脂肪干细胞操作流程 Medivet-china.
脂肪干细胞制备
脂肪干细胞制备
1、准备手术器械，进行严格消毒处理。
2、在手术过程中，医生将通过局部麻醉药对抽脂部位进行麻醉。
3、使用注射器将肿胀液（含有局麻药和生理盐水的混合物）注射
到脂肪层中。
4、使用吸引器将脂肪组织吸取出来，并将其收集在一个容器中。
5、对收集到的脂肪组织进行过滤和清洗，以去除其中的血液、肿
胀液和杂质。
6、将处理后的脂肪组织中的单个细胞分离出来，并将其培养在特
定的培养基中。
7、在培养基中添加一些生长因子和营养物质，以促进脂肪干细胞
的增殖和分化。
8、培养过程中需要进行多次换液和清洗，以确保细胞的健康生长。
9、在培养过程中，脂肪干细胞将逐渐增殖并分化成不同类型的细
胞，如成纤维细胞、内皮细胞和神经细胞等。
10、最后，将培养好的脂肪干细胞进行冷冻保存，以备后续使用。
脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后A C Ss的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除AS Cs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DM EM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsi n,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（C D29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
脂肪干细胞培养2011-3-5
干细胞论坛脂肪干细胞培养吸脂术时用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织20 mL. 在1 h内将其移至离心管内，加入等量PBS缓冲液，充分振荡后低速离心800 r/min×10 min. 反复冲洗3次后加入等量15 g/L I型胶原酶. 37℃水浴中充分振荡30 min，再加入等量胎牛血清（FBS）中止. 低速离心10 min后弃去上清. 将下层细胞用PBS悬浮后加入16 mmol/L NH4Cl 37℃水浴中10 min以裂解红细胞. 低速离心10 min后再用PBS冲洗3次. 最后将细胞用含100 mL/L FBS+10 g/L青霉素的DMEM悬浮后移入培养瓶中，37℃，50 mL/L CO2培养箱中孵育，48 h后首次换液，弃去悬浮细胞. 随后每3 d换液，1 wk后传代. 将第3代细胞用于流式细胞仪检测. 浓集细胞到109/L后进行流式细胞仪检测. 细胞传至第3代时将其以2×107/L 的细胞数分别转入各定向培养基中进行培养. 诱导培养2 wk后，对成脂诱导组进行油红Ｏ脂肪颗粒染色，另外：现在脂肪干细胞缺乏特异的表面标志鉴定，各类文献提到脂肪干细胞表达阳性的标志物有：cd13，cd29，cd59，cd49e，cd73，cd90，HLA-ABC等。
但表达阳性不代表具有特异性，所以要从标志物上鉴定脂肪干细胞还是很困难的，应该说不具有很强的说服能力。
按文献所说的步骤来提取脂肪干细胞，形态类似干细胞，并且具有多向分化的能力，这就足以说明提取的细胞是干细胞。
你要是想证明你养的就是干细胞，最好的办法我认为还是做个多向诱导分化。
干细胞传代吸出来以后，常速离心，用pbs洗两遍后，accutase管内消化5-10min，加入基础培养基离心洗去消化液，分瓶传代。
人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定[摘要]目的: 进行人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定, 为组织工程的进一步研究提供实验依据。
方法: 将剪碎的人脂肪组织加入Ⅰ型胶原酶消化, 离心。
干细胞流程及注意事项说明
干细胞流程及注意事项说明干细胞流程及注意事项说明引言：干细胞是一种具有自我更新和分化成各种细胞类型的特殊细胞。
它们在医学和生物科学研究中具有巨大的潜力。
