非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染实验操作指导书(银染) V1.0
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7．清洗用水尽量用高纯度去离子水，蒸馏水更佳，可以减少背景着色
8.1.2红色硅胶条应保持清洁，以保证良好的密封性。然后将玻璃板置于制胶夹上的红色硅胶条中心，轻推夹牢即可，无需下压（按压夹子时应轻柔）。
8.2制胶（6%）
8.2.130%聚丙烯酰胺（29:1）8ml,5*TBE，定容至40ml(每块胶约5ml),加过硫酸铵200ul，TEMED20ul,插入梳子。室温凝固，垂直向上轻轻拔出梳子。避免产生气泡。（若有气泡，用手轻轻弹几下玻璃板，赶尽气泡）
7.银染试剂
7.1固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1L。
7.2 0.4%硝酸银：硝酸银1克，水250ml。
7.3 1.5%氢氧化钠：氢氧化钠15克，水1L。
7.4 37%甲醛
8.非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备
8.1安装玻璃板夹心
8.1.1分别取内板（10cm*7.3cm）、外板（10cm*8.3cm）各一块（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），将内板置于外板夹条一侧，使内外玻板底部、两边齐平（否则需重新安装），置于玻璃夹中，将两边固定（夹子应夹在侧边条中央位置）。
5．仪器与器具
移液枪和枪头、脱色摇床、EP管、205ml锥形瓶、塑料盒、电泳仪、液：
丙烯酰胺：29g,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺：1g,加去离子水定容至100ml，装于棕色瓶内，4℃可保存两个月。
6.2．过硫酸铵0.1g/ml：称取过硫酸铵1g加去离子水值10ml。4℃可保存一周，-20℃可保存一个月。
6.3．TEMED(四甲基乙烯基二胺)：和过硫酸铵一起作为交联反应的催化剂。易吸潮，4℃封闭保存。
6.4. 5*TBE电泳缓冲液
分别称取54克Tris,27.5克硼酸，20ml0.5M/EDTA(pH=8.0)定容至1L
6.5.上样Loading Buffer
分别准确称量溴酚蓝和二甲苯青各0.1克，转入50ml容量瓶中（黏附在称量纸上的少量粉末可用移液器西区甲酰胺钟乳容量瓶中），再介入1mlEDTA，最后用甲酰胺定容至50ml。
品保部实验操作指导书
编号
版本
页码
3
制定
审核
批 准
主题
分析室样品检测指导书
编号
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染
1．目的：规范银染检测非变性聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质或DNA的测定方法与操作，特制定本规程。
2．范围：本规程适用于已知蛋白表达的测定。
3．责任：实验室检验人员对实施本规程负责。
4．实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。
10.银染
10.1.固定液固定10min。
10.2.水洗2min*3次
10.3.0.4%硝酸银100ml+37%甲醛100ul，混匀，避光染色30min。
10.4水洗3s*2次，动作要迅速。
10.5 1.5%氢氧化钠100ml，加37%甲醛1ml，混匀，显色至有条带出现。
10.6水洗若干次，终止显色。
8.2.2如制备好的凝胶长时间不用，需在梳孔中加入缓冲液，用保鲜膜包好，4℃保存。
9.样品处理
9.1根据样品性质选择加入Loading Buffer1:2，混匀（送检样品时，需专人专板并按要求填写上样单、摆放好样品）；
9.2若是DNA则放入PCR仪中95℃10min。时间到后立即放在碎冰上，冷却30min。若是蛋白质则放入电饭锅中沸水煮5min。上样（参照利用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白）。150V电压下电泳。
注意事项：
1．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。
2．甲醛在使用前加入。
3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。
4．显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。
5．银染液和显色液需要预冷。
6．所用器皿要很洁净，不用手直接接触，以免杂蛋白污染！
8.1.2红色硅胶条应保持清洁，以保证良好的密封性。然后将玻璃板置于制胶夹上的红色硅胶条中心，轻推夹牢即可，无需下压（按压夹子时应轻柔）。
8.2制胶（6%）
8.2.130%聚丙烯酰胺（29:1）8ml,5*TBE，定容至40ml(每块胶约5ml),加过硫酸铵200ul，TEMED20ul,插入梳子。室温凝固，垂直向上轻轻拔出梳子。避免产生气泡。（若有气泡，用手轻轻弹几下玻璃板，赶尽气泡）
7.银染试剂
7.1固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1L。
7.2 0.4%硝酸银：硝酸银1克，水250ml。
7.3 1.5%氢氧化钠：氢氧化钠15克，水1L。
7.4 37%甲醛
8.非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备
8.1安装玻璃板夹心
8.1.1分别取内板（10cm*7.3cm）、外板（10cm*8.3cm）各一块（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），将内板置于外板夹条一侧，使内外玻板底部、两边齐平（否则需重新安装），置于玻璃夹中，将两边固定（夹子应夹在侧边条中央位置）。
5．仪器与器具
移液枪和枪头、脱色摇床、EP管、205ml锥形瓶、塑料盒、电泳仪、液：
丙烯酰胺：29g,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺：1g,加去离子水定容至100ml，装于棕色瓶内，4℃可保存两个月。
6.2．过硫酸铵0.1g/ml：称取过硫酸铵1g加去离子水值10ml。4℃可保存一周，-20℃可保存一个月。
6.3．TEMED(四甲基乙烯基二胺)：和过硫酸铵一起作为交联反应的催化剂。易吸潮，4℃封闭保存。
6.4. 5*TBE电泳缓冲液
分别称取54克Tris,27.5克硼酸，20ml0.5M/EDTA(pH=8.0)定容至1L
6.5.上样Loading Buffer
分别准确称量溴酚蓝和二甲苯青各0.1克，转入50ml容量瓶中（黏附在称量纸上的少量粉末可用移液器西区甲酰胺钟乳容量瓶中），再介入1mlEDTA，最后用甲酰胺定容至50ml。
品保部实验操作指导书
编号
版本
页码
3
制定
审核
批 准
主题
分析室样品检测指导书
编号
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染
1．目的：规范银染检测非变性聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质或DNA的测定方法与操作，特制定本规程。
2．范围：本规程适用于已知蛋白表达的测定。
3．责任：实验室检验人员对实施本规程负责。
4．实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。
10.银染
10.1.固定液固定10min。
10.2.水洗2min*3次
10.3.0.4%硝酸银100ml+37%甲醛100ul，混匀，避光染色30min。
10.4水洗3s*2次，动作要迅速。
10.5 1.5%氢氧化钠100ml，加37%甲醛1ml，混匀，显色至有条带出现。
10.6水洗若干次，终止显色。
8.2.2如制备好的凝胶长时间不用，需在梳孔中加入缓冲液，用保鲜膜包好，4℃保存。
9.样品处理
9.1根据样品性质选择加入Loading Buffer1:2，混匀（送检样品时，需专人专板并按要求填写上样单、摆放好样品）；
9.2若是DNA则放入PCR仪中95℃10min。时间到后立即放在碎冰上，冷却30min。若是蛋白质则放入电饭锅中沸水煮5min。上样（参照利用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白）。150V电压下电泳。
注意事项：
1．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。
2．甲醛在使用前加入。
3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。
4．显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。
5．银染液和显色液需要预冷。
6．所用器皿要很洁净，不用手直接接触，以免杂蛋白污染！