STR实验操作

实验二十三复合扩增STR基因座的激光荧光自动检测分型

一原理：

将多个STR基因座的引物同时加入一个扩增管，优化引物设计和扩增条件，可实现对多个STR基因座的同步扩增。当不同基因座的扩增产物片段大小不同时，可通过电泳分离并区分不同基因座的等位基因片段。对基因片段大小相近和重叠的基因座引物标记不同的荧光物质，可获得荧光标记的扩增产物，通过识别标记的不同荧光物质，可识别电泳分离时片段大小重叠的不同基因座产物。荧光物质含有共轭双键，能够吸收激光并被激发至高能量激发态，处于不稳定激发态的荧光物质跃迁回到基态时，多余的能量以光子的形式释放，可用荧光信号识别记录设备记录下荧光染料发出的光信号。不同的荧光染料具有不同的激发波长和吸收波长，可被光信号检测设备准确识别和记录。310基因分析仪整合了毛细管电用技术和激光激发荧光检测技术，样品电泳进样采用计算机控制的自动电进样，当荧光标记的复合扩增等位基因片断通过毛细管电泳通过检测窗时，电泳时间和荧光种类与强度被自动收集和记录。每个样品电泳中加入已知片段大小的分子量内标，测算每个等位基因片段的相对大小，与基因座等位基因分型标准物比较，确定每个基因座的各个等位基因，对样本的各基因座自动分型。

二设备器材与试剂：

310基因分析仪，PCR扩增仪，台式高速离心机，恒温水箱，水浴锅；0.5∼2.5µl、0.5∼10µl、10∼100µl、100∼1000µl连续可调移液器，0.5∼10µl、10∼100µl、100∼1000µl高温灭菌塑料吸头，离心管水浴支架，离心管架，0.5ml、1.5ml离心管，0.2ml薄壁PCR扩增管；Chelex，含0.11mmol/L EDTA-Na2的pH8.0、0.005mol/L Tris-HCl缓冲液，荧光标记和非标记的多个基因座混合引物，混合PCR反应液，热启动Taq酶，ROX标记分子量内标，超纯去离子甲酰胺，高温灭菌蒸馏水。

三实验操作：

1.血样DNA制备（Chelex法）：

剪下约1cm×1cm的纱布血样，剪碎，置1.5 ml离心管，加1 ml高温灭菌蒸馏水，室温浸泡30min，浸泡过程中可不时轻轻震动；血液取30ul EDTA抗凝全血，加入含1 ml 0.1mmol/L EDTA-Na2的0.005mol/L Tris-HCl-（pH8.0）缓冲液的1.5 ml离心管，轻轻混匀，室温30min；15000 rpm离心4 min，尽量弃净上清。加200 uL 10% （w/v） Chelex，56℃水浴30min，

充分震荡；100℃水浴8 min，15000 rpm离心1 min，取5ul上清，用高温灭菌蒸馏水稀释10倍作PCR样本DNA。

2.PCR扩增：

每个样本扩增管反应终体积为10µl，按下列比例抽取。扩增多个样本时，可将引物混合物、混合PCR反应液、热启动Taq酶单个样本需要量乘样本数，将三种试剂加入一离心管，混匀后，分装到扩增管，再加入样本DNA。

引物混合物2µl

混合PCR反应液4µl

热启动Taq酶(5U/µl) 0.2µl

样本DNA 1.8µl

℃]× 28循环→ 6060

℃

℃→ 721min

℃→ 591min

℃→[941min

PCR循环条件：9511min

min → 15℃。

3. 电泳样品制备：

超纯去离子甲酰胺12.5µl

ROX标记的分子量标记0.25µl

Ladder 或10倍稀释的PCR产物 1.5µl

℃→迅速冰浴3 min，置310基因分析仪样本架。

95 5 min

提高310基因分析仪毛细管，开启310电源，待绿灯停止闪烁而长亮后，打开数据收集软件，新建片断分析样品表，填写样品表，选择4色模式，保存样品表；新建加样表，选择样品表文件，将样本架放入设备托架，执行开始电泳。每组电泳应包含一个等位基因分型标准物（Ladder），填写样品表时需将Sample Name栏的内容复制到Sample Info栏，Genotyper 软件需要这些信息，勿忘指定内标的颜色，用R。用GS STR POP4 （1 ml）F。

4. 310 GeneScan 分析：

运行GeneScan软件，在File下拉菜单中选New，再选Project，建立一个新Project；在Project下拉菜单中选Add sample files，然后依据样品文件所在路径找到并导入样品文件，包括Ladder。

点击栏标题全选Sample files, 在sample下拉菜单中选Install new matrix，然后依据Matrix文件所在的路径找到并导入与Dye Set-32即Filter Set F相匹配的Matrix文件，点击OK；若在加样表中正确选择了matrix，则不需再Install new matrix。

Size Std / Define New / 输入各片段的bp数：50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500，其中250 bp不定义，取名保存；所有样品均分别指定内标或共用该Project内电泳质量比较好的样品的内标；

点击Analysis，软件自动完成计算；在Window下拉菜单中选择Results Control，选定欲看的样品，点击Display显示结果。先看内标（R），通过比较不同样品之间250 bp带的计算结果是否相互接近，确认实验的重复性；再看其他颜色。保存Project。

5. 基因型分型：

启动profiler plus Template，Template启动后会自动启动Genotyper软件。

在File下拉菜单中选择Import，再选择From GeneScan File，选择所要分析的样品文件或GeneScan Project文件，点击OK。每个Project中一定要有一个Ladder文件；Ladder 文件必须在GS Sample sheet中的Color Info栏中注明“Ladder”字样；同时在Edit / Set Preferences / Import colors中选中R。

双击Check GS 500以运行该Macro，显示各个样品的内标，不同样品的250 bp带的计算结果一般在245 bp左右，相差不超过1 bp，据此确认不同样品之间的可比性；如果差别太大，则需要重新电泳。

双击Kazam （20% filter）以运行该Macro，软件开始计算等位基因的基因型。计算完成后显示图谱；双击B、G、Y等不同颜色按钮，可以切换不同颜色的数据。

双击Make CODIS Table以运行该Macro，软件以表格的形式显示分析结果。表格和图谱都可以打印输出。

四结果：

本实验采用的复合扩增试剂含一个性别识别基因座和9个STR基因座，用ROX标记已知内标片断，用三种荧光标记待测基因座引物，5-FAM（蓝色）标记D3S1358、vWA、FGA；JOE（绿色）标记Amelogenin、D8S1179、D21S11、D18S51；NED（黄色）标记D5S818、D13S317、D7S820。通过单管扩增和单次电泳，即可获得10个基因座的分型结果。