α-半乳糖苷酶活性测定方法的研究

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( V>9;H, ;< =%>+ 表达产物) 作为标准品, 绘制标准曲线, 根据 此外, 标准曲线确定待测 343 的活性。但标准品价格昂贵, 由于应用酶标仪方法检测时反应体系体积小 ( .# "1 ) , 测活 误差较大。本研究在此基础上, 对 343 的测活方法进行改 进, 建立了一种简单易行的、 应用光谱分析法测定 343 活性 的实验方法。
[ 收稿日期] ! "##$ % #& % ’( [ 基金项目] ! 国家重点基础研究发展规划 ( “ )*+ ” 计划) ( "##",-*’+(#. ) [ 作者简介] ! 高红伟 ( ’Leabharlann Baidu*$ % ) , 女, 山东省茌平县人, 硕士, 助 理研究员。 /01: #’#2$$)+’&.& !通讯联系人,
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!!半乳糖苷酶活性测定方法的研究
技术方法
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为标准物。 !" #" $% 酶活性的测定! 在总体积为 " #$ 的反应体系中, 加 入底物 %&& !$, ’ ( 测活缓冲液 )%& !$, 水 %& !$, )*+ 孵育 "& #,- 以 上, 加 入 适 当 稀 释 的 酶 液 )&& !$, 于 )*+ 孵 育 "& #,-后, 取 %&& !$ 立即加入%. % #$ 终止液中终止反应, 于 ’&% -# 处测定光密度值。同时设置底物对照和酶液对照。 产物对硝基苯酚显黄色, 在 ’&% -# 处有最大吸收峰。 " / 定义: “ 在 )* + , 以最适底物浓度, 最适 01 等条件 下, " #,- 内生成 " !#2$ 底物的酶量为一个酶活性单位。 ” 酶活性计算公式: ! ( / 3 #$)4 " ( ) ( #$ % ( & ( ’$
图 # % 对硝基苯酚和酶促反应产物的吸收光谱
间的变异系数为 ). *;A , B %A ; 将同一批酶分装后每隔 " C 测定酶活 " 次, 每次 "& 管, 共测 % 次, 计算各次平均值的批 间变异系数, 测定结果的平均值之间的变异系数为 ’. ’)A , 这说明此方法具有较高的精密度。 亦 B %A , # . &% 线性关系及灵敏度 取重组 ?@? 按最终反应体系蛋白质量浓度分别为 %. & , ). % , ". *< , ". )% , &. %& , &. ;; , &. )% , &. )& !: 3 #$ 进行稀释, 用 上述酶活性测定方法精确测定 ?@? 活性。每个浓度均设酶 与底物对照, 将测定结果对蛋白浓度进行作图, 确定线性关 系的最佳浓度范围及最低可检测值。 由图 ; 可 见, 当 反 应 体 系 中 酶 的 蛋 白 浓 度 为 &. ; = ). % !: 3 #$时线性关系最佳 ( ( 4 &. >>> ) , 说明在此范围内相 关性良好。当反应体系中酶的蛋白浓度低于 &. ) !: 3 #$ 时, 酶活性不能被检出。 # . ’% 回收率试验 # . ’ . ! 对硝基苯酚标准曲线的建立 ! 取 "" 个小试管分别加 入 ; ##2$ 3 8 的 对 硝 基 苯 酚 溶 液 & , %& , "&& , "%& , )&& , )%& , ;&& , ;%& , ’&& , ’%& , %&& !$, 水 %&& , ’%& , ’&& , ;%& , ;&& , )%& , )&& , "%& , "&& , %& , & !$, 再加 入 ’ ( 测 活 缓 冲 液 )%& !$, 水 )%& !$, 于 )*+ 孵 育 "& #,( 各 管 操 作 依 次 相 隔 ) #,- 进 行) , 取 %&& !$ 用 %. % #$ 的终止液终止反应, 以第一个管为 空白, 用紫外9可见分光光度计测定 ’&% -# 的光密度值。以 对硝基苯酚 ( !#2$ ) 为横坐标, 光密度值为纵坐标绘制标准 曲线。重复实验 ; 次, 误差应 B "&A 。 对硝基苯酚标准曲线测定结果见图 ’ 。该标准曲线为
#% 结果
# . !% 最佳反应条件的选择 # . ! . !% 最佳反应时间的选择! 取 "" 个小试管, 加入 ’ ( 测 活缓冲液 )%& !$、 ’ ##2$ 3 8 的底物 %&& !$、 水 %& !$, )*+ 孵 育 "& #,- 以上, 然后加入 )*+ 的 "9半乳糖苷酶的水溶液 (蛋 )&& !( $ 各管操作依次相隔 ) #,- 进 白浓度为 &. &" #: 3 #$ ) 行) , )*+ 孵育, 分别于 % , "& , "% , )& , )% , ;& , ’& , %& , *& #,- 取 出 &. % #$ 加入 %. % #$ 的终止液中终止反应, 用紫外9可见分 光光度计测定 ’&% -# 的光密度值。结果在 )& #,- 内酶反应 速度是恒定的, 此间酶活力与对硝基苯酚的生成量成正比。 本实验选定的酶促反应时间为 "& #,-。 # . ! . #% 最适反应 01 的选择 ! 最适反应 01 为 *. ’ , 参见文 献 [<] 。 # . ! . $% 底物浓度的选择! 