农杆菌介导法
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。
二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。
共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。
三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。
2.植物幼苗。
（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。
取自无菌试管苗。
取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。
（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。
（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。
取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。
从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。
取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是一种重要的生物技术手段，被广泛应用于真菌基因工程研究和相关产业生产中。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术利用农杆菌Ti质粒中的T-DNA片段将外源基因导入真菌细胞内，使真菌细胞具有新的遗传特性。
近年来，随着生物技术的发展和研究的深入，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究取得了令人瞩目的进展。
一、根癌农杆菌介导的真菌遗传转化原理及方法1.构建适合真菌的质粒载体，将外源基因插入T-DNA载体中，构建成适合真菌遗传转化的质粒载体。
2.将构建好的质粒载体通过农杆菌进行转化，使其含有T-DNA片段。
3.利用农杆菌与真菌细胞的接触，将质粒中的T-DNA片段导入真菌细胞内。
4.筛选和鉴定转化后的真菌株系，确认外源基因是否成功导入真菌细胞中，并对转化菌株进行鉴定和分离纯化。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术在农业生产中有着广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：1. 抗病力提高：根癌农杆菌介导的真菌遗传转化可以实现真菌对病原菌的抗性提高，使植物在生长过程中更加健康，减少病害发生的可能性。
2. 产量增加：通过真菌遗传转化技术可以使真菌获得更好的生长特性和代谢特性，从而提高作物产量。
3. 抗逆性提高：真菌经过遗传改造后，可能对环境中的逆境条件具有更强的抵抗能力，使植物更加适应不良环境的生长条件。
4. 品质改进：真菌遗传转化技术还可以用于改进植物的品质，比如提高农作物的风味、口感等。
1. 药物生产：利用真菌遗传转化技术可以大规模生产生物药物，比如抗生素、激素等，在生物医药领域有着重要的应用。
2. 新药研发：真菌遗传转化技术可以用于研发新的药物，通过改造真菌代谢途径等方式，获得新型的生物活性化合物。
3. 医学研究：真菌遗传转化技术也可以用于医学研究领域，比如用于疾病的基因治疗、蛋白质表达等。
1. 技术改进：研究者不断优化根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术，提高转化效率和稳定性，为真菌的遗传改造提供更好的手段。
发根农杆菌介导的原理
发根农杆菌介导的原理发根农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤中常见的细菌，它具有突出的农业和生物技术应用潜力。
其主要特点是能够通过转座子（T-DNA）在植物细胞中插入外来基因，从而导致植物基因组的改变，进而实现基因工程研究和农业生产中的目标。
发根农杆菌介导的原理主要包括以下几个步骤：感知、转送、整合和表达。
首先，发根农杆菌通过感知植物寄主释放的信号物质，如根尖分泌的黄酮类化合物等，刺激其由游走态变为感染态。
