下游技术实验讲义
生物工程下游技术
d. 对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应 加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开蛋 白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目 标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫 键的杂蛋白会影响包涵体的溶解。 e. 同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或 EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以 防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。
优点： ① 一定的选择性； ② 细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一 步分离过程 缺点：（只能用于实验室） ① 产物抑制造成效率低下； ② 溶酶价格高； ③ 通用性差， 不易确定最佳条件；
6、微波加热法
• 机理：微波加热导致细胞内极
性物质，尤其是水分子吸收微波 能，产生大量热量，使胞内温度 迅速上升，液态水汽化产生的压 力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成 微小孔洞，进一步加热可导致细 胞内部和细胞壁水分减少，细胞 收缩，表面出现裂纹。
缺点：复性活性回收率低，而且难与杂蛋白分
离。稀释法大大增加溶液体积，不利于后续的
分离纯化，且处理量太大，不利于工业放大 ；
透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体； 超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染。
2、高蛋白浓度下的复性方法：
（一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍
能得到较高的复性率。）
①缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到 复性缓冲液中,使得蛋白质在加入过程中或 加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性。 因为完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠 的蛋白一起聚集。
团状、丝状真菌、 几乎所有的微生物 较小革兰阳性菌不 细胞，包括含有包 宜，包含体不宜 含体的基因工程菌 的破壁
X-Press挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却 至-25～-30℃，形成冰晶，用500MPa以上
生物工程下游技术 PPT课件
/science/journal/1369703X
• Separation and Purification Technology
/science/journal/13835866
• Journal of Membrane Science
/science/journal/03767388
References-SCI journals
• Enzyme and Microbial Technology
/science/journal/01410229
• Journal of Chemical Technology and Biotechnology
/jpages/0268-2575
References-SCI journals
• Separation and Purification Reviews
• P. A. Belter, E. L. Cussler, W. Hu. Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology. New York: John Wiley & Sons, 1988
• D. Forciniti. Industrial Bioseparations: Principles and Practice. Iowa: WileyBlackwell, 2008
考核方式
• 根据课程基本要求，结合平时成绩、课程论文及 笔试（期末考试）三方面进行综合评定。
• 平时成绩20％ • 课程论文20％ • 期末考试60％
主要内容
1. 绪论 2. 下游技术理论基础 3. 发酵液预处理与细胞破碎 4. 沉淀 5. 萃取分离 6. 膜分离 7. 吸附与离子交换 8. 色谱分离 9. 亲和色谱
《生物工程下游技术实验》项目一
《生物工程下游技术实验》讲义实验项目一：“超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术”实验一：植物超氧化物歧化酶（SOD）活性测量(6学时)过程1.每组30g绿豆,洗涤，蒸馏水浸泡过夜，倒去浸泡的水，加入300 ml蒸馏水液，匀浆机匀浆，二层纱布过滤，离心（3000 rpm）得清液，取少量清液进行SOD活性及蛋白质含量测量，计算材料中SOD总活性单位及比活性单位（units/mg Pr）。
2.所得清液测量其总体积，缓慢加入硫酸铵至35%饱和度（查一般实验手册,约19.4g/100ml清液），5℃冰箱中静置备用下一实验。
SOD活性的测定：（二种方法取一种，本次实验用前者，要求理解后者的原理）●邻苯三酚自氧化法：这是最简单的一种检测方法，但干扰因素较多。
●NBT光化还原法：比较稳定，但受酚类物质干扰。
一、利用连苯三酚自氧化测SOD活性的方法溶液配制：1，连苯三酚：630 mg------→100 ml 10 mmol/L HCl (0.085 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成100 ml)。
共配500ml.2，pH 8.30 50 mmol/L Tric-HCl：A) 0.1 mol/L Tris: 12.114g-----1000 ml (储备液)B) 0.1 mol/L HCL: 浓盐酸稀释得到（8.5 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成1000 ml）(储备液)●0.05mol/L pH 8.3: 500ml A+199ml B-------定容到1000ml..操作：25︒C，3 ml 50 mmol/L pH8.30 的Tric-HCL 缓冲液，加入10 μl 50 mmol/L 连苯三酚（具体加入量应每次测量前校正，加入的原则是使下面的A325变化控制在0.07 ／min左右），迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯(应该用石英杯)中，每３０秒测一次Ａ３２５值，自氧化速率的变化（∆Ａ）控制在0.07 ／min左右，加入酶液后再测连苯三酚自氧化速率的变化（∆Ａ’），酶量的加入控制在使加样后的∆Ａ’在0.035/min左右。
