第4章 体内药物分析方法的建立和验证

良好。
5.限度要求
1）标准曲线5-8浓度，最高和最低浓度比1/10-1/20 2）回归方程a应近于零，斜率b接近1或大于1，系数R接近1， HPLC R>0.99；生物学法R>0.98。 3）需分区制备标准曲线（最高和最低浓度比>100）
三）准确度
指用该法测得的生物样；样品中待测药物的浓度与其真实浓 度的接近程度。 1.测定法 取空白生物基质数份，照“标准曲线下”配制，至少选标准 曲线的高、中、低3个浓度样品。每个浓度5个平行样，每个 样测定一次。与随行的标准曲线同测定
A:取标准物质 待测物质；内标物质
B:根据已知的分析方法进行测定
C:根据测定结果确定最佳条件：溶液pH值；温度及时间；试剂 用量；色谱条件
2.分析条件的选择
1）空白溶剂试验
A:取待测药物非生物基质溶液，按拟定的方法预处理，分析方
法的特异性 B:空白响应值应尽可能小或可忽略 2）空白生物基质试验 A:取空白生物基质（血、组织匀浆），照空白溶剂试验下操作 B:考察杂质对测定的影响 C:杂质不干扰测定
每种浓度5个平行样本，每个样本测定一次
B:另取等量的相同3个浓度的标准溶液，进样测定 C:计算 AT/AS×100，在相同条件的测内标物应在提取之后，溶剂
挥发之前加入，溶剂挥发后测定
E:内标法测定生物样品，应测定内标物的提取回收率。仅制备
一个浓度，5个平行样本，同法测定、计算
E:标准曲线模拟生物样品的生物基质应使用与待测的实际生物
样品的生物基质相同 1.标准曲线系列溶液的配制 1）精称标准药物适量，配贮备液 2）精量配贮备液适量，配制系列标准溶液
3）系列标准溶液浓度为模拟生物样品浓度的50倍
4）加量为生物样本体积的2% 5）难溶药物，适当降低系列标准溶液浓度，蒸干
6）线性模拟的标准曲线5-8点；线性模拟的标准曲线增加
作为LOQ的估计值。
F:体内分析中标准曲线的LOQ≥估计LOQ
1.测定方法
取同一生物基质，制备至少5个独立的生物样本，其浓度应使 S/N≥10，依法进行准确度、精密度验证
2.限度要求
A:生物样本测得的LOQ平均浓度在其表示浓度的±20%
B:生物样本测得的LOQ其RSD≤20% C:LOQ小于测定3-5半衰期后生物样品中的药物浓度或小于
五）定量限
A:方法定量限(LOQ)与检测限(LOD)均表示分析方法检测低浓度 样的能力，通常称为方法灵敏度
B:LOD指在噪音水平下识别生物样本中药物的最低浓度
C:当信噪比（S/N）≥3时，该信号有效。将S/N=3时样品的浓 度作为LOD D:LOQ 指保证具有一定可靠性的前提下，该方法能准确测定生 物样品中药物的最低浓度 E:LOQ的检测响应值为LOD的两倍以上，为S/N=10时的样品浓度
1）测定法 QC样品以高低或低高顺序以一定间隔，均匀地插入
整个分析批，与生物样本同时测定，并用随行标准曲线计算。
2）限度要求 每一分析批内，随行穿插6个QC样品。有4个在正
超出各自正常值的±20%。
常浓度的80%-120%内，RSD≤20%。允许有2个（不是同一种浓度）
7）标准曲线系列浓度为等梯度，公比为2
2.内标物溶液的配制
1）精称内标物适量，配内标物贮备液 2）精量配贮备液适量，配制内标物标准溶液
3）内标物标准溶液浓度为“标准曲线系列浓度”的中间浓度
3.标准系列模拟生物样品的配制
1）取空白血数份，加入“标准曲线系列浓度”适量（在加入 内标液适量），混匀
2）标准系列模拟生物样品高低浓度比1/10-1/20 3）同时配制空白样C=0
Cmax的1/10
六）稳定性
1.方法稳定性
A:考察待测物的标准物、其分析溶液在室温、光照等稳定性
B:方法建立过程中考察模拟生物样本预处理、室温或冰箱贮
存、冻融等稳定性。
2.生物样品稳定性
1）短期稳定性 考察模拟生物样品在室温、4ºC或-20ºC、冻融循环的稳定性
2）长期稳定性
考察实际生物样品经长期冰冻（-20ºC或-80ºC）后稳定性。 期限为从生物样本采集到分析完毕
D:计算体内药物浓度
第三节 分析方法的验证内容和要求
一.分析方法的选择
A:用于实际样品分析之前，对所建立的方法的可靠性、可行
性，应使用若干技术指标验证
B:验证步骤 分析方法验证；实际生物样品中药物测定 一）特异性：又称专属性、专一性，与选择性互用 A:是指当有杂质存在时，方法准确测定待测物的能力。通常表 示所检测的信号应属于待测物所特有 B:用来验证该方法所测定的物质是目标物质，且不受非目标物 质的干扰 1.内源性物质的干扰
模拟生物样品、待测药物+同时服用的药物模拟生物样品的检
测信号
B:比较的内容 Tr；n；T；R 4.与参比方法的相关性 A:参比方法选择（HPLC、GC） B:同时用两种方法测定不同浓度的系列含药生物样品