这种感染态的农杆菌通过菌长的分裂和导向运动，定位并寻找到适合感染的植物细胞。
然后，农杆菌利用其菌体表面的一种称为T形胞器（T-pilus）的纤毛结构来与植物细胞发生物理接触。
这一接触后，细菌病原体释放一种羧酸感应蛋白（VirA）来感应植物信号，从而激活另一种蛋白质VirG。
VirG激活后，会诱导细菌病原体转录出一组称为Vir基因的透过激素（opine）类基因。
在接触并感应植物信号之后，发根农杆菌开始将其特有的Ti质体（tumor-inducing plasmid）插入到植物细胞中。
Ti质体是一种环状不稳定的DNA结构，其中含有T-DNA片段和一些辅助基因，如辅助合成植物激素的基因、抗生素抗性基因等。
这些辅助基因的存在有助于部分研究，但在基因工程中往往被删除以减小对植物基因组的影响。
最后，T-DNA片段与发根农杆菌质体DNA经由Vir蛋白复合物共运输进入植物细胞质内，然后通过核孔运输至植物细胞核中。
一旦到达细胞核，T-DNA片段会被整合进植物基因组中的染色体DNA或质体DNA中，此过程称为整合。
整合的T-DNA片段携带的外来基因在植物基因组中以遗传方式传递给下一代细胞。
实际上，发根农杆菌感染的结果对植物有很大的多样性。
当T-DNA的插入位置不幸地落在植物编码基因上，往往会导致基因不稳定、突变、失活等不可预测的结果。
然而，在合适的条件下，这种插入可以实现对植物的有益改造，例如抗病性、抗虫性、耐逆性等。
20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)
1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。
转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。
1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。
◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。
◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。
◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。
1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。
植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。
原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。
多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。
根癌农杆菌介导法原理
根癌农杆菌介导法原理引言根癌农杆菌介导法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物遗传工程领域。
它利用植物根癌农杆菌接触感染时产生的植物激素和DNA导入技术，将外源基因导入植物细胞，实现对植物基因组的改造。
本文将全面、详细、完整地探讨根癌农杆菌介导法的原理、应用以及优缺点。
根癌农杆菌的特点1. 根癌农杆菌简介根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 是一种通过植物接触感染的土壤细菌，在植物遗传工程研究中具有重要的应用价值。
它能够将其自身的T-DNA（转座子DNA）片段导入植物细胞，并在植物细胞中稳定表达。
2. 根癌农杆菌的感染机制根癌农杆菌感染植物的过程包括以下几个步骤：1.识别和结合：根癌农杆菌通过识别植物伤口释放的酚类化合物，结合到植物细胞表面。
2.感染透入：根癌农杆菌产生的信号分子诱导植物细胞产生细胞壁降解酶，使其自身进入植物细胞。
3.T-DNA转移：根癌农杆菌通过特殊的转移螺旋（vir蛋白）将T-DNA从细菌自身转移到植物细胞中。
4.T-DNA整合：转移的T-DNA片段在植物细胞染色体上整合，并导致植物细胞的遗传改变。
根癌农杆菌介导法原理根癌农杆菌介导法利用根癌农杆菌的感染机制，将外源基因导入植物细胞，从而实现对植物基因组的改造。
1. 构建适合的转化载体在根癌农杆菌介导法中，首先需要构建适合的转化载体。