生物工程下游技术实验讲义
⽣物⼯程下游技术实验讲义⽣物⼯程下游技术实验讲义⽬录实验⼀层析柱装填及柱效测定实验⼆溶菌酶粗提取实验三溶菌酶分离纯化实验四酶活⼒及蛋⽩质浓度的测定实验五溶菌酶纯度鉴定与分⼦量测定实验⼀层析柱装填及柱效测定⼀、实验⽬的1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定⽅法；2. 熟悉凝胶层析的⼀般过程；⼆、实验原理凝胶过滤层析也称分⼦筛层析、排阻层析。
是利⽤具有⽹状结构的凝胶的分⼦筛作⽤，根据被分离物质的分⼦⼤⼩不同来进⾏分离。
相对分⼦质量⼤的⽣物分⼦由于不能进⼊或不能完全进⼊凝胶内部的⽹孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或⼤的⽹状孔通过，⼤分⼦相对于⼩分⼦迁移的路径短，保留值⼩，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分⼦量⼩的⽣物分⼦保留值⼤，后从柱中流出。
凝胶层析常⽤于分离纯化蛋⽩质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗⽣素等⽣物⼤分⼦, 也可⽤于样品的浓缩和脱盐及测定⽣物⼤分⼦的分⼦质量等⽅⾯。
三、实验试剂与器材层析柱（ 1.6×30 cm ），砝码天平，玻璃棒，烧杯，刻度试管及试管架，滴头吸管，Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂），⽔浴锅，蓝⾊葡聚糖四、实验内容与步骤（⼀）测量层析柱的内径、⾼度，计算所需凝胶量⼲胶⽤量（g）=柱床体积（ml）/凝胶的溶胀体积(ml/g)由上式计算出的⼲胶⽤量再增加10%-20%（⼆）Sephadex G-50凝胶预处理称取相应质量的⼲凝胶，加⼊适量的0.02 mol/L PBS 在100℃⽔浴中加热溶胀1⼩时以上，溶胀之后将极细的⼩颗粒倾泻出去。
⽤真空⼲燥器抽尽凝胶中空⽓，并将凝胶上⾯过多的溶液倾出。
（三）层析柱的装填1 清洗：每组取⼀⽀层析柱，⽤清⽔冲洗⼲净。
2 安装与检查：检查柱下部烧结滤板是否完好⼲净。
安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。
对准出⼝处，放⼀只250mL烧杯。
8第八章 基因工程下游技术 PPT课件
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基因工程下游技术
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（1）菌体的处理。微生物或动植物细胞培养的产品是细胞 或培养液，均应将它们分开，分别处理。发酵过程除增殖 大量菌体外还有许多残渣混在发酵液中，可通过适当加热， 调整酸碱度或添加絮凝剂，使菌体与发酵液分离。悬浮液 中的菌体通过过滤或离心法将之分开。除加助滤剂外可用 真空过滤以提高效率。离心法常用自动间歇排渣离心机或 喷射型离心机。菌体分离后要经灭活处理并将菌体破碎。 物理破碎可用研磨法或挤压法制成匀浆，超声波振荡法使 介质引起空化而产生冲击波。酶处理可以专一地催化细胞 壁水解，裸露的原生质体在低渗条件下进一步破裂而释放 出细胞内含物。
（3）最后纯化产品经分装冻干，包装后即为成品。
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基因工程下游技术
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• 与传统方式相似,重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化 学性质的差异,在进行任何一种蛋白质纯化工艺设计之前, 都需要尽可能多地先对提纯的体系,目标蛋白和杂质的性质 进行了解。如目标蛋白质的相对分子质量、等电点、疏水 性、带电性、碳氢链或自由巯基存在情况等。另外还需对 影响目标蛋白活性的因素有了解,如温度、ｐH、有机溶剂、 蛋白变性剂、重金属离子、机械剪切力等,以保证纯化后的 蛋白活性。
营养物质、溶氧 、温度 、 pH
• 3 培养方式
分批、连续和补料分批培养
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基因工程下游技术
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三、下游过程
• 下游过程
指从发酵液中分离和纯化产品的技术过程，包括固 液分离技术（离心、过滤、沉淀等）、细胞破壁技 术（超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁 酶等）、蛋白质纯化技术（沉淀法、色谱分离法和 超滤法等），最后还有产品的包装处理技术（真空 干燥、冰冻干燥等），是运用生物化学、物理学方 法分离、纯化产品，最终将产品推向市场并获得社 会或经济效益的过程。
下游技术综合实验
一、实验目的
(l)掌握沉淀法提取四环素的基本原理。
(2)了解四环素的沉淀法提取工艺操作过程。
(3)考察四环素产品中是否混有从差向四环素,鉴定其纯度，并与粗品进行比较。
(4)熟悉纸层析法的操作过程。
二、实验原理
四环素为两性化合物，其等电点 pI=5.4。当溶液 pH 等于等电点时，四环素呈偶极离子状态(习惯上
（2）层析 点好样品后将滤纸条放入上述层析剂于室温下展开。
（3）荧光显影 展层后将滤纸取出，于溶剂前沿划记号，晾干，在浓氨水瓶口熏，然后在 254nm 紫外灯下观察荧光斑 点。量出点样原点到斑点中心的距离，求其 Rf 值。
五 思考题 （一）预习
1. 查阅文献资料，按如下要求归纳四环素的理化性质： 1) 结构式和相对分子量。 2) 说明不同 pH 值下，四环素在水中的溶解度变化情况。 3) 分别写出四环素游离碱和盐酸盐在水、丙酮和丁醇中的溶解度数值。 4) 写出影响四环素水溶液稳定性的因素。 5) 四环素容易生成那些降解产物？产生降解的条件是什么？
Y=RK/(1+RK)
其中 R=Vt/Vb
如果果胶酶主要分配在下相其回收率按下列公式计算：
Y=1 /(1+RK)
同理计算蛋白质的回收率.
