实验二 鱼类急性毒性实验

实验二鱼类急性毒性实验

一、实验目的

（1）掌握鱼类急性毒性实验的原理和操作

（2）掌握半致死浓度的计算方法

二、实验原理

鱼类对水环境的变化十分灵敏，运用毒理实验方法，观察鱼类在含有化学污染物的水环境中的反应，可以比较不同化学物质的毒性高低。鱼类毒性实验方法可分为静态方法和动态方法两大类。静态实验方法操作简单，不需要特殊设备，适宜于受试化学物在水中相对稳定，在实验过程中耗氧量较低的短期实验。动态实验方法要求具备一定的设备，对于在水中不稳定、耗氧量较高的化学物需要进行较长时间的实验观察时，可采用动态实验方法。本实验介绍静态实验方法。三、实验器材

玻璃缸或搪瓷桶、重金属盐、金鱼

四、实验步骤

（1）预备实验：预备实验的方法，可参考有关资料初步估计3～4个浓度，每个浓度用3～4尾鱼，观察24～48h。进行预备实验的目的是确定实验浓度的范围（找出引起实验鱼全部死亡和不引起实验鱼死亡的浓度）；观察鱼中毒的表现和出现中毒的时间，为正式实验选择观察指标提供依据。同时还要做一些化学测定，以了解实验液的稳定性、pH值、溶解氧的变化情况，以便在正式实验时采取措施。

（2）正式实验：

1、根据在预备实验中得到的浓度范围，其间距按等比级数插入3～5个中间浓度

实验中至少选择5个不同浓度，一般以7个浓度较常用，但所选择的浓度应包括有使实验鱼在24h内死亡的浓度，以及96h内不发生中毒的浓度。表中第1纵行包括的浓度最常用。

实验中无论采用何种分组方法，都必须同时设对照组。

配制实验液时应先配制少量高浓度的储备液，实验时临时稀释所需浓度的实验液。先把药液与水均匀混合后，再放入实验鱼，禁止先放入实验鱼后往实验缸中加受试药液，以免实验鱼接触到不均匀的高浓度的药液而提前死亡。

2、结果的观察：实验开始后8h进行连续观察并做好记录，8h后可做24h、48h

和96h的详细观察记录。实验过程中发现有特殊变化应随时记录。

观察指标包括理化指标和生物指标。理化指标是水的溶解氧、pH值、水温、硬度等，用以检查实验条件的稳定性，排除由于实验条件的变化可能带来对实验鱼的影响。生物指标包括鱼的死亡率和由于中毒而引起的鱼的生化、生理以及形态学、组织学的变化。

鱼死亡的判断方法是当鱼中毒停止呼吸以后，用小镊子夹鱼尾柄部，5min 内不出现反应可判定为死亡。死亡鱼必须移出实验缸，以免影响水质。实验过程应记录24、48和96h各组鱼的死亡数。

3、实验时间与毒性判定：正式实验至少进行48h，一般是96h。如果受试化学物

的饱和溶液在96h内不引起实验鱼死亡，可认为毒性不显著，但不能据此作出无毒的结论。因为是否无毒，还应根据鱼的生化、生理指标的检查才能最后确定。

TLm（半数耐受限量）用以表示化学物对鱼类生存的影响，是鱼类中毒试验的重要指标，与半致死浓度LC50的意义相同。根据鱼类急性毒性试验结果，对化学物质的分级标准如下：

以48hTLm值为依据：

剧毒< 0.5×10-6

中毒0.5-10×10-6

低毒> 10×10-6

4、注意事项：

①实验水的温度、pH值、溶解氧、硬度和水量的合理与否，对实验结果影响较大，必须严格控制，一般淡水鱼的水质要求如下：

Ⅰ.水温：实验中应保持鱼类原来适应的环境，温水鱼20～28℃，冷水鱼12～18℃，在同一实验中，温度的波动范围不要超过±2℃。

Ⅱ.pH：6.7～8.5

Ⅲ.溶解氧：> 4.0mg/L

Ⅳ.水量：每克鱼体重供水0.5 L以上。

通常在软水中进行。可采用自然界的江、河、湖水，如果用自来水，则必须进行人工曝气或放置3天以上脱氯。

②实验鱼的要求：鱼类毒性实验在我国常用四大养殖淡水鱼（青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼）、金鱼、鲫鱼等。其中以鲢鱼、草鱼应用较多。鱼的大小不同，对毒物的敏感度有所不同，一般所来鱼苗比成鱼敏感。在同一实验中要求实验鱼同属、同种、同龄。鱼的平均体长7cm以下合适（鱼体长指自上颌至尾柄和尾鳍交界处的水平距离）；金鱼的身宽，一般以3cm以下较合适。每个实验浓度可用鱼10～20尾。

实验鱼必须健康，实验前在类似实验条件下驯养一周以上，驯养期间每天投饵一次。为保证水中有足够的溶解氧，根据驯养缸中鱼的密度和对鱼的观察，每天换水1～2次。实验前一天停止投饵，但96h以上的实验鱼每天应给予少量不影响水质的饵料。实验前4天要求驯养缸中鱼最好不出现死亡，即使有死亡，也不得超过10%，否则不能用于正式实验。

五、半致死浓度的计算

在水生生物急性毒性试验中，半数致死浓度（LC50），平均耐受限（TL m），半数有效浓度（EC50）等常用来表示化学物质或工业废水对水生生物的急性毒性。由急性毒性试验所得数据计算LC50、TL m、EC50的原理和方法基本上是相似的。

用于计算半致死浓度的方法有多种，如概率单位法、最小二乘法、加权直线回归法、图解法、寇氏法、直线内插法等。这里介绍常用的直线内插法。直线内插法是图解计算LC50、TL m、EC50的一种简便方法，在水生生物毒性试验中被广泛使用。就常规毒性试验和水质监测而论，在试验的精密度范围内，使用直线内插法一般是准确的。

所谓直线内插法，即是根据两个或多个试验浓度组的动物死亡百分数作一浓度——死亡反应线，内插所要求的一个数值。因此，用直线内插法求半数致死浓度时，在试验设置的浓度组中必须至少存在这样两个浓度：一个要能引起50%以上的试验动物死亡，另一个出现的死亡率则要低于50%。

用直线内插法求LC50时，在半对数坐标纸上，以对数轴表示试验溶液的浓度，算术坐标表示试验动物的死亡百分数，绘出与试验所得数据相应的各点。将死亡率50%上下的两点做一直线，再自所作直线与50%死亡线的交点作一垂直于纵轴的垂线，该垂线与纵轴的交点即为所求的半致死浓度。如无半对数纸，也可用方格纸代替，但应先将浓度作对数转换，然后以纵轴表示之。垂线与纵轴的交点为LC50的对数，故需查反对数表才得半致死浓度。