转化载体通常包括以下几个重要组成部分：•T-DNA：携带待转化的外源基因片段。
•选择标记基因：用于筛选转化成功的植物细胞。
•根癌农杆菌起始核酸序列（ori）：用于在根癌农杆菌中复制转化载体。
2. 根癌农杆菌感染植物将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，然后让根癌农杆菌感染植物组织。
通常可以通过以下步骤实现：•制备根癌农杆菌感染液：将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，培养至菌体达到一定浓度。
•植物组织处理：将待转化的植物组织浸泡在根癌农杆菌感染液中，利用真空处理或共振法促使菌体进入植物细胞。
农杆菌介导的转化方法知识分享
存在于能引起植物形成冠瘿瘤的农杆菌中，诱导双子 叶冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmivirD、virB…
第四步 T-DNA转移
T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞 核里，整合到植物基因组中。 第五步 诱导冠瘿瘤
T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和 细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。
第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。
④农杆菌转化的方法
1、共培养法
包括原生质体共培养、悬浮细胞共培养和愈伤组织共培养。
2、叶圆盘法 3、活体接种法
1.共培养法
The co-integration method
2.叶盘转化法
农杆菌共培养侵染 愈伤组织 分化生芽 生根
3. 活 体 接 种 法
植物组织培养：第十三章 植物遗传转化
• 接种时所用菌液浓度和侵染时间 是影响转基因植株再生的关键因素 之一。
• 共培养：接种菌体后的外植体培养 在诱导愈伤组织或不定芽固体培养基 上，在外植体细胞分裂、生长的同时， 农杆菌在外植体切口面也增殖生长， 两者共同培养的过程称为～。
• Horsch等(1985)首创叶盘法，用根 癌农杆菌感染烟草叶片外植体，获得 了转基因烟草。
（一）生物学特性与转 化原理
1.生物学特性
• 根癌农杆菌将Ti质粒的DNA片 段、发根农杆菌将Ri质粒的DNA 片段导入植物细胞的基因组中，导 致植物发生冠瘿瘤和毛状根。
• 根据携带不同Ti质粒的根癌农杆 菌诱导的冠瘿瘤所产生的冠瘿碱类 型，将根癌农杆菌分为章鱼碱型、 胭脂碱型和农杆碱型三种根癌农杆 菌。
一、农杆菌介导法
• Ackermann(1977)，Wullems等 (1981)，De Greve等(1982)和Spano 等(1982)首先在烟草和马铃薯中由Ri质 粒和Ti质粒转化的细胞再生出植株。
• Zambryski等(1983)和De Block等 (1984)以及Horsch等(1985)分别报道 了用切去癌基因的根癌农杆菌和发根 农杆菌进行遗传转化，获得了形态正 常的转基因植物。
第十三章 植物遗传转化
• 植物遗传转化（plant genetic transformation）：是指将外源基因 转移到植物体内并稳定地整合表达与 遗传的过程。
• 农杆菌介导法、基因枪法、植株原 位真空渗入法、电击法、聚已二醇法、 花粉管通道法、显微注射法、激光微 束法、超声波法、生殖细胞浸泡法、 脂质体法
（5） Vir区基因的活化
• 大多数双子叶植物受伤后，植物 细胞会分泌某些酚类化合物，这些 酚类化合物可诱导Vir区基因活化， 使农杆菌转化成为可能。
农杆菌介导的水稻转化
农杆菌介导的水稻转化实验目的学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。
实验原理随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。
水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。
DNA直接导入法主要包括PEG（polyethylene glycol）介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。