果胶酶比活力（u/ml）=酶活力（单位）/酶液体积（mL）
五、思考题
（一）预习 1.简述双水相萃取中成相的原因。 2.说明实验数据的每步计算方法。 （二）实验的结果和讨论 1.将实验结果列入表格，并做出相图。 2.实验操作中应注意哪些问题？分析实验误差。 3.求上、下相蛋白质含量、果胶酶的活力及分配系数 K，求出相比 R，计算该两相系统中的 PEG 和(NH4)2SO4 的含量。 4.在配制双水相系统时，为什么必须充分混合？混合不充分会带来什么影响？
下游技术实验讲义
【实验一】薄层层析分析果汁糖成分√【目的要求】学习、掌握薄层层析分离的基本操作技术。
【实验原理】薄层层析是一种微量而快速的层析方法。
最早是Izmailov和Schraiber在1938年采用氧化铝薄层分离了植物提取液。
层析是在吸附剂或支持剂均匀涂布的薄层上进行的，故称薄层层析。
为了使所要分析的样品各组分得到分离，必须选择合适的吸附剂。
硅胶、氧化铝和聚酰胺是广泛采用的吸附剂，硅藻土和纤维素是分配层析中最常用的支持剂，在吸附刘或支持剂中添加了适合的粘合剂再涂布，可使薄层粘牢在玻璃板（或涤纶片基）这类基底上。
硅胶G是一种添加了粘合剂的硅胶粉，约含12%-13%的石膏（CaSO4）,它可以把一些物质从溶液中吸附于自身的表面上，利用它对各种物质的吸附能力不同，再用适当的溶剂系统展层使不同的物质得以分离。
例如糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的分子量和羟基数有关，经过适当的溶剂展开后，糖在薄板上的移动速度是戊糖>己糖>双糖>三糖。
若用硼酸溶液市制硅胶G可改进分离效果。
对己分开的斑点显色，而将与它位置相当的另一个未显色的斑点从薄层上与硅胶G一起刮下，以适当的溶剂将糖从硅胶G上洗脱下来，就可用糖的定量测定方法各组分的含糖量。
薄层层析一般采用上行法，在具有密闭盖子的玻璃缸中进行，溶剂倒于缸底，简单地将薄板放入即可。
保证层析缸内有饱和的蒸气是实验成功的关键。
保证措施是在层析缸内壁衬一层浸湿溶剂的滤纸或缩小层析缸的容积。
因为层析时，溶剂会从薄层上蒸发，样品移动到一定距离的时间就会处长。
若所用溶剂系统由几个成分组成，挥发性较大的成分首先蒸发，就会使混合溶剂的组分改变，而溶剂的蒸发从薄板的中央向两边递减，致使溶剂前沿呈弯曲状，结果往往是使两边的R f值大于中央位置的R f值。
薄层层析与其它方法比有明显的优点：层析时间短，可以分离多种化合物，用样品量少（微克级），与纸层析相比要灵敏10-100倍，观察结果方便，显色方法甚至可以用腐蚀性显色剂。
生物工业下游技术-讲义
目标物质（外相）→膜界面→膜相→膜界面（内相） →内相释放
在膜的两侧同时进行萃取和反萃取（或吸附与解吸）的操作。
二、液膜的膜相组成
膜相是一层很薄的液体，这层液体既可以是水溶液也可 以是有机溶液。它能把两个互溶但组成不同的溶液隔开，并 通过这层液膜实现物质选择性分离。
通常被隔开的两个溶液是水溶液(内、外水相)，膜相则 是与内外水相都不互溶的油性物质。
2．解乳化(破乳)工程
破乳方法通常有： (1)高速离心法； (2)加热法； (3)相转移法； (4)电破乳法。
二、乳化液膜技术的应用
1、回收抽丝工段排放废水中的锌； 2、用TOA(三辛胺)作为载体，分离柠檬酸； 3、酶的固定化液膜技术；
用乳化液膜取代半透膜包埋，在内水相底物形成产物。 优点：价廉，调节（载体，停留时间）方便，可回避抑制（底物、产物、
(2)内相化学反应促进迁移：
采用在溶质的接受相（如内相）添加与溶质能发生化学反应的试 剂，通过化学反应来促使溶质高效快速迁移来实现高效分离。
例如：乙酸液膜分离； 从废水中去除酚。
2．载体促进传递机制
在膜相中加入一种可自由流动被称为“载体(Carrier)” 的化合物，它能选择性地与外相中的待分离物质结合后透过 膜相并将它送入内水相。
膜相组成：
1．膜溶剂
2．表面活性剂
3．流动载体 4．膜增强剂
一般而言，膜相中表面活性剂占1％一5％，流动载体 （萃取剂）占1％—5％，90％左右是膜溶剂。
1．膜溶剂
膜相的基质。使用较多的膜溶剂是高分子烷烃、异烷 烃类物质的基体物质。较理想的膜溶剂通常有以下几个特点： (1)能保持操作过程中的稳定性。 有一定的粘度，又不溶解于内外水相。 (2)有良好的溶解性。 优先溶解欲提取的物质，而对杂质的溶解越少越 好，同时对膜相中的其他组分也有较好的互溶性。 (3)膜溶剂与水应有一定密度差。 利于膜相与料液的分离。
《生物下游技术》课件
目标产物的提取和纯化
1
提取和纯化是在细胞破碎后进行的步骤，其目的 是将目标产物从细胞碎片和其他杂质中分离出来 。
2
根据目标产物的性质，可以选择不同的提取和纯 化方法，如沉淀法、萃取法、吸附法、色谱法等 。
在生物下游技术中，吸附技术主要用于蛋白质、酶等生物活性 物质的分离和纯化。常用的吸附剂有硅胶、活性炭、树脂等。
