α-半乳糖苷酶活性测定方法的研究

（ V>9;H， ;< =%>+ 表达产物） 作为标准品， 绘制标准曲线， 根据 此外， 标准曲线确定待测 343 的活性。但标准品价格昂贵， 由于应用酶标仪方法检测时反应体系体积小 （ .# "1 ） ， 测活 误差较大。本研究在此基础上， 对 343 的测活方法进行改 进， 建立了一种简单易行的、 应用光谱分析法测定 343 活性 的实验方法。
［ 收稿日期］ ! "##$ % #& % ’( ［ 基金项目］ ! 国家重点基础研究发展规划 （ “ )*+ ” 计划） （ "##",-*’+(#. ） ［ 作者简介］ ! 高红伟 （ ’Leabharlann Baidu*$ % ） ， 女， 山东省茌平县人， 硕士， 助 理研究员。 /01： #’#2$$)+’&.& !通讯联系人，
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!!半乳糖苷酶活性测定方法的研究
技术方法
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为标准物。 !" #" $% 酶活性的测定! 在总体积为 " #$ 的反应体系中， 加 入底物 %&& !$， ’ ( 测活缓冲液 )%& !$， 水 %& !$， )*+ 孵育 "& #,- 以 上， 加 入 适 当 稀 释 的 酶 液 )&& !$， 于 )*+ 孵 育 "& #,-后， 取 %&& !$ 立即加入%. % #$ 终止液中终止反应， 于 ’&% -# 处测定光密度值。同时设置底物对照和酶液对照。 产物对硝基苯酚显黄色， 在 ’&% -# 处有最大吸收峰。 " / 定义： “ 在 )* + ， 以最适底物浓度， 最适 01 等条件 下， " #,- 内生成 " !#2$ 底物的酶量为一个酶活性单位。 ” 酶活性计算公式： ! （ / 3 #$）4 " ( ) ( #$ % ( & ( ’$
图 # % 对硝基苯酚和酶促反应产物的吸收光谱
间的变异系数为 ). *;A ， B %A ； 将同一批酶分装后每隔 " C 测定酶活 " 次， 每次 "& 管， 共测 % 次， 计算各次平均值的批 间变异系数， 测定结果的平均值之间的变异系数为 ’. ’)A ， 这说明此方法具有较高的精密度。 亦 B %A ， # . &% 线性关系及灵敏度 取重组 ?@? 按最终反应体系蛋白质量浓度分别为 %. & ， ). % ， ". *< ， ". )% ， &. %& ， &. ;; ， &. )% ， &. )& !: 3 #$ 进行稀释， 用 上述酶活性测定方法精确测定 ?@? 活性。每个浓度均设酶 与底物对照， 将测定结果对蛋白浓度进行作图， 确定线性关 系的最佳浓度范围及最低可检测值。 由图 ; 可 见， 当 反 应 体 系 中 酶 的 蛋 白 浓 度 为 &. ; = ). % !: 3 #$时线性关系最佳 （ ( 4 &. >>> ） ， 说明在此范围内相 关性良好。当反应体系中酶的蛋白浓度低于 &. ) !: 3 #$ 时， 酶活性不能被检出。 # . ’% 回收率试验 # . ’ . ! 对硝基苯酚标准曲线的建立 ! 取 "" 个小试管分别加 入 ; ##2$ 3 8 的 对 硝 基 苯 酚 溶 液 & ， %& ， "&& ， "%& ， )&& ， )%& ， ;&& ， ;%& ， ’&& ， ’%& ， %&& !$， 水 %&& ， ’%& ， ’&& ， ;%& ， ;&& ， )%& ， )&& ， "%& ， "&& ， %& ， & !$， 再加 入 ’ ( 测 活 缓 冲 液 )%& !$， 水 )%& !$， 于 )*+ 孵 育 "& #,（ 各 管 操 作 依 次 相 隔 ) #,- 进 行） ， 取 %&& !$ 用 %. % #$ 的终止液终止反应， 以第一个管为 空白， 用紫外9可见分光光度计测定 ’&% -# 的光密度值。以 对硝基苯酚 （ !#2$ ） 为横坐标， 光密度值为纵坐标绘制标准 曲线。重复实验 ; 次， 误差应 B "&A 。 对硝基苯酚标准曲线测定结果见图 ’ 。该标准曲线为
#% 结果
# . !% 最佳反应条件的选择 # . ! . !% 最佳反应时间的选择! 取 "" 个小试管， 加入 ’ ( 测 活缓冲液 )%& !$、 ’ ##2$ 3 8 的底物 %&& !$、 水 %& !$， )*+ 孵 育 "& #,- 以上， 然后加入 )*+ 的 "9半乳糖苷酶的水溶液 （蛋 )&& !（ $ 各管操作依次相隔 ) #,- 进 白浓度为 &. &" #: 3 #$ ） 行） ， )*+ 孵育， 分别于 % ， "& ， "% ， )& ， )% ， ;& ， ’& ， %& ， *& #,- 取 出 &. % #$ 加入 %. % #$ 的终止液中终止反应， 用紫外9可见分 光光度计测定 ’&% -# 的光密度值。结果在 )& #,- 内酶反应 速度是恒定的， 此间酶活力与对硝基苯酚的生成量成正比。 本实验选定的酶促反应时间为 "& #,-。 # . ! . #% 最适反应 01 的选择 ! 最适反应 01 为 *. ’ ， 参见文 献 ［<］ 。 # . ! . $% 底物浓度的选择! 