干细胞疗法被视为未来医学的重要突破，可以用于治疗多种疾病和损伤。
然而，干细胞研究和应用过程中需要遵循一定的流程和注意事项，以确保安全和有效性。
本文将深入探讨干细胞的流程，并提供相关注意事项的说明。
一、干细胞获取流程1. 采集来源干细胞可以从多种来源获得，包括胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞。
每种来源有其特定的流程和技术要求。
2. 胚胎干细胞的获取胚胎干细胞主要来自胚胎发育的早期阶段。
在获得胚胎干细胞时，需要注意以下事项：- 获得捐赠的胚胎，并经过捐赠者的知情同意和伦理审查。
- 将胚胎培养到适当的发育阶段。
- 从发育早期的胚胎中分离出内胚层细胞，并将其培养为干细胞系。
3. 成体干细胞的获取成体干细胞存在于成人体内的各种组织和器官中。
获取成体干细胞时，需要注意以下事项：- 通过医疗手段或手术采集组织，如骨髓或脂肪组织。
- 分离组织中的干细胞，并培养其扩增为足够量。
4. 诱导多能干细胞的获取诱导多能干细胞是通过重新编程成体细胞而获得的多能干细胞。
获取诱导多能干细胞时，需要注意以下事项：- 获得捐赠者的细胞样本，如皮肤细胞。
- 将细胞样本重新编程，使其转变为诱导多能干细胞。
二、干细胞应用流程1. 干细胞培养和扩增在应用干细胞前，需要将其培养和扩增到足够数量。
这一过程涉及到培养基的选择、培养条件的优化和细胞生长的监测。
2. 干细胞分化干细胞可以分化为多种不同的细胞类型，如神经细胞、心肌细胞等。
控制干细胞的分化过程需要考虑以下因素：- 合适的生长因子和信号分子的添加。
- 适当的培养条件，如温度、养分和氧气浓度。
- 分化过程的监测和控制。
3. 干细胞移植当干细胞已经分化成特定的细胞类型后，可以将其移植到患者体内进行治疗。
移植过程需要注意以下事项：- 医学团队的专业知识和技术要求。
脂肪干细胞的提取及鉴定
脂肪干细胞的提取及鉴定一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定1、实验技术及原理:运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。
取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。
2、实验用品:2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤:3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养:3.2.1操作步骤a(培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材:取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
9-8大鼠脂肪干细胞的分离培养1
大鼠脂肪干细胞的分离培养1.试剂配制1.1双抗培养基的配制用100万单位链霉素溶解在10ml去离子水中，抽出0.8ml以及用80万单位的青霉素溶解在8ml的去离子水中，抽出0.5ml，分别加入DM EM培养基中，即配成100U/m1青霉素，100U/m1链霉素双抗培养基。
1.2成骨诱导剂的配制地塞米松259溶解于100ml去离子水中，抽出10ul;10gβ一甘油磷酸钠溶解于6ml去离子水中，抽出lml;25g抗坏血酸溶解于100ml去离子水中，抽出100ul，分别加入100ml的培养基中，既配成了含1nmol/L 地塞米松，50ug/m1抗坏血酸，10mmol/Lβ一甘油磷酸钠的成骨诱导剂。
1.3 DMEM培养基的配制取一瓶DM EM溶解于1000ml去离子水中，搅拌均匀后，用7%NAHC03调节其PH值为7.2-7.4。
用滤器过滤，分装在100ml的清洁无菌生理盐水瓶中置4℃冰箱中。
1.4含10%胎牛血清的DM EM完全培养基的配制取10ml胎牛血清溶解于90mLDM EM培养基中，即可配成含10%胎牛血清的DM EM培养基，装在100ml的生理盐水瓶中置4℃冰箱中。
1.5 0.25%胰蛋白酶的配制用精确的天平称250mg胰蛋白酶，并溶解于100ml培养基中，即浓度为0.25%。