色谱分离技术
色谱分离技术
利用不同物质在固定相和流动相之间的吸附、分配、离子 交换等作用力不同，实现物质分离的一种技术。
色谱柱
是实现色谱分离技术的核心部件，根据分离要求选择合适 的色谱柱填料和粒径。
在食品行业的应用
食品加工
利用生物下游技术提取和纯化食 品中的营养成分，如蛋白质、脂 肪和糖类等，用于生产食品添加
剂、营养补充剂等。
食品安全检测
利用生物下游技术检测食品中的有 害物质、微生物和农药残留等，保 障食品安全。
食品品质改良
利用生物下游技术对食品进行改性 ，提高食品的口感、色泽和保质期 等。
利用生物下游技术对植物 进行基因编辑和改良，培 育抗逆性强、产量高、品 质优良的农作物品种。
植物病虫害防治
利用生物下游技术生产具 有抗病虫害功能的转基因 植物，提高植物的抗病性 和抗虫性。
动物养殖
利用生物下游技术提取和 纯化动物生长所需的营养 成分，提高动物生长速度 和养殖效益。
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智能化和自动化技术
智能化和自动化技术将应用于生物下游技术中，实现生产过程的自 动化控制和智能化管理，提高生产效率和降低成本。
生物工程下游技术 ppt课件
二、干燥设备及干燥工艺
（一）干燥设备 物料的干燥是由干燥系统来完成。 不同干燥系统的设备组成是不同的，但是其核心设 备是干燥设备。
（三）生物工业常用的干燥技术
1.气流干燥技术 气流干燥技术是利用热气流将物料在流态状态下进行干 燥的过程。它把呈泥状、粉粒状或块状等的湿物料送入热气 流中，与之并流，从而得到分散成粒状的干燥产品。 气流干燥是对流干燥的一种。在气流干燥中，除一般使 用干燥介质为不饱和热空气外，在高温干燥时可以采用烟道 气。为避免物料被污染或氧化，也可采用过热水蒸汽。对含 有机溶剂的物料干燥，也可采用氮或溶剂的过热蒸汽作干燥 介质。
等速阶殌水分蒸发是在液滴表面发生蒸发速率由蒸汽通过周围气膜的扩散速率控制主要的推动力是周围热风和液滴的温度差温度差越大蒸发越快水分通过颗粒的扩散速率大于蒸发速率当扩散速率降低而丌能再维持颗粒表面的饱和时蒸发速率开始减慢干燥迚入减速阶殌
生物工程下游技术
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第十二章 蒸发浓缩与干燥技 术
第二节 干燥技术
一、概述
干燥的应用范围很广，所处理的物料种 类多，物料的性质差异很大。它几乎是生产 所有固态产品在包装前的最后一道工序。因 此，相应的干燥方法、干燥器的种类和类型 也比较多。
干燥方法的分类
按照热能供给湿物料的方式不同，干燥科分为以下 几类。 1.导热干燥。热能通过传热壁面以传导的方式传给 湿物料，让载热体不与湿物料接触，使其中的水分 汽化，然后，所产生的的蒸汽被干燥介质带走，或 用真空泵抽走的干燥过程。 2.辐射干燥。热能以电磁波的形式由辐射器传至湿 物料表面后，被物料所吸收化为热能，而将水分加 热汽化，达到目的。
食品生物工程下游技术ppt课件
• 用有机溶剂萃取水相中的目标组分时， 应调节水相中的pH值、温度、盐浓度 等，以提高萃取效果。
22
4.1.2 超临界CO2流体萃取
超临界萃取的技术原理：
• 利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即 利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而 进行的。在超临界状态下，将超临界流体与待分 离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸 点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。
• 所用的中性盐为硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、 氯化钠、磷酸二氢钠等，以硫酸铵最常用。
• 盐析得到的沉淀可采用过滤法或离心法与 盐溶液分离。
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4.3.3 有机溶剂沉淀法
• 生物大分子溶液中加入一定量的亲水性有 机溶剂，使溶质的溶解度降低而沉淀析出， 即有机溶剂沉淀法。
• 常用的有机溶剂为乙醇、丙酮、甲醇、异 丙醇等。乙醇最常用。
• 压力过滤 • 真空过滤 • 错流过滤
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3.2 细胞破碎
3.2.1常用细胞破碎方法（机械和非机械） • 珠磨法。珠磨机中细胞悬浮液与直径小1mm