其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。
基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大（上限是16-20kb），转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。
同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定（一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合），整合的外源基因基本上保持其结构的完整性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。
所以已成为转化单子叶植物的首选方法。
一、目标基因对农杆菌的转化1.1农杆菌感受态细胞的制备1.取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线，28℃黑暗培养。
2.挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16小时。
3.取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600=0.5。
农杆菌介导法
农杆菌介导法实验九植物遗传转化——农杆菌介导法⼀、⽬的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化⽔稻的技术⼆、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能⼒。
下列因⼦与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的⼀段DNA序列。
T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作⽤元件。
不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。
置于该边界内的任何外源基因均可被转化。
LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能⼒丧失，这时⼏乎完全没有T-DNA的转移。
LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵⼦转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。
其中蛋⽩VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强⼦；VirD2在T-DNA底链起内切酶作⽤造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋⽩，有2个NLS。
该操纵⼦的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋⽩→VirA被植物创伤信号分⼦激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。
3. 农杆菌染⾊体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋⽩、趋化性）、pscA、att、cel（合成纤维素丝，附着）。
一种适用于多种植物的农杆菌介导基因瞬时表达的方法
随着科学技术的不断发展，人类对植物基因研究的需求也日益增加。
而农杆菌介导的基因瞬时表达方法则成为了植物基因研究领域的热门话题之一。
本文将围绕这一主题展开讨论。
一、农杆菌介导的基因瞬时表达方法简介农杆菌介导的基因瞬时表达方法是一种将外源基因导入植物细胞中并在短时间内表达的技术。
其原理是利用土壤中常见的植物致病菌——农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）来传递外源基因，使其经由农杆菌转座子插入到植物细胞的基因组中，从而实现目的基因的表达。
二、农杆菌介导的基因瞬时表达方法的优势1. 高效性：农杆菌介导的基因瞬时表达方法能够在短时间内使目的基因得到高效表达，为研究人员提供了更快捷、高效的研究手段。