用7%NaHC03调节其PH值为7.2-7.4。
用滤器过滤后，分装在100ml的清洁无菌生理盐水瓶中置4℃冰箱中。
1.6 Ⅰ型胶原多克隆抗体配制I型胶原多克隆抗体用去离子水配成1:100工作浓度，置4℃冰箱中备用。
1.7 二氮联苯胺(diminob ℃nzidin ℃DAB)显色剂的配制分别取lml试剂A，50ul试剂B，50ul试剂按A到C加入，即配成lmLDAB显色剂。
在配制成30min内用于免疫细胞化学染色。
1.8 地塞米松(DXM)液的配制地塞米松25g溶解于100ml去离子水中，抽出10ul。
既配成了含1nmol/L地塞米松，使用时根据需要配制成不同浓度。
脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，孵箱培养，24小时后第一次换液，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
脂肪干细胞讲座课件
• 3、脂肪干细胞能够储存多少年？ • 我们采用先进的液氮深低温罐（-196℃）储存脂肪干细胞，现有的
程控降温，添加细胞内、外保护剂等技术。时时检测，每年初检测 报告，脂肪干细胞常规上是可以长期保存的。
• 三、储存脂肪干细胞为什么要选择天晴
• 1、最先进的干细胞储存技术 • （1）自动化、全封闭式分离技术和深低温气相储存技术，将交叉
• 2、
组织细胞修复
• 脂肪干细胞表现出了在组织修复中的强大威力，临床克隆氏症中瘘管修复 以及肠粘膜修复中脂肪干细胞具有巨大的潜力；另外，脂肪干细胞诱导后 可以向胰岛素分泌细胞分化，为广大的糖尿病患者治疗带来了光明和希望。
• 3、
器官替代
• 利用3D技术打印出人体肾脏、膀胱、肝脏已经成为现实，而3D技术的核 心就是细胞、工程材料和细胞因子。利用脂肪干细胞强大的分化能力分化 出同一组织中的不同细胞和细胞生长因子，再利用3D打印技术、结合工程 材料，获得人工器官，进行器官替代疗法，已经不是遥远的传说。
B、延续生命，生命的银行
• 脂肪干细胞可以分化成如下组织细胞，用于以下疾病的临床治疗。 • （1） 脂肪细胞： 各种烧伤手术、除皱填充、乳房填充手术等医
疗美容手术；
• （2） 成骨细胞: 股骨头缺血性坏死的股骨，骨折，接骨之后不愈 合；
• （3）软骨细胞: 骨关节疾病； • （4）心肌细胞：心肌病，心梗死，高血压； • （5） 肌腱， 韧带：各种韧带肌腱损伤； • （6） 神经元：中风，帕金森，脊髓损伤等； • （7） 肝脏细胞：肝脏疾病； • （8）胰腺的胰岛细胞： 糖尿病等疾病的治疗；
A、养生、抗衰老、保持年轻态
• 随着年龄的增长，机体细胞出现老化，于是人们从年轻开始逐渐的 衰老，从健康开始逐渐的出现各种疾病。脂肪干细胞，全面提高人 体机能，改善人体退变现状，使机体保持青春活力和年轻状态，逆 转衰老：
脂肪干细胞PPT课件
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24代细胞表面marker鉴定
CD105＋
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猪AMSC细胞系建立的初步研究
研究表明，脂肪细胞由中胚层间充质干细胞发育而 来，近30多年来对脂肪细胞的研究主要使用的是鼠源性前 体脂肪细胞系和原代前体脂肪细胞。但是这两者都是已经 定向的单能细胞，只能分化为成熟的脂肪细胞，因此这两 个体外培养体系的研究只能局限于前体脂肪分化为成熟脂 肪细胞这一阶段的细胞和分子事件。
第25页/共48页
成肌诱导后的形态学观察
A
B
C
D
成肌诱导
成肌诱导第7天出现细胞球形变化(A)，诱导第14天开始出现接触、融合。部分出现伪 足，形态变长(B)，诱导第21天周围梭形细胞明显减少，形成巨大的球形细胞(C,D)。上 图为茜素红染色。
第26页/共48页
免疫荧光染色
成肌诱导
成肌诱导后肌红蛋白(myoglobin)免疫荧光染色
脂肪间充质干细胞向不同细胞分化是在特异性诱导因子作用下进行的。 下面介绍常用的一些多向诱导分化因子及诱导后的细胞特性。
第15页/共48页
细胞类型 脂肪细胞 成骨细胞 骨骼肌细胞 心肌细胞 神经元细胞 内皮细胞