的玻璃珠、石英砂等快速研磨，使细胞破碎， 使细胞内含物释放出来。 • 高压匀浆法。高压匀浆机由高压泵和匀浆阀 组成，细胞悬浮液通过针形孔，在高压驱动 使下高速运动并发生剧烈冲击，使细胞破裂。
• 预处理：加热、调整pH、絮凝 • 固液分离：珠磨、匀浆、酶溶、离心 • 初步纯化：萃取、吸附、沉淀、离心 • 精细纯化：层析、电泳、分子蒸馏 • 成品加工：结晶、浓缩、干燥
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1.5 下游工程的质量控制
• 首先确定下游工程的工艺路线和参数，在 生产过程中严格执行工艺流程和参数，以 保证生产高质量的产品。
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食品生物工程下游技术ppt文档
亲和层析的操作
载体活化、配基连接、吸附、清洗、洗脱、再生
亲和层析的特点
• 效率高：利用亲和吸附可以从粗提液中 一次性分离得到高纯度的活性物质。
食品生物工程下游技术
（四） 初步纯化
• 萃取（extraction） • 吸附（absorption） • 沉淀（precipitation）
萃取
• 萃取的原理：利用在两个互不相溶的液相中各种组分（包括目的 产物）溶解度的不同，从而达到分离的目的。
• 萃取可提取和增浓产物，并可除去部分杂质
吸附能力： 极性基团多>极性基团少 相对分子质量大> 相对分子质量小 芳香族化合物>脂肪族化合物 酸性溶液中吸附力强，pH=5
离子交换吸附
• 吸附原理：树脂上离子性功能团与溶液中的离子进行吸附。 • 树脂种类：强酸、弱酸、强碱、弱碱。强碱性物质选用弱
酸性树脂，弱酸性物质选用强碱性树脂。 • 过程：溶液加入经预处理的树脂后进行吸附，吸附了目的
• 分离精度高：可用于分离含量极低，结 构相近的化合物。
• 但通用性较差，洗脱条件苛刻。
五、精细纯化
• 采用一些特殊的高新技术进一步把杂质与 目的产物分离开来，包括层析、电泳、分 子蒸馏等。
5.1 层析
• 层析技术又叫色谱分离技术。 • 常见有纸层析、薄层层析、柱层析等。纸
层析和薄层层析操作简便，分辨率高，但 分离量太少，主要用于定性和定量分析。 柱层析进样量大，回收容易，可用于分离 纯化。
物质的树脂从溶液中分离，再把目的物质从树脂上洗脱下 来。洗脱条件与吸附条件相反。树脂可再生。
生物工程下游技术实验（整理版）
生物工程下游技术实验（整理版）生物工程下游技术实验实验一酵母RNA的提取及含量测定（紫外吸收法）实验二黑曲霉β-D甘露聚糖酶的纯化盐析实验三盐析β-D甘露聚糖酶活力测定实验四柠檬酸摇瓶发酵及结晶提取实验一酵母RNA的提取及含量测定一、实验目的与要求1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。
2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
二、实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。
一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。
其中苯酚法又是实验是最常用的。
组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。
向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。
上述方法提取的RNA 具有生物活性。
工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。
浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。
稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。
酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。
核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。
核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。
遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。
在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。
所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。
核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。