C:参比方法测得值为横坐标（x），拟定的方法测得值为纵座
标 （y），求回归方程y=a+bx，r为一致成度；a为拟定方法 受恒定干扰程度；b为拟定方法受比例干扰程度。 D: r=1 a=0 b=1 两种方法一致
B:质控样品池，试验研究初配制，与实际生物样相同条件下同
时保存 C:制备质控样品时，不能用制备标准曲线用的标准液，另配。
2.质量控制
A:未知样品的测定在方法确定后进行，每个样品测定一次，必要 时复测。 B:每批生物样品测定的同时应建立相应的标准曲线，并随行间隔 测定高、中、低QC样品，根据QC分析数据的可靠性。
B:试验人员
C:验室SOP D:分析软件
第二节 分析方法建立的步骤
一.分析方法的选择
A:样品中的药物浓度是分析方法的首要因素
B:样品中的药物浓度10-6-10-9g/ml
0.01ng 二.分析方法的建立 1.检测条件的筛选
C:HPLC 法检测限：紫外（UV）1ng；荧光 0.1ng ；电化学（ EDD ）
4）防止生物基质中加入过多溶剂，干扰测定，可将标准液和 内标液先加到试管中，蒸干后加生物基质
4.标准曲线的绘制
1）以待测物的响应值（A；h）或与内标物的响应值的比
（A1/A2；h1/h2）为（y）对浓度（x），回归得y=a+bx及r。绘 制标准曲线。 2）回归分析时在至少 7个浓度构成的标准曲线中，至多2个浓 度点数据因确切原因“离群”，可剔出，余至少5点数据线性
1）蛋白结合强时，不宜用溶剂萃取 2）原形药物与代谢物共存时，分离度是否良好
3）药物浓度过低采用高灵敏度方法
2.分析测定的目的与要求
1）药代动力学研究 A:测定血中的药物和代谢物 B:要求较宽的线性范围（Cmax/Cmin 1/10-1/20）
C:较高的灵敏度（10-9g/ml）、准确度
D:分离度大于1.5 E:常用的仪器HPLC、GC、LC-MS
2.限度要求
A:待测物的提取回收率高、中、低3个浓度均≥50%，且高中
的RSD≤15%，低浓度RSD≤20%。 B:内标物提取回收率≥50%，RSD≤15%
八.质量控制
1.质控（QC）样品
A:将已知待测物加到空白基质中，配制的模拟生物样品，用于 整个分析的质量控制，一般高、中、低3个浓度的质控样。
第四章
体内药物分析方
法的建立与验证
第一节
分析方法的设计依据
一.待测药物的理化性质及体内存在状况
1.待测药物的理化性质 1）待测药物的pKa值及其亲脂性、水和有机溶的分配系数 等决定萃取方法
2）药物挥发性判定是否GC检测
3）药物的紫外、荧光、电化学特性决定检测方法 4）药物酸碱、光、热的稳定性 2.待测药物的体内状况
3.测定方要求
1）测定方法与限度要求 A:高、中、低3个浓度样本，置于适当的容器内，在不同
条件、不同存放时间后，每个样本重复测定3次以上，其平均
值应在零时的±5%内。
B:考察时间在一个工作日以上，则应与新制的样品在相同条件 下的测得值比较。 C:若生物样本的长期稳定性考察，可与液态氮中保存的生物样 本， 在相同条件的测定值比较
2）血药浓度监测 A:要求线性在有效浓度范围内
B:分析方简便、易行、适用于长期和批量样品测定
C:常用的仪器TDX
3.生物样品的类型与样品制备方法
A:生物样品的类型与样品制备与分析方法与有密切关系 B:血浆血清，用蛋白沉淀-溶剂萃取技术，HPLC测定 C:用RIA时样品的预处理可粗放 4.试验室条件 A:试验室设备
指用1 次测定结果与多次测定结果的平均值的偏离程度。表示 分析方法的可重复性。
1.表示方法 方法精密度用SD或RSD表示，RSD=SD/X平均×100
1）批内RSD 又称日内RSD
2）批内RSD 又称日间RSD
2.测定方法
1）批内RSD
A:同一分析批（日内） B:随行标准曲线 C:高、中、低3种浓度，每种浓度5个平行样，每样测定一次。 D:计算日内RSD
2）批间RSD
A:5个工作日，每个工作日完成一个分析批测定 B:每一个分析批随行1条标准曲线
C:每一个分析批测高、中、低3种浓度样品，每种浓度1个样，
每样测定1次。 D:用随行的标准曲线计算日间RSD
3.限度要求
药代动力学、生物利用度：µg/ml水平RSD≤10%；ng/ml水平
RSD≤15%，在最低检测浓度附近RSD≤20%
3）模拟生物样品试验
A:取空白生物基质加入待测物制成模拟生物样品 B:照空白生物基质试验下操作
C:考察方法的专一性；线性范围；最小检测限；精密度；灵敏
度；萃取回收率 4）实际生物样品测定 A:预试 确定实际生物样品与模拟生物样品一致性 B:正式试验 按所建立的分析方法分析
C:比较实际生物样品与模拟生物样品相应特点