诱导物
细胞特性
地塞米松,异丁基甲基黄 细胞中充满脂滴，油红o染色
嘌，胰岛素等
阳性
2-磷酸抗坏血酸, β-甘油 钙化性基质产物 ，茜素红染
结果：在成骨诱导分化的早期（第7天），可检测到成骨特异性基因Ⅰ型骨胶 原和骨钙素的表达，随着诱导时间的增加，2个基因的表达量呈上升趋势。
第24页/共48页
成骨诱导
上述结果说明：在合适诱导剂下，猪脂肪 间充质干细胞形态和排列均发生变化，成纤维 样的长梭形变为成骨样的方块形，细胞堆积呈 卵圆形或方形，茜素红染色和 RT-PCR均表明 可以诱导分化成骨细胞。
脂肪干细胞培养方法 组织块培养法
脂肪干细胞是一种多能干细胞，存在于脂肪组织中，具有较强的自我更新和分化能力，因此在再生医学领域具有广阔的应用前景。
脂肪干细胞的培养方法是进行研究和应用的基础，其中组织块培养法是一种常用的培养方法，其流程和步骤需要严谨操作和控制，以获得高质量的脂肪干细胞。
一、脂肪组织的获得脂肪干细胞的来源是脂肪组织，脂肪组织的获得需要经过以下步骤：1. 临床患者手术采集：通过手术方式从患者身体的特定位置（如腹部、臀部等）采集脂肪组织。
2. 动物实验材料采集：通过特定的实验动物模型，在实验室条件下从动物体内获取脂肪组织。
脂肪组织的来源直接关系到后续脂肪干细胞的培养和应用性能，因此需要严格控制采集过程和条件，确保获得的脂肪组织质量和干细胞丰度。
二、脂肪组织处理和组织块制备1. 脂肪组织的去除杂质：将采集的脂肪组织在无菌条件下进行处理，去除多余的结缔组织、血管和表皮层，以获得纯净的脂肪组织。
2. 组织块的制备：将经过处理的脂肪组织切割成适当大小的块状（约1mm³），以便后续细胞的释放和培养。
三、脂肪干细胞的释放和培养1. 组织块的酶解：将制备好的组织块放入消化酶（如胰蛋白酶）的消化液中，在37℃的恒温培养箱内进行酶解，使脂肪干细胞从组织块中释放出来。
2. 细胞的培养和传代：将释放出的脂肪干细胞进行原代培养和传代培养，培养基的配方和培养条件需要进行严格控制和优化，以保证脂肪干细胞的生长和分化。
通过以上步骤和方法，我们可以获得高质量的脂肪干细胞，为其后续在再生医学、组织工程和临床治疗中的应用打下坚实基础。
在实际应用中，还需要结合特定的研究和临床需求，对脂肪干细胞进行进一步的分化和功能评价，以实现其在不同领域的应用和开发。
脂肪干细胞的培养方法对于再生医学和组织工程具有重要意义，通过持续的研究和优化，必将为人类健康事业带来更多的机遇和挑战。
希望本文对脂肪干细胞组织块培养方法的介绍，能够为相关研究和应用人员提供一定的参考和指导，共同推动脂肪干细胞领域的进步与发展。
人来源脂肪干细胞的培养
人来源脂肪干细胞的培养1．脂肪干细胞原代培养1)取约500mg脂肪组织（自外科手术患者的皮下获取），再将脂肪组织一次挤压进入准备好的15ml离心管中，每个离心管中的组织不超过5ml。
2)吸取缓冲液PBS 7ml加入到上述装有组织的离心管中，用吸管吹打10~20次，然后静置1min左右，用吸管将组织下层的液体吸出。
如此反复直到所吸出的液体呈透明状，不带有血细胞为止；3)向有脂肪组织的试管中加入与组织量相同大约5ml左右的消化液（胰酶0.25%，I型胶原酶0.1%，以1：1比例混合配制而成），将试管密封，放入37°C恒温摇床中，190r/min，震荡消化30min。
此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体；4)吸出离心管中的下层液体移入含完全培养基（含10%胎牛血清的高糖DMEM）的新离心管中终止消化，然后将离心管封闭，1500rpm离心10min；5)用吸管吸取上清后去掉，加入1ml 培养基，轻轻吹打10~20次制成细胞悬液，将各个离心管中的细胞悬液收集起来，接种待用；6)在剩余脂肪中加入新的胰酶和胶原酶，重复以上步骤继续消化，重复2-3次，将收集到的有核细胞按照一定的密度接种到培养瓶中，放入37°C、5% CO2培养箱培养；7)第一次换液：大约12-24小时后，观察细胞贴壁即可进行第一次换液，此后每隔3天换液，待细胞生长至融合后进行传代。