下游实验内容资料
实验一牛奶中酪蛋白的制备一、实验目的1.学习从牛乳中制备酪蛋白的方法。
2.了解从牛奶中制取酪蛋白的原理。
二、实验原理牛乳中的主要蛋白质是酪蛋白，含量约为 3.5g/100ml。
酪蛋白是含磷蛋白质的混合物，相对密度1.25-1.31，不溶于水、醇、有机溶剂，等电点为4.7。
利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH值调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂质杂质后便可得到纯的酪蛋白。
三、原料与器材鲜牛奶、恒温水浴锅、台式离心机、抽滤装置。
四、试剂1.95%乙醇2.无水乙醚3.0.2mol/l的醋酸-醋酸钠缓冲液A液（0.2mol/l的醋酸-醋酸钠溶液）：称取NaAc.3H2O54.44g，定容至2000ml。
B液（0.2mol/l的醋酸-醋酸钠溶液）：称取优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g，定容至1000ml。
取A液1770ml与B液1230ml混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000ml。
4.乙醇-乙醚混合液乙醇：乙醚=1：1（体积比）。
五、操作步骤1.将5ml牛奶置试管或小烧杯中，在水浴中加热至40℃，在搅拌下漫漫加入预热至40℃（应注意两种液体都应先预热至40℃再用），pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液5ml，用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7(用1%NaOH或10%醋酸溶液进行调整)。
观察牛奶开始有絮状沉淀出现后，保温一定时间使沉淀完全。
将上述悬浮液冷却至室温。
离心分离8min（8000r/min）或15min（2000r/min），弃去上清液，得到酪蛋白粗制品。
2.用蒸馏水洗涤沉淀3次（洗涤时将沉淀颗粒用干净吸管吹开或用毛细管的封闭一端搅开，充分洗涤），离心5min（12000r/min）或10min（3000r/min），弃去上清液。
3.在沉淀中加入3ml95%的乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。
用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀2次，最后用乙醚洗涤沉淀2次，抽干。
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【实验一】薄层层析分析果汁糖成分√【目的要求】学习、掌握薄层层析分离的基本操作技术。
【实验原理】薄层层析是一种微量而快速的层析方法。
最早是Izmailov和Schraiber在1938年采用氧化铝薄层分离了植物提取液。
层析是在吸附剂或支持剂均匀涂布的薄层上进行的，故称薄层层析。
为了使所要分析的样品各组分得到分离，必须选择合适的吸附剂。
硅胶、氧化铝和聚酰胺是广泛采用的吸附剂，硅藻土和纤维素是分配层析中最常用的支持剂，在吸附刘或支持剂中添加了适合的粘合剂再涂布，可使薄层粘牢在玻璃板（或涤纶片基）这类基底上。
硅胶G是一种添加了粘合剂的硅胶粉，约含12%-13%的石膏（CaSO4）,它可以把一些物质从溶液中吸附于自身的表面上，利用它对各种物质的吸附能力不同，再用适当的溶剂系统展层使不同的物质得以分离。
例如糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的分子量和羟基数有关，经过适当的溶剂展开后，糖在薄板上的移动速度是戊糖>己糖>双糖>三糖。
若用硼酸溶液市制硅胶G可改进分离效果。
对己分开的斑点显色，而将与它位置相当的另一个未显色的斑点从薄层上与硅胶G一起刮下，以适当的溶剂将糖从硅胶G上洗脱下来，就可用糖的定量测定方法各组分的含糖量。
薄层层析一般采用上行法，在具有密闭盖子的玻璃缸中进行，溶剂倒于缸底，简单地将薄板放入即可。
保证层析缸内有饱和的蒸气是实验成功的关键。
保证措施是在层析缸内壁衬一层浸湿溶剂的滤纸或缩小层析缸的容积。
因为层析时，溶剂会从薄层上蒸发，样品移动到一定距离的时间就会处长。
若所用溶剂系统由几个成分组成，挥发性较大的成分首先蒸发，就会使混合溶剂的组分改变，而溶剂的蒸发从薄板的中央向两边递减，致使溶剂前沿呈弯曲状，结果往往是使两边的R f值大于中央位置的R f值。
薄层层析与其它方法比有明显的优点：层析时间短，可以分离多种化合物，用样品量少（微克级），与纸层析相比要灵敏10-100倍，观察结果方便，显色方法甚至可以用腐蚀性显色剂。