2. 适用范围广：农杆菌介导的基因瞬时表达方法不仅适用于单一植物种类，还适用于多种植物，包括但不限于拟南芥、烟草、水稻等。
3. 可操作性强：相比于稳定转化方法，农杆菌介导的基因瞬时表达方法不需要等待植株成熟，而是直接在植物叶片上进行操作，省时省力。
三、农杆菌介导的基因瞬时表达方法的研究现状目前，科研人员对农杆菌介导的基因瞬时表达方法进行了大量探索与研究，不断优化该技术并拓展其应用范围。
通过改变农杆菌株系、转染条件、辅助基因等因素，有效提高了基因转化效率，并使其更适用于不同植物。
四、农杆菌介导的基因瞬时表达方法的应用前景随着生命科学领域的不断发展，对植物基因研究的需求逐渐增加，而农杆菌介导的基因瞬时表达方法正是满足这一需求的重要手段。
未来，该方法有望在植物遗传改良、抗病株培育、蛋白表达等方面发挥更为广泛的作用。
五、结语农杆菌介导的基因瞬时表达方法作为一种重要的植物基因研究技术，其独特的优势和潜在的应用前景吸引着越来越多的研究人员投入到相关领域的研究中。
随着技术的不断完善和发展，相信农杆菌介导的基因瞬时表达方法一定会为植物基因研究领域注入新的活力，为人类农业生产和生态环境的改善带来新的希望。
农杆菌介导的基因瞬时表达方法在植物基因研究领域中具有广阔的应用前景，其高效性和适用范围广的特点使其成为研究人员们研究植物基因功能和调控的重要工具。
农杆菌介导转化法的概述
农杆菌介导转化法的概述农杆菌介导转化（Agrobacterium-mediated transformation）是一种常用的转基因技术方法，用于将外源基因导入目标植物的基因组中。
该方法利用一种土壤细菌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens或Agrobacterium rhizogenes）作为载体，将目标基因转移到植物细胞中。
农杆菌介导转化法具有高效、广谱、可逆和整合性等特点，因此被广泛应用于农业和植物基因工程研究中。
2.转化农杆菌：将农杆菌和构造体进行共转化。
这个步骤需要确保构造体能够稳定地进入到农杆菌的细胞质中，并且能够被菌体所拷贝。
一般使用电击法、化学法或冷冻法来完成这个步骤。
3.培养农杆菌：将转化后的农杆菌分别培养在选择性培养基上，以筛选出带有目标基因的菌落。
4.感染植物：通过注射或浸渍等方式将培养得到的农杆菌菌体引入植物的组织或细胞中。
农杆菌会通过分泌细菌素（也称为转化素）的方式进入植物细胞，并在转化素环境下将目标基因导入到植物基因组中。
5.再生转化植株：利用组织培养方法，将含有目标基因的植物细胞培养至完整植株。
这个步骤需要将转化素与细胞分裂激素配比得当，以促进细胞分裂和组织再生。
6.筛选转化株：利用选择标记基因识别并筛选出携带目标基因的转化株。
一般使用抗生素选择法或草酮酸合酶标记法进行筛选。
7. 鉴定转化株：对筛选出的转化株进行鉴定，确认目标基因已经整合到植物基因组中。
一般利用PCR、Southern blot或Northern blot等方法进行鉴定。
通过以上步骤，农杆菌介导转化法可以实现将外源基因导入目标植物中，从而改变植物的性状或增强植物对生物胁迫的抗性。
该方法已经广泛应用于农作物的育种研究以及植物的分子生物学研究中。
农杆菌介导转化方法
农杆菌介导转化方法农杆菌介导转化方法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物、微生物等领域。
本文将介绍农杆菌介导转化方法的原理、步骤和应用。
一、原理农杆菌介导转化方法是利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因导入目标细胞中的一种方法。
农杆菌是一种自然界广泛存在的土壤细菌，它能将其自身的DNA转移到植物细胞中，从而导致植物发生病理性变化。
利用这一特性，科学家将目标基因插入到农杆菌的载体DNA中，通过农杆菌的感染作用，将目标基因导入到目标细胞中。
二、步骤农杆菌介导转化方法通常包括以下几个步骤：1. 农杆菌培养：首先需要将含有目标基因的农杆菌培养至适宜的生长期，以保证其感染能力。
2. 植物处理：将目标植物的组织经过表面消毒处理，然后将其切割成小片或小块，以增加接触面积。
3. 农杆菌感染：将培养好的农杆菌与植物组织接触，使其感染植物细胞。
通常使用浸泡法或注射法进行感染。
4. 抗生素筛选：在感染后的组织中加入适当浓度的抗生素，以筛选转化成功的细胞。
只有携带目标基因的细胞才能够存活下来。