2. 脂肪干细胞传代培养1)在超净工作台内吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗2-3次，之后加入1-2mL消化液（0.25%胰酶和0.04% EDTA(v/v 1:1)）；2)培养箱内进行消化（3-5min），倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化；3)用吸管反复有序轻轻吹打瓶壁上的细胞（动作要轻柔，注意不要产生气泡），使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液；4)将单细胞悬液移至离心管中，离心，(1000rpm,5min)，弃上清，加入完全培养基，轻吹使之松散，按1:2传代培养；5)显微镜下逐日观察传代培养的细胞，待贴壁细胞达到90% 以上融合时，再进行传代，如此反复。
SD大鼠脂肪干细胞原代培养
SD大鼠脂肪干细胞原代培养实验步骤材料准备：3-5只10-15日龄新生SD大鼠（刚刚开始长白毛）灭菌器械（镊子、眼科直剪、眼科弯剪、磁珠）5mL注射器，0.22μm滤器泡沫板、图钉（固定大鼠用）75%乙醇预冷的无菌PBS水，装在两个培养皿内15mL和50mL无菌离心管细胞筛无菌培养瓶培养基（F12+10%FBS+1%双抗）1．提前将所需物品全部放入超净工作台，紫外消毒30min。
2．配制0.1%Ⅰ型胶原酶约5mL，称取0.005gⅠ型胶原酶，溶解到5mL 超纯水里，混匀。
在超净工作台内，用0.22μm的滤器过滤除菌。
3．大鼠脱颈处死后放入75%酒精浸泡5-10min，放入超净工作台，将大鼠固定在泡沫板上。
4．依次剪开大鼠腹股沟区皮肤直至腹腔，暴露脂肪组织。
更换新的剪刀镊子，将脂肪组织取出放至PBS中，注意不要剪到血管。
5．P BS涮洗一遍后，仔细剔除脂肪组织上多余的血管和淋巴结，再用PBS涮洗一遍。
用新的镊子将脂肪组织夹到50mL离心管口，弯剪反复剪碎（剪10min），剪好后加入2-3倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶和灭菌的磁珠，37℃，温浴，每隔5min震荡一次（磁珠搅拌器）。
注：也可以采用磁珠37℃一直搅拌，这样可以加快消化效果缩短消化时间。
6. 消化完成后将细胞悬液转移至新的15mL离心管中，1200rpm/min离心4min，弃上层脂滴泡沫和上清液，用完全培养基重悬沉淀。
7. 将上一步得到的细胞悬液经细胞筛过滤（可以多加一点用于稀释细胞悬液，过筛的时候轻松一点），1200rpm/min离心4min，弃上清，完全培养基重悬，转入培养瓶，置37℃培养箱培养。
脂肪干细胞原代培养流程
脂肪干细胞原代培养流程
1.将收集到的脂肪组织移入50ml离心管，加入2倍体积的常温PBS用移液管吹打清洗：
清洗完成的指标？
2.1000转/分离心5分钟，是否需要低温？
3.用移液管将下层的液体和沉淀的血污弃掉，保留上层黄色组织，如何操作，为何不吸取
上层黄色组织？
4.吸取2倍体积的常温PBS用移液管吹打清洗
5.1000转/分离心5分钟
6.用移液管将下层的液体和沉淀的血污弃掉，保留上层黄色组织
7.吸取2倍体积的常温PBS用移液管吹打清洗
8.……反复重复以上操作3-4次，直至下层液体呈不浑浊，底部无血污（还是弃掉？），
保留上层组织
9.将组织用移液管移入无菌培养皿中，用剪刀将大块组织剪碎，将组织用吸管移入50ml
离心，加入与组织等体积的胶原酶（625U/ml）混匀后放入37℃孵箱，消化2h。
10.消化完将最上层颜色较深的油脂弃掉，注意保留组织，取与消化液等量终止液
（DMEM+10%NBS）终止消化，用弯头吸管吹打混匀数次，过100目筛网，收集滤液于离心管，1000转/分钟，离心5分钟。
11.弃上清，用培养液（α-MEM+10%NBS）重悬，根据沉淀多少接入培养瓶中（个人估计约
3E6/瓶），每瓶总液量8ml。
12.放入孵箱，24h天镜检，72或96h换液，之后隔天换液，培养12-14d传代。
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Medivet In House
Adipose Stem Cell Procedure Kit
