二、细菌的基因组
细菌染色体大多为裸露的环状闭合DNA双链，没 有组蛋白和其他蛋白质结合，也不形成核小体结构。 细菌染色体位于细胞内一个称为“拟核”（ nucleoid ）的区域中。细菌的染色体长度为250～35 000μ m 不 等。
二、细菌的培养与突变体筛选
细菌的培养方法
基本培养基：仅能满足微生物野生型菌株生长 需要的培养基，称为基本培养基。 完全培养基：凡可满足一切营养缺陷型菌株营 养需要的天然或者半天然培养基 ，称为完 全培养基。一般可在基本培养基中加入富 含氨基酸，维生素和碱基之类的天然物质 配制而成。
细菌的培养有 两种方法：液体培 养基培养法和固体 培养基表面培养法 。 固体培养法有 利于细菌的分离和 计数。固体培养基 上每个单独的菌落 就是一个细菌细胞 的克隆。
Lederberg和Tatum认为两个亲本细菌 在基因重组过程中起着同等作用。 Hayes则证明：E.coli遗传物质的传 递方式与具有典型减数分裂的生物不同 。例如：两个亲本类型对后代的遗传贡 献并不相等，有些亲本基因的组合会在 后代出现，有一些则不会出现，而且所 有后代中出现的基因都是连锁的。
2、分解代谢功能的突变型 野生型品系能利用比葡萄糖复杂的不 同碳源，因为它能使复杂的糖类转化成葡 萄糖或其他简单的糖类，也能将复杂分子 ，如氨基酸或脂肪酸降解为乙酸或三羧酸 循环的中间物。这些降解功能称为分解代 谢功能。这也需要许多相关基因的表达， 其中任何一个基因的突变都会影响降解功 能的实现。 这种突变型称为分解代谢功 能的突变型。
大肠杆菌的染色体呈环形 Wollman和Jocob用不同的Hfr菌株进 行中断杂交试验，都可作成连锁图，可 是基因转移的顺序、转移起点和转移方 向都很不相同： Hfr H O thr pro lac pur gal his gly thi F
1 2 3 AB312 O thr thi gly his gal pur lac pro F O pro thr thi gly his gal pur lac F O pur lac pro thr thi gly his gal F O thi thr pro lac pur gal his gly F
第8章 细菌遗传分析
重点：大肠杆菌的性别特性和重组 特征，细菌重组作图的方法 ，细菌同源重组的机制。 难点：细菌重组作图的方法。
第一节
细菌的细胞和基因组
一、细菌的细胞 二、细菌的基因组
一、细菌的细胞
细菌: 真细菌（如大肠杆菌） 古细菌（如詹氏甲烷球菌） 多种形态存在：球菌（ cocci ） 杆菌（bacilli ） 螺旋菌（sprilla）等 大小随种类不同而异： 杆菌一般长1～ 5㎛，宽0.5～1 ㎛； 球菌以直径大小表示，一般为0.5～1 ㎛； 螺旋菌一般长为1～50 ㎛，直径为0.5～1㎛。
0 5 10 azi ton 15 20 Lac 25 gal
如果让Hfr×F－杂交继续进行，长达 二小时然后使之中断，发现某些F－受体 转变为Hfr。这说明Hrf的全部基因已转移 完毕，排在最后的F因子最后转移到受体 ，使它成为供体，但效率很低，是线性 染色体的最后一个单位，我们可得下图 ： 0 azi ton Lac gal F
影印培养法分离突变体菌株：
第三节
细菌的遗传分析
一、接合 二、F因子 三、中断杂交与重组作图 四、F’因子与性导 五、转化与作图 六、转导与作图
细菌中，大肠杆菌（E.coli）是最为 广泛的遗传学实验材料。 细菌遗传物质的传递可以通过三种途 径来来实现：
1）接合(conjugation)：通过供体与受体之 间的接触而传递DNA。 2）转化(transformation)：是指游离的细菌 DNA片段被吸收到不同的细菌细胞内(受体)。 3）转导(transduction)：是指一种细菌的 DNA片段经过温和的或经有缺陷的噬菌体传递给另 一种细菌。
1952年Hayes的细菌杂交实验 菌株A：met- thr+ leu+ thi+ 菌株B：met+ thr- leu- thi菌株A(经链霉素处理，不能分裂)与 菌株B混合，涂布在基本培养基上，有活 下来的菌落； 菌株B(经链霉素处理，不能分裂)与 菌株A混合，涂布在基本培养基上，没有 活下来的菌落。
第二节
大肠杆菌的突变型 及其筛选
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一、大肠杆菌的突变类型 二、细菌的培养与突变体筛选
一、大肠杆菌的突变类型
1、合成代谢功能的突变型 野生型品系在基本培养基上具有合成 所有代谢和生长所必需的复杂有机物的 功能，这称为合成代谢功能。这需要大 量基因的表达，其中任何一个必需基因 突变都会阻碍整个合成代谢功能的实现 ，这种突变型也称为营养缺陷型。
⑤作图
遗传分析要求鉴别重组受体，所以 需要用一种方法排除供体细胞。 一般的方法是选用带有选择标记的 F-受体。选择标记是指在中断杂交实验 当中，通过生长条件所选择的转移标记 （如thr+和leu+）；反选择标记则指用来 阻遏供体生长的标记（如strs）。
结果发现Hfr的未选择性标记基因进 入F－所需时间： 分种 转移的Hfr基因 ＜9 0 9 azir 11 azirtonr 18 azirtonrLac+ 25 azirtonrLac+gal+