【实验用品】1.器材：层析柱，铁架台及蝴蝶夹，部分收集器，恒流泵，喷雾器，层析缸，恒温烘箱，电吹风，毛细玻璃管，离心机，离心管，研钵，玻璃板等2.药品试剂：硅胶G，果汁(自制)，1%标糖溶液（葡萄糖、果糖、蔗糖、鼠李糖、棉籽糖、木糖等）、混合糖溶液、显色剂（苯胺、二苯胺、丙酮、磷酸），展开剂（正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：冰乙酸：水=2：6：6：4：1）【实验过程】1、制备硅胶G薄层板取硅胶G粉3.0g研钵中，加9mL 0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液，调匀后铺于洁净平整的玻板上，铺层后自然风干、固结，再于105o C烘箱中烘干活化1h。
取出后可用，亦可贮于干燥器中备用。
薄层表面要求平整，厚薄均匀。
2、糖在硅胶G薄层上的分离选制备好的薄板一块，在距底边1.5～2cm的位置用铅笔轻画直线，选6个点，相互等距（大于1cm）。
用毛细管分别点上不同的糖样品(点1~2次即可)，斑点直径不超过3mm。
待薄层上样品自然干燥后，将薄板置于盛有层析溶剂的层析缸中，自下向上展层，当展层溶剂到达离薄板项端约1cm处时取出薄板，前沿作一记号，吹干，除尽溶剂后均匀地喷上苯胺-二苯胺显色剂，100o C烘烤5~10min。
3、观察记录。
绘图，并记录各斑点的位置、颜色，测量色斑中心至起点以及展开剂前沿至起点的距离，计算R f值。
根据样斑的大小形状、颜色及深浅和R f值分析果汁中的糖分。
【注意事项】1.调制硅胶G成糊状物，稀稠合适，铺板迅速，均匀，表面平整。
特别是点样端，要铺满玻板。
2.点样时，样斑直径控制在3mm以内，样斑间距至少1cm;3.展开时，样品不能浸到展开集中；4.显色剂中的苯胺有毒，使用时应在通风柜中，避免与皮肤接触。
【实验二】牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备【目的要求】学习、掌握盐析法、等电点沉析分离的基本操作技术。
【实验原理】乳蛋白素广泛存在于乳品中，是乳糖合成所需要的重要蛋白质。
牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，酪蛋白在pH为4.8左右会沉淀析出，但乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。
利用此性质，可现将加热至40℃的牛奶中加硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来，酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。
将除掉酪蛋白的滤液pH调至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分杂质可随澄清液除去。
再经过一次pH沉淀后，即可得粗粗乳素蛋白素。
蛋白质、酶、氨基酸、核酸等都是两性电解质，当其溶液在某一pH值时，这些生物大分子的所带的正负电荷数目相等而呈电中性，此时溶液的pH值称为该物质的等电点。
生物大分子在其等电点的溶液中，溶解度最低，易发生沉淀，一般疏水性较强的蛋白质可用此法分离。
【实验用品】1、器材：烧杯（100 mL、250mL）、玻璃棒、滴管、量筒、低速离心机、50ml离心管、水浴锅、真空泵、布氏漏斗、抽滤瓶、精密pH试纸、酸度计、表面皿、电子天平等；2、试剂：脱脂鲜牛奶、硫酸钠、0.1mol/L HCl、0.1mol/L NaOH、95%乙醇、浓盐酸、标准缓冲溶液等。
【实验过程】【注意事项】1、硫酸钠要少量多次加入，动作要缓慢，不可操之过急一次大量加入。
2、离心前温度一定要降至室温。
【思考题】1、如何提高酪蛋白的收率？【实验三】硫酸铵分级盐析分离血清中的主要蛋白质【目的要求】1、了解盐析法分离血清中的主要蛋白质的基本原理；2、掌握硫酸铵分级盐析的基本操作技术。
【实验原理】盐析是最常用分离蛋白质的方法，是利用各种蛋白质所带电荷不同、相对分子质量不同，从而在高浓度的盐溶液中溶解度就不同，因此一个含有几种蛋白质的混合液，就可用不同浓度的中性盐来使其中各种蛋白质先后分别沉析下来，达到分离纯化的目的，这种方法称为分级盐析。
一般粗提取物常用它进行粗分离。
常用的盐析剂有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钠等，其中最常用的是硫酸铵。
用盐析法分离蛋白质，简便安全，而且所得的蛋白质并不丧失活性，是分离纯化中最佳的一种方法。
在实际操作时，可先把蛋白质溶液调至等电点，使其溶解度达到最低，然后加入粉末固体硫酸铵或饱和硫酸铵溶液，并达到一定浓度。
这时蛋白质即从溶液中析出，经过滤或离心，透析去盐，即可获得产品。