Procedure Manual
脂肪干细胞套组
操作步骤
美联申德美联申德（（南通南通））进出口有限公司
操作要点
1. 所有操作步骤都要遵从无菌操作的原则，人员必须穿戴灭菌手套、口罩、头套
2. 开始进行操作之前，工作台必须先以70%酒精擦拭干净
3. 离心机的设定请遵守下列规范设定：Rotor →3, Acceleration →9和
Deceleration →1
4. 为避免离心机故障损坏，使用前请确保放置样本的离心管对侧，存有相同重量的离心管
5. 水浴槽请设定在37℃以及震荡设定钮设定到 3.5，而且使用前请提早预热20分钟
6. 使用前请确保药瓶与溶液混合均匀
注意事项
1. 脂肪干细胞增殖套组(ADIPOSE STEM CELL KIT)整盒需冷藏保存为宜
2. 其中药剂B液(vial B Medistem)特别需要冷冻保存
第一步骤‐ 准备富含血小板血浆(Platelet Rich Plasma, PRP)
(Platelet Rich Plasma, PRP) 富含血小板血浆含有大量的生长因子，而且取自于病患自身的血液，这些生长因子可以活化干细胞并且促进干细胞增殖。
操作如下：
1. 将三支ACD‐A试管装满5 ml血液，并且上下翻转混合8次。
2. 将试管以1000g (2500rpm)的条件离心4分钟。
3. 以微量滴管吸取三支试管的血浆层(上层)，置入15 ml试管中，吸取的过程中避免接近血
球层，每管可留下约5 mm高度的血浆，避免吸到血球。
4. 将装有血浆的15 ml试管放入离心机，以1000g (2500rpm)的条件离心8分钟，通常离心后
可见底部存有少量的血小板。
5. 以微量滴管将上层血浆抽出移除，留下约3 ml高度的血浆，接着将底层的血小板与剩下
的3 ml血浆混合均匀，这就是富含血小板血浆。
6. 以1 ml针筒抽取药剂G 0.5 ml，并加入富含血小板血浆之中，混合均匀。
经过大约5
– 15分钟活化后可见富含血小板血浆呈现果冻状。
当果冻状富含血小板血浆出现后，就可以暂时放置在室温中，若1 – 2小时后要使用富含血小板血浆时见到少量溶解，属于正常现象。
或者可放置在Medivet水浴槽37℃可加快活化作用。
第二步骤‐ 准备溶液
1. 以3 ml针筒，抽取2 ml注射用无菌蒸馏水加入药剂 B (vial B Medistem)，接着换新的针
筒抽取3 ml的药剂A(solution A)放入药剂B(solution B) ，混合均匀。
2. 以1 ml针筒，抽取0.5 ml的Gentamicin/Genoticin (40 mg/ml)放入药剂D (solution D)瓶中，
并且混合均匀。
3. 以10 ml针筒，抽取5.0ml的药剂D(solution D)放入药剂F(solution F)瓶，并且混合均匀。
第三步骤‐ 消化脂肪组织提取干细胞
1. 将脂肪组织放入灭菌样本瓶后，以灭菌尖剪刀剪碎脂肪组织剪至2 – 4 mm宽，此时脂
肪会呈现泥状。
2. 移除脂肪之外的其它组织，例如肌肉。
脂肪剪越碎，消化越好。
3. 将剪碎的脂肪组织倒入50 ml试管中。
4. 确认脂肪组织数量位于5 – 20 ml之间。
5. 以灭菌1 ml 针筒精准的抽取将药剂B 0.4 ml的溶液，抽取前先将药剂B先混合均匀。
6. 以3 ml 针筒抽取2.0 ml的药剂D放入脂肪组织瓶中。
7. 以20 ml 针筒抽取20ml 药剂A持续添加入脂肪组织试管中，加到40 ml高度。
8. 翻转试管，混合内容物，并且将试管放入已经预热到37℃的Medi‐bath水浴槽和震荡，震
荡设定钮设定3.5, 放置45分钟，每隔10 – 15分钟将试管取出翻转混合均匀一次。
9. 再以10 ml 针筒，抽取4.0 ml的药剂E(solution E)注入其中，并上下翻转混合均匀。
10. 在37℃的Medi‐bath水域槽震荡15分钟，但在7分钟时先取出试管混合均匀后再放回。
11. 将脂肪组织放入离心机，以350g (1500rpm)离心10分钟。
12. 离心后可见试管中的脂肪分为三层，上层为清澈黄色、中间层为白色纤维层、底层为细
胞沉淀的红色层(干细胞层)。
13. 将附件灭菌软管针接上10cc无菌针筒，沿着管壁缓缓伸入细胞沉淀的红色层，尽可能将