5. 培养和再生：将筛选出的转化细胞进行培养和再生，形成转基因植株。
三、应用农杆菌介导转化方法已成功应用于多种植物和微生物中，具有以下几个优点：1. 高效性：农杆菌介导转化方法可以在较短时间内实现大量基因转化，且转化效率较高。
2. 转基因稳定性：通过农杆菌介导转化方法获得的转基因植株通常具有较高的遗传稳定性，能够稳定地传递给下一代。
3. 广泛适用性：农杆菌介导转化方法适用于多种植物和微生物，包括农作物、果树、花卉等。
可以用于改良作物的品种、抗病性、耐逆性等性状。
4. 无需种子：与传统的植物遗传改良方法相比，农杆菌介导转化方法无需使用种子，能够直接利用植物的组织进行转化，节约了时间和资源。
5. 无需外界辅助：农杆菌介导转化方法不需要借助特殊设备或昂贵试剂，只需在实验室条件下进行即可。
简述利用农杆菌介导法进行植物基因转化的具体流程。
简述利用农杆菌介导法进行植物基因转化的具体流程。
农杆菌介导法是植物基因转化的一种常用方法，它可以用来对植物的叶片中的基因进行改造，从而达到特殊的种质调节和植物改良的目的。
因此，农杆菌介导法在植物基因工程方面也被广泛应用。
本文将简要介绍农杆菌介导法在植物基因转化中的具体流程。
首先，在进行植物基因转化前，需要先确定基因转移的植物物种。
之后，选择合适的农杆菌质粒，将其与基因构建物一起转入到培养基中，扩增得到足够的农杆菌质粒。
经过离心，将质粒晶态中的质粒提取出来，并根据需要稀释到合适的浓度。
之后，进行农杆菌感受体添加，使释放的农杆菌质粒可以被农杆菌感受到。
质粒的稀释液可以直接穿透植物叶子表皮，被植物体内的细胞吸收，实现基因的转染。
接着，农杆菌介导法需要利用农杆菌来筛选需要转化的植物。
首先，将植物叶片接种到农杆菌悬液中，当植物细胞被农杆菌侵入后，就可以在植物体内转化基因了。
之后，利用选择和筛选培养基及含有抗性抗生素的培养基筛选出能够识别抗病酶基因的植物，从而筛选出被转染的植物。
最后，进行植物的遗传分析，以确定最终被转换的植物株系。
通过PCR方法检测植物转化后的基因组，将最终转化出来的植物株系与未转化的植物进行对比，从而得出植物基因转化的结果。
综上所述，农杆菌介导法是一种常用的植物基因转化技术，它将植物叶片中的基因经过转染后，可以得到想要的基因效应。
此方法简单易行，可有效解决植物基因转化的难题。
农杆菌介导转化法的概述完整版
农杆菌介导转化法的概述完整版农杆菌介导转化法（Agrobacterium-mediated transformation）是生物技术领域中常用的一种基因转化技术，它是利用植物病原细菌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens 或 Agrobacterium rhizogenes）在哺乳动物细胞和植物细胞之间转移DNA的过程.Ti质粒在不同的农杆菌株中具有普遍性，主要包含两个部分，一部分是右边界（RB）和左边界（LB）之间的T-DNA区域，另一部分是辅助基因的区域。
T-DNA区域是真正起作用的区域，它包含多个基因，其中最重要的是含有颠倒重复序列的两个直接重复序列（Direct Repeat，DR）以及插入块（Insert）。
在农杆菌内部，T-DNA区域通过辅助基因的编码产物，如细菌激素合成生物合成酶（enzymes），被剪切出来。
剪切后的T-DNA区域携带着颠倒重复序列的两个直接重复序列（DR），与全身黑素瘤疫斑细菌的Direct Repeat（DR）高度相似，它作为单链向外产生（unidirectional）的。
Ti质粒上还存在两个移去片段（Removal Sequences）的辅助基因，它们能够结合T-DNA的两个断点，从而使T-DNA脱离质粒。
1.选择合适的农杆菌菌株：选择具有较高转化效率且对目标植物亲和性强的农杆菌株。
2.制备适宜的载体：选择合适的Ti质粒载体，可根据需要进行修饰和改造，添加目标基因、标记基因和选择基因等。
3.构建转化质粒：将目标基因和其它所需基因与农杆菌Ti质粒进行重组，得到构建好的转化质粒。
4.培养农杆菌：将重组后的质粒转化到农杆菌中，然后利用适宜的培养基进行培养和增殖，以形成菌液。
5.感染植物细胞：将培养好的农杆菌菌液与目标植物细胞接触，通过创伤组织或利用组织培养等方式实现细菌进入植物细胞内部。
6.培养转化物：将感染的组织培养在适宜的培养基上，培养一段时间，以使转化进行进一步发展，形成完整的植株。