【实验用品】1、材料：新鲜动物血浆或血清（无溶血现象）100mL2、试剂：pH7.2饱和硫酸铵溶液、0.2mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）其配制方法如下：配A液0.2mol/L磷酸氢二钠溶液(称取磷酸氢二钠71.64g加去离子水精确配1000mL)；配B液0.2mol/L磷酸二氢钠溶液(先称取磷酸二氢钠31.21g加去离子水精确配100mL)；取A液约72mL，取B液约28mL，然后将这两种溶液边混合边用高精度pH试纸检测，调配成约100mL浓度为0.2mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲溶液备用。
3、器具：离心机、大烧杯（≥500mL）、烧杯（250mL）、高精度pH试纸、大容量瓶、移液管、玻璃棒等。
【实验过程】【注意事项】1、缓冲液的配制应准确。
2、滴加饱和硫酸铵溶液的速度要慢一些及搅拌的速度应适中。
3、加完硫酸铵溶液后要静置一段时间，至少20 min～30 min，使沉淀完全。
【思考题】1、本实验属于蛋白质分级盐析技术的Ks法还是β法？2、如何继续分离纯化上清液中球蛋白?3、为何加磷酸盐缓冲液？【实验四】 牛血清白蛋白在双水相萃取系统中的分配 √【目的要求】1、了解双水相系统成相的原理和操作方法。
2、掌握双水相系统相图绘制和分离蛋白质的操作。
【实验原理】双水相系统中使用的双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的盐溶液和高分子溶液组成。
双水相系统的制备，一般是将两种溶质分别配制成一定浓度的水溶液，然后将两种溶液按照不同的比例混合，静止一段时间，当两种溶质的浓度超过某一浓度范围时，就会产生两相。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈棕红色，最大光吸收在470nm ；当它与蛋白质分子中的-NH 3+经静电作用结合后使G-250呈蓝色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
根据这一性质建立一条考马斯亮蓝G-250与蛋白结合物的吸光度与蛋白含量关系的标准曲线。
测定蛋白含量时将酶样品溶解稀释到标准曲线的线性浓度范围内，再根据其吸光度和线性方程求出稀释样品的蛋白浓度，通过换算求出酶样品中的蛋白含量。
【实验用品】1、器材：离心机、离心管、烧杯、搅拌棒、量筒、分析天平。
2、试剂：牛血清白蛋白、PEG 400、硫酸铵、蒸馏水、考马斯亮蓝G-250 【实验过程】1. 相图绘制PEG 0.70g+dH 2O 0.5mL加入 (NH 4)2SO 4溶液 浑浊 0.3mL dH 2O…… 424铵双水相体系的相图。
2. 蛋白质分配系数的测定 蛋白质在双水相系统中分配系数K=C 上/C 下， 相比R=V 上/V 下。
上相液：吸取上相0.5mL，加dH2O定容至50mL下相液：直接取下相空白液：dH2O 1mL+考马斯亮蓝G-250 5mL【注意事项】1、离心前离心管须称重，离心管重量应保持一致，可用蒸馏水补重，以保证离心机正常运转。
2、配制双水相体系时应掌握好聚乙二醇、硫酸铵和水的比例关系。
【思考题】1、双水相萃取蛋白质的优点是什么？2、影响双水相成相的因素有哪些？【实验五】凝胶柱色谱分离蛋白质√【目的要求】1、熟悉凝胶色谱分离的基本原理；2、掌握凝胶柱色谱填充物的装柱、平衡、加样、洗脱等基本操作技术。
【实验原理】凝胶色谱是利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异而进行分离的技术。
当溶液在色谱柱内流过时，各种物质分子在柱内同时进行向下的移动和不定向的分子扩散运动。
大分子物质由于分子直径大，难于进入凝胶颗粒的微孔，只能在凝胶颗粒的间隙中随流动相快速向下移动；而小分子物质能够扩散进入凝胶颗粒的微孔中，因此在流动过程中不断地进出于胶粒的微孔，这样就使小分子物质向下移动的速度落后于大分子物质，从而使溶液中的各组分按分子量从大到小的顺序先后流出色谱柱，达到分离纯化的目的。
【实验用品】1、材料：葡聚糖凝胶Sephadex G-100、蓝色葡聚糖-2000、牛血清蛋白（溶菌酶）2、试剂：（1）蓝色葡聚糖-2000（2mg/mL）和牛血清蛋白（6mg/mL）组成的混合液（2）0.025M KCl—0.2M AC溶液，PH5.33、器具：酸度计、色谱柱、铁架台、试管、紫外分光光度计或紫外检测仪、自动部分收集器、恒流泵、烧杯、滴管、移液管、电子天平、玻棒、秒表。
【实验过程】凝胶溶胀：根据预计的总床体积和所用干胶的床体积，称出所需干凝胶放入大三角瓶或烧杯中，加入过量的缓冲溶液或去离子水，浸泡24h以上或沸水浴中煮沸溶胀2~3h，冷却至室温。