红色层抽取干净，但避免抽取到中间白色纤维层。
14. 接着将抽出的内容物放入新的50 ml试管中。
15. 以无菌操作的方式取出100um 无菌过滤器(SCNY000100)，旋转装置上并转紧在含有内
容物的试管上方。
16. 将上述装置完成的试管翻转，再装上新的50 ml试管。
此时内容物在上，新的试管在下，
中间隔着无菌过滤器。
17. 将手持真空泵管连接到无菌过滤器的连接口，使用泵产生真空，压力差会促使上层液经
过过滤器流到下层。
注意：使用真空泵的过程需记戴防护眼镜。
18. 过滤完成后，拆除过滤器与上层试管，将含有溶液的试管加盖。
19. 将含有溶液的试管以800g (2300rpm)离心10分钟。
20. 离心后，以吸管将“上层红色液体层吸出移除”，最后留下约1-3 ml的液体，避免抽取
到底部的细胞层。
21. 利用吸管抽吸将剩下的1-3 ml液体与细胞层重新混合均匀，不可有任何团块状。
22. 以20 ml针筒抽取20 ml的药剂F 加入试管
中，并混合均匀。
23. 将试管置入离心机以800g (2300rpm)离心10分钟。
24. 同样的，以吸管将“上层红色液体层吸出移除”，最后留下约1-3 ml的液体，避免抽取到
底部的细胞层，而且利用吸管将剩下的1-3 ml液体与细胞层重新混合均匀。
25. 用20 ml针筒抽取12 ml的药剂F加入试管中，上下翻转试管，混合均匀，不可有任何
团块状，若过程中见到透明或白色状纤维不必担心，下一个步骤就会去除。
26. 取出60um 无菌过滤器(SCNY00060)，旋转装置并转紧在含有内容物的试管上方，同样
将装置完成的试管翻转，再装上新的50 ml试管。
此时内容物在上，新的试管在下，中间隔着无菌过滤器。
27. 将真空泵管连接到无菌过滤器的连接口，使用泵产生真空，压力差会促使上层液经过过
滤器留到下层。
注意：使用真空泵的过程需配戴防护眼镜。
28. 将所有溶液抽出，放置在新15 ml试管中。
29. 将15 ml试管放入离心机，以800g (2300rpm)离心10分钟。
30. 用吸管“移除上层液“，避免抽取搅动底部的细胞层，留下约0.2 ‐ 0.5 ml的液体(约在
脂肪干细胞
细胞层上方5 mm高度的位置)。
即为最重要的脂肪干细胞
第四步骤-将PRP与脂肪干细胞混合并激化
1. 抽取少量的富含血小板血浆(RRP)溶解液，加入试管中，将容量添加到0.5 –
2.0 ml (至少
0.5 ml)。
添加量取决于要注射的关节数量，一个注射部位通常最多注射0.5 ml。
而且添加
的富含血小板血浆至少要等于或大于细胞液的量。
2. 重新将试管混合均匀。
微量吸管将细胞混合液移至2.0 ml 低温保存管(cryotube)。
3. 使用微量吸管
4. 将低温保存管置入Medi‐Light (LED灯)并激活20分钟。
5. 取出成品，可开始用于注射。
兽医师问题和答复：
1.针对关节冶疗如何使用呢？打一次多久后见效？可消炎止痛多久呢？
答：取得之2cc 干细胞其中1cc 点滴静脉注射，另1cc 可分成2~6份，分别为0.2~0.5cc 左
右注射到需治疗之关节腔及其周区，打入干细胞后3－4周明显见效。
维持时间依病情严
重度而不同，至少有9到12个月疗效才会渐渐减退，有些病例只需做一次即可长期有效。
2.小号脂肪干细胞套组(small kit)增殖后2cc 内共有多少干细胞数量呢？
答：见网站提供此信息，共至少有二亿个干细胞数量，为目前市面上培养法和增幅法中数量
最多的干细胞治疗产品。
3.若动物病况需要多点注射＇是否可改用大号套组(large kit)吗?可增殖多少细胞数目和cc 数呢？
答：你如果要用大的试剂组，你就要采50公克的脂肪，这样子的话当然采集到的干细胞数量
会比较多，不过当然也比较贵，这样想法确实是可以去推广的。
4.肾脏．肝脏．心脏冶疗如何使用呢？静脉注射即可或需加局部脏器注射呢？ 答：静脉注射即可，研究中还有更多的治疗方法和治疗目的。
动物干细胞治疗由2005年开始到今年2012年，治疗产殖已有2佰33万多美金
预计到2016年时，更高达近8佰50万美金，您还在等什么呢？
欢迎踊跃加入跨时代犬猫干细胞治疗！。