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农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究A Highly Efficient Agrobacterium - mediated Rice Transformation Method
水稻是基因组研究的模式植物 ,近年来水稻基因组研究取得了很大进展 ,构建了遗传图谱和物理图
谱 ,完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测2 - 3序 ,以及第 1 号和第 4 号染色体的精细测4 - 5序 ,并对第 10 号染色体的结构进行了详细分析。
在此基础上 ,各实验室大规模地 ,系统地进行水稻功能基因研究 ,普遍采用的研究手段是基因标签技术。
基因标签技术包括 T - DNA 和转座子标签 ,创建大量的基因标签体是功能基因研究的材料平台。
而根癌农杆菌介导的水稻遗传转化是水稻基因标签技术中的重要步骤之一。
本研究完善了根癌农杆菌介导的水稻转化方法 ,以期为水稻功能基因研究提供丰富材料 , 为水稻重要农艺性状的改良开辟途径。
1材料
以水稻品种日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica)为试验材料。
菌株类型为 EHA105 超毒力菌株 ,载体为增强子捕获载体 pFX- E24. 2 - 15R(见图 1) ,载体上带有 GUS报告基因、35 S的 CaMV 启动子序列和潮霉素选择标记基因(HYG) 。
农杆菌菌株为EHA105。
2方法
2.1水稻愈伤组织的诱导诱导方法参照 HIEI7等。
将日本晴水稻种子去壳 ,用 75 %乙醇灭菌 5min ,再用2. 5 %的次氯酸钠灭菌处理不同时间(40min ,37 min ,30 min 和 25 min) ,以确定最佳灭菌时间 ,灭菌后用无菌水冲洗 6～8 次 ,于 MS 固体培养基上28 ℃避光培养 ,30 d 后 ,将愈伤组织进行继代培
养 ,得到胚性愈伤组织。
2.2农杆菌转化愈伤组织用 AB 固体培养基+氯霉素 25 mg/L + 利福平 20 mg/L + AS 20 mg/L培养农杆菌 ,在20 ℃下培养5～6 d。
用无菌勺子轻轻刮下培养的农杆菌 ,放入 AAM液体培养基中(加有2 mg/L 2 ,4
- D ,0.7 g/L 脯氨酸 ,20 mg/L AS) ,在80 rpm/min ,27 ℃下 ,摇荡培养 4 h。
将挑好的胚性愈伤组织放入锥形瓶 ,菌液倒入另一锥形瓶中 ,并加入AAM培养基( +AS50 mg/L) ,分别调节OD600值至不同数值(0. 120、0. 145、0. 158、0. 190、0. 195) ,以确定最佳的发杆菌浓度。
然后将菌液倒入愈伤组织中 ,用手轻摇 ,感染 15 min。
再吸干菌液 ,将愈伤组织放入装有滤纸的培养皿中干燥 ,移至共培养基上27 ℃下共培养3～4 d。
2.3转化体的获得将共培养的愈伤组织转出 ,无菌水漂洗 3～4 次 ,再用 NB 培养基 + 50 mg/L 头孢霉素在室温下100 rpm摇洗1～2 h ,洗2 遍后吸干放在滤纸上。
将吸干的愈伤组织转入 N6 选择培养基上( + 50 mg/L 潮霉素 + 500 mg/L 头孢霉素) ,27℃下暗培养20 d后 ,继代一次。
将新长出的抗性愈伤组织转移到N6 预分化培养基上 ,28 ℃下 ,暗培养7 d。
将抗性愈伤组织转移到 N6 分化培养基上 ,28下 ,光照12 h/ d ,培养2～3 周后 ,新鲜愈伤组织将有绿点出现 ,每2 周继代一次 ,待分化出完整小苗后转入壮苗培养基MS中。
炼苗并移栽。
2.4 GUS染色分析参照Jefferson 的方法 ,切取 T0 代转化体的叶片、种子等器官进行染色 ,在 37℃下反应 12～16 h ,弃去染色液 ,用 95 %的酒精脱色 ,在解剖显微镜下观察拍照。
染色液组成为 50mM的磷酸钠盐缓冲液 ,pH7. 0 ,10 mMEDTA ,0. 1 %TritonX- 100 ,1 mg/ml 的 X - Gluc ,0. 1 mM 铁氰化钾 ,0.1 mM亚铁氰化钾 ,20 %甲醇。
3结果与分析
3.1不同灭菌时间对愈伤诱导率的影响灭菌是转化成功的关键技术之一 ,既要保证灭菌彻底 ,又不能影响种子萌发和产生愈伤。