取 "’ 个小试管， 加入 ’ ( 测活缓 冲液 )%& !$、 不同浓度 （ & = "& ##2$ 3 8 ） 的 底 物 %&& !$、 水 %& !$， )*+ 孵育 "& #,- 以上， 然后加入 )*+ 的 "9半乳糖苷 酶的水溶液 （ 蛋白浓度为 &. &" #: 3 #$） )&& ! （ $ 各管操作依次 相隔 ) #,- 进行） ， )*+ 孵育 "& #,-， 迅速从中取出 &. % #$ 加 入%. % #$的终止液中终止反应， 用紫外9可见分光光度计测 定 ’&% -# 的光密度值。根据图 " ， 底物浓度在 " = ’ ##2$ 3 8 时， 酶促反应进入平台期。确定底物的浓度为 ) ##2$ 3 8。 # . #% 反应产物的特异性 为了检查酶促反应体系中所生成的产物是否是 565， 测 定了酶促反应产物在不同波长下的光密度值， 结果表明， 反 应产物在 ;>% = ’"& -# 处有最大吸收峰。与标准品的吸收 光谱一致 （ 图 )） ， 说明在 ’&% -# 波长下所测得的光密度值 可表示反应体系中 565 的生成量。 # . $% 批间、 批内精密度 同一批酶按照上述酶活检测方法重复测 * 次， 每次 "& 管， 计算批内变异系数， * 次 ?@? 活性测定结果的平均值之
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［$］ 存于 .] 备用 。
重组的 343 被广泛应用于农产品加工、 人 - $ U 血型改造 制备通用型血、 清除动物及人之间的主要异种抗原以及治疗
［" 8 &］ 。此前， 我们报道了重组咖啡 遗传性疾病法布莱氏病等
豆 343 的 活 性 测 定 方 法
［$， *］
， 该 方 法 以 市 售 咖 啡 豆 343
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军事医学科学院院刊! "##$ 年 ’" 月 第 +# 卷 第 $ 期 -D11 3KHJ I>1 I0J VK>，O0K "##$ ； ! ! YE1 +#! WE $!
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高红伟，宫! 锋，王璇琳，徐莉娟，由! 英，王颖丽，田曙光，章扬培 !
（ 军事医学科学院野战输血研究所， 北京! ’##(&# ）
［’］ 乳糖苷键 。在人、 动物、 植物及微生物体内均存在 343。
外2可见分光光度计 XY2’"## 为北京瑞丽分析仪器公司制 造。 > 5 > 5 @? 试剂配制 ! . Z 测活缓冲液 （ N[ $5 . ） ： 称取磷酸氢 二钠・’"[" U ))5 " 9， 柠檬酸・[" U ’"5 )" 9， 溶于水后， 定容 至 &## ;1。 底物贮存液： ’" ;;E1 : \ 的对硝基2苯基2!2O2吡喃半乳 糖苷水溶液。 终止液： #5 " ;E1 : \ 硼酸2氢氧化钠溶液 （ N[ )5 ( ） 。 >A @? 方法 >A @A >? 343 的制备 ! 343 是基因重组的酵母工程菌发酵 产物， 经超滤、 阳离子交换、 疏水层析、 阴离子交换纯化后， 保
>A @A @? 蛋白含量测定! -,3 法测 343 的蛋白含量， 以 -V3
>? 材料和方法
> 5 >? 材料与试剂 > 5 > 5 > ? 材 料 与 设 备 ! 对 硝 基2苯 基2!2O2吡 喃 半 乳 糖 苷 （ RWR4） 和对硝基苯酚 （ RWR ） 为 V>9;H 公司产品， -,3 蛋白 定量试剂盒购自 R>0GK0 公司， 其他试剂为国产分析纯。紫
军事医学科学院院刊! )&&* 年 ") 月 第 ;& 卷 第 * 期!
图 !% 底物浓度的选择
式中， " 为反应生成的 565 光密度值， "4" （ 反应液）7 " （ 底物）7 " （ 酶提取液） ； % 为 " !#2$ 对硝基苯酚 （ 565 ） 的 光密度值； & 为反应时间； #$ 为反应液总体积； ’$ 为样品体 积。 !" #" &% 反 应 产 物 吸 收 光 谱 的 测 定 ! 取 " ##2$ 3 8 的 565 &. % #$加入 %. % #$ 终止液中， 测定不同波长下的光密度值； 同时按酶活性的测定方法在相应波长测定酶促反应产物的 光密度值， 以波长为横坐标， 光密度值为纵坐标绘制曲线。
［ 摘要］ ! 目的：应用分光光度法建立一种简便、 准确、 灵敏、 稳定的重组 !2半乳糖苷酶 （ 343 ） 活性检测方法。方 法：利用紫外2可见分光光度计， 根据产物生成量计算所测标本的酶活性。结果： 该方法的批内变异系数为 "5 $+6 ， 批间变异系数为 .5 ."6 ， 均 7 &6 ； 在所检测该酶质量浓度范围 （ #5 + 8 "5 & "9 : ;1）内线性关系良好； 每组的平均回 收率均在 )&6 8 ’#&6 之间。结论： 与已经建立的测活方法相比较， 该方法具有无需酶的标准品， 结果可靠、 误差 小、 稳定性好、 操作简单， 适合实验室及工业化生产应用的优点。 ［ 关键词］ ! !2半乳糖苷酶； 活性测定； 光谱分析 ［ 中图分类号］ ! <&&&= . ［ 文章编号］ ! ’###2&&#’ （ "##$ ） #$2#&&)2#+ ［ 文献标识码］ ! 3