取 "’ 个小试管, 加入 ’ ( 测活缓 冲液 )%& !$、 不同浓度 ( & = "& ##2$ 3 8 ) 的 底 物 %&& !$、 水 %& !$, )*+ 孵育 "& #,- 以上, 然后加入 )*+ 的 "9半乳糖苷 酶的水溶液 ( 蛋白浓度为 &. &" #: 3 #$) )&& ! ( $ 各管操作依次 相隔 ) #,- 进行) , )*+ 孵育 "& #,-, 迅速从中取出 &. % #$ 加 入%. % #$的终止液中终止反应, 用紫外9可见分光光度计测 定 ’&% -# 的光密度值。根据图 " , 底物浓度在 " = ’ ##2$ 3 8 时, 酶促反应进入平台期。确定底物的浓度为 ) ##2$ 3 8。 # . #% 反应产物的特异性 为了检查酶促反应体系中所生成的产物是否是 565, 测 定了酶促反应产物在不同波长下的光密度值, 结果表明, 反 应产物在 ;>% = ’"& -# 处有最大吸收峰。与标准品的吸收 光谱一致 ( 图 )) , 说明在 ’&% -# 波长下所测得的光密度值 可表示反应体系中 565 的生成量。 # . $% 批间、 批内精密度 同一批酶按照上述酶活检测方法重复测 * 次, 每次 "& 管, 计算批内变异系数, * 次 ?@? 活性测定结果的平均值之
"##$% &’()*+ *, !!-!.$/$0(*#1+$#’ $0(121(%
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[$] 存于 .] 备用 。
重组的 343 被广泛应用于农产品加工、 人 - $ U 血型改造 制备通用型血、 清除动物及人之间的主要异种抗原以及治疗
[" 8 &] 。此前, 我们报道了重组咖啡 遗传性疾病法布莱氏病等
豆 343 的 活 性 测 定 方 法
[$, *]
, 该 方 法 以 市 售 咖 啡 豆 343
!
军事医学科学院院刊! "##$ 年 ’" 月 第 +# 卷 第 $ 期 -D11 3KHJ I>1 I0J VK>,O0K "##$ ; ! ! YE1 +#! WE $!
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高红伟,宫! 锋,王璇琳,徐莉娟,由! 英,王颖丽,田曙光,章扬培 !
( 军事医学科学院野战输血研究所, 北京! ’##(&# )
[’] 乳糖苷键 。在人、 动物、 植物及微生物体内均存在 343。
外2可见分光光度计 XY2’"## 为北京瑞丽分析仪器公司制 造。 > 5 > 5 @? 试剂配制 ! . Z 测活缓冲液 ( N[ $5 . ) : 称取磷酸氢 二钠・’"[" U ))5 " 9, 柠檬酸・[" U ’"5 )" 9, 溶于水后, 定容 至 &## ;1。 底物贮存液: ’" ;;E1 : \ 的对硝基2苯基2!2O2吡喃半乳 糖苷水溶液。 终止液: #5 " ;E1 : \ 硼酸2氢氧化钠溶液 ( N[ )5 ( ) 。 >A @? 方法 >A @A >? 343 的制备 ! 343 是基因重组的酵母工程菌发酵 产物, 经超滤、 阳离子交换、 疏水层析、 阴离子交换纯化后, 保
>A @A @? 蛋白含量测定! -,3 法测 343 的蛋白含量, 以 -V3
>? 材料和方法
> 5 >? 材料与试剂 > 5 > 5 > ? 材 料 与 设 备 ! 对 硝 基2苯 基2!2O2吡 喃 半 乳 糖 苷 ( RWR4) 和对硝基苯酚 ( RWR ) 为 V>9;H 公司产品, -,3 蛋白 定量试剂盒购自 R>0GK0 公司, 其他试剂为国产分析纯。紫
军事医学科学院院刊! )&&* 年 ") 月 第 ;& 卷 第 * 期!
图 !% 底物浓度的选择
式中, " 为反应生成的 565 光密度值, "4" ( 反应液)7 " ( 底物)7 " ( 酶提取液) ; % 为 " !#2$ 对硝基苯酚 ( 565 ) 的 光密度值; & 为反应时间; #$ 为反应液总体积; ’$ 为样品体 积。 !" #" &% 反 应 产 物 吸 收 光 谱 的 测 定 ! 取 " ##2$ 3 8 的 565 &. % #$加入 %. % #$ 终止液中, 测定不同波长下的光密度值; 同时按酶活性的测定方法在相应波长测定酶促反应产物的 光密度值, 以波长为横坐标, 光密度值为纵坐标绘制曲线。
[ 摘要] ! 目的:应用分光光度法建立一种简便、 准确、 灵敏、 稳定的重组 !2半乳糖苷酶 ( 343 ) 活性检测方法。方 法:利用紫外2可见分光光度计, 根据产物生成量计算所测标本的酶活性。结果: 该方法的批内变异系数为 "5 $+6 , 批间变异系数为 .5 ."6 , 均 7 &6 ; 在所检测该酶质量浓度范围 ( #5 + 8 "5 & "9 : ;1)内线性关系良好; 每组的平均回 收率均在 )&6 8 ’#&6 之间。结论: 与已经建立的测活方法相比较, 该方法具有无需酶的标准品, 结果可靠、 误差 小、 稳定性好、 操作简单, 适合实验室及工业化生产应用的优点。 [ 关键词] ! !2半乳糖苷酶; 活性测定; 光谱分析 [ 中图分类号] ! <&&&= . [ 文章编号] ! ’###2&&#’ ( "##$ ) #$2#&&)2#+ [ 文献标识码] ! 3
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