曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、总酚含量和丙二醛含量的测定方法

曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中关于多酚氧化酶活性、过氧化物酶活

性、总酚含量和丙二醛含量的测定方法

1.多酚氧化酶（PPO）提取及活力测定

1.1基本原理：

多酚氧化酶（PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或采后的贮藏加工过程中，果蔬出现褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。

多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化物形成的产物在420nm处有最大光吸收峰。因此，可以用比色法测定多酚氧化酶的活性。

1.2实验试剂和仪器：

a.仪器及用具：研钵、高速冷冻离心机、分光光度仪、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000mL）

b．试剂

1）0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液

母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。

母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。

取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。

2）提取缓冲液（含1mmol PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）

称取340mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4%PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，polyvinyl-polypyrrolidone），取1mL Triton X-100，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。

3）50mmol/L邻苯二酚溶液

取275mg邻苯二酚，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至50mL。

1.3实验步骤

1）酶液制备

称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。

2）活性测定

取一支试管，加入4.0mL 50mmol/L、pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液（2.0mL 0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液加蒸馏水稀释4.0mL）和1.0mL 50mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100μL 酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长420nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1min记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。

1.4数据处理：

记录反应体系在420nm处的吸光值，制作OD420值随时间变化曲线，根据曲线的初始线

性部分（从时间I到时间F）计算每分钟吸光度值变化ΔOD420。

ΔOD420=OD420F−OD420I

t F−t I

式中ΔOD420——每分钟反应混合液吸光度变化值；

OD420F——反应混合液吸光度终止值；

OD420I——反应混合液吸光度初始值；

t F——反应终止时间，min；

t I——反应初始时间，min。

以每克果蔬样品（鲜重）每分钟吸光度变化值增加1为1个活性单位，单位是ΔOD420/min·g。计算公式：

U=ΔOD420×V

V s×m

式中V——样品提取液总体积，mL；

V S——测定时所取样品提取液体积，mL；

m——样品质量，g。

2.过氧化物酶（POD）提取及活力测定

2.1实验试剂和仪器

a．仪器及用具

研钵、高速冷冻离心机、分光光度仪、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（50mL、100mL 、1000mL）。

b．试剂

1）0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液

母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。

母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。

取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。

2）提取缓冲液（含1mmol PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）

称取340mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4%PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，polyvinyl-polypyrrolidone），取1mL Triton X-100，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。

3）25mmol/L愈创木酚溶液

取320μL愈创木酚，用50mmol/L、pH5.5乙酸缓冲液稀释至100mL。

4）0.5mol/L H2O2溶液

取1.42mL 30% H2O2溶液（30% H2O2溶液的浓度约为17.6mol/L），用50mmol/L、pH5.5乙酸缓冲液稀释至50mL，现用现配，避光保存。

2.2实验步骤

1）酶液制备

称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。

2）活性测定

取一支试管，加入3.0mL 25mmol/L（1.5mL 0.5mol/L H2O2溶液加蒸馏水稀释至3.0mL）愈创木酚溶液和0.5mL酶提取液，再加入200μL 0.5mol/L H2O2溶液迅速混合启动反应，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长470nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1min记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。

3.总酚含量测定

参照曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中关于总酚的测定，单位：mg/100g。此方法仅能判断测定样品之间总酚、类黄酮和花青素的相对含量。如果需要测定准确含量，需要与标准曲线进行比较。可以用不同浓度的没食子酸制作标准曲线，计算总酚物质含量，用μmol/g m F表示。

1.仪器及用具

研钵、具塞刻度试管（20mL）、滤纸、漏斗、移液器、紫外可见分光光度计。

2.试剂