用2.5 %次氯酸钠对200 粒种子分别处理 40 min、37 min、30min和25 min ,
结果表明 ,随着灭菌时间的增加 ,愈伤诱导率呈下降趋势。
灭菌 40 min 时 ,愈伤诱导率仅为77 %,大部分种子不能萌发 ,推测可能是胚已被到灭菌效果 ,次氯酸钠对种子萌发无影响 ,种子萌发力强 ,但是由于萌发消耗了很多养分 ,反而部分抑制了愈伤组织的生长 ,故其愈伤诱导率为96.3 %,反而低于灭菌30 min 时的愈伤诱导率 97.3 %。
而且 ,灭菌40 min 和 37 min 时 ,形成的愈伤颗粒比较小 ,侵染时易于褐死 ,不利于转化 ,而灭菌 30 min 时的愈伤颗粒大小在 3 mm左右 ,适合于转化 ,且诱导率最高。
因此 ,2. 5 %次氯酸钠的最适灭菌时间为 30min。
3.2愈伤组织的继代培养时间对转化率的影响愈伤组织经过多代培养后 ,会产生体细胞突变 ,不利于转化体的筛选。
同时 ,多代培养后 ,愈伤组织逐渐衰老死亡 ,将大大降低转化效率。
但是传统的方法直接用诱导的愈伤来转化 ,也会降低转化效率 ,这可能是细胞的周期状态影响了转化效率 ,有报道认为当愈伤组织细胞处于细胞周期 S时期和 G2 周9期的比例高时转化效率最高 ,而且 S 期是细胞DNA复制期 ,此时转化有利于 T- 链转变成双链 ,增加稳定整合和遗传。
所以经过适当的继代培养 ,可以使细胞处于转化最佳状态而提高转化效率。
本实验通过观察 ,经继代培养后的愈伤组织表面光滑 ,质地致密 ,粒形好 ,继代
培养 6～7 d 时转化率最高。
培养时间太短 ,愈伤组织表面粗糙 ,粒小 ,不利于转化;培养时间过长则愈伤组织变软 ,发粘 ,转化后易褐化死亡。
3.3农杆菌浓度对转化效率的影响农杆菌浓度直接影响到转化效率。
农杆菌浓度太低时 ,每个愈伤组织块产生的抗性愈伤数极少 ,大部分不产生抗性愈伤;浓度太高 ,则愈伤组织很容易被过度侵染 ,共培养后
无法恢复活力 ,在进行选择培养时 ,大多数会褐化死亡。
本研究用不同 OD 值的农杆菌菌液分别处理生长状况良好一致的 300 个愈伤组织 ,发现当OD600值为 0.145～0.190 时 ,转化效率基本保持在 79 %左右 ,当 OD600值低于 0. 145 时 ,转化率较低 ,超过 0. 190 时 ,愈伤死亡数量增多 ,并且选择培养时 ,因过多的农杆菌覆盖在抗性愈伤组织上 ,抑制了其生长。
4 结论与讨论
农杆菌转化效率的影响因子包括菌株类型、水稻基因类型、培养基成分组成、组织培养条件等。
笔者通过对日本晴水稻转化条件的研究 ,发现在日本晴的转化过程中 ,当种子灭菌30 min时 ,愈伤的诱导率最高 ,继代培养 6～7 d后的转化率最高 ,菌浓度 OD600值为 0. 145～0. 190时 ,转化效率高。
另外 ,试验还发现在分化培养时 ,黑暗条件下预培养7 d的可以大大减少愈伤组织的褐化程度 ,分化效率达到
85 %。
优化后转化体系大大减少了组织培养时间 ,3 个月即可获得转化植株 ,不但节省成本 ,而且减少由于组培而激活 Tos17 等水稻内源转座子从而造成体细胞突变的频率。
农杆菌介导的基因转化技术已经很成熟 ,但是要适应高通量的水稻基因组研究 ,快速完成 T -DNA插入饱和突变体的创制 ,需要大大提高抗性愈伤组织的分化效率。
传统转化技术将转化后的愈伤组织直接放在同一培养基上进行分化与选择培养 ,容易造成愈伤组织因褐化而抑制分化。
因为选择培养基中含有的高浓度抗生素使未转化的愈伤组织褐化而产生酚类等有毒物质 ,抑制了抗性愈伤组织的生长和分化。
有人对传统转化方法进行初步改进 ,把抗性愈伤组织单独放在含有抗生素的分化培养基上培养 ,但是由于抗生素的影响以及分化培养基中的ABA等见光分解 ,结果直接影响了分化效果。
笔者在此基础上做了进一步的改进 ,将选择培养基上的抗性愈伤组织转到分化培养基上 ,然后放置在黑暗下培养 7 d ,再转到新的分化培养基上光照下培养 ,只需 10 d 左右就能分化成苗 ,分化效率可达85 %。
该方法的优点在于使 ABA 在黑暗下充分发挥作用 ,促使愈伤组织很好的转入分化生理状态 ,再进行光照以提供能量进行分化。
而且由于该方法减少了培养时间 ,也就降低了组织培养造成的体细胞突变的概率。
本实验的GUS染色分析显示,GUS基因已在水稻的叶片,根,颖壳,种皮,胚及胚乳各个部位表达,
染色阳性率达到30 %,表明T- DNA 已经稳定整合到水稻基因组中。