农杆菌介导法

农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究A Highly Efficient Agrobacterium - mediated Rice Transformation Method

水稻是基因组研究的模式植物 ,近年来水稻基因组研究取得了很大进展 ,构建了遗传图谱和物理图

谱 ,完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测2 - 3序 ,以及第 1 号和第 4 号染色体的精细测4 - 5序 ,并对第 10 号染色体的结构进行了详细分析。在此基础上 ,各实验室大规模地 ,系统地进行水稻功能基因研究 ,普遍采用的研究手段是基因标签技术。基因标签技术包括 T - DNA 和转座子标签 ,创建大量的基因标签体是功能基因研究的材料平台。而根癌农杆菌介导的水稻遗传转化是水稻基因标签技术中的重要步骤之一。本研究完善了根癌农杆菌介导的水稻转化方法 ,以期为水稻功能基因研究提供丰富材料 , 为水稻重要农艺性状的改良开辟途径。

1材料

以水稻品种日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica)为试验材料。菌株类型为 EHA105 超毒力菌株 ,载体为增强子捕获载体 pFX- E24. 2 - 15R(见图 1) ,载体上带有 GUS报告基因、35 S的 CaMV 启动子序列和潮霉素选择标记基因(HYG) 。农杆菌菌株为EHA105。

2方法

2.1水稻愈伤组织的诱导诱导方法参照 HIEI7等。将日本晴水稻种子去壳 ,用 75 %乙醇灭菌 5min ,再用2. 5 %的次氯酸钠灭菌处理不同时间(40min ,37 min ,30 min 和 25 min) ,以确定最佳灭菌时间 ,灭菌后用无菌水冲洗 6～8 次 ,于 MS 固体培养基上28 ℃避光培养 ,30 d 后 ,将愈伤组织进行继代培

养 ,得到胚性愈伤组织。

2.2农杆菌转化愈伤组织用 AB 固体培养基+氯霉素 25 mg/L + 利福平 20 mg/L + AS 20 mg/L培养农杆菌 ,在20 ℃下培养5～6 d。用无菌勺子轻轻刮下培养的农杆菌 ,放入 AAM液体培养基中(加有2 mg/L 2 ,4

- D ,0.7 g/L 脯氨酸 ,20 mg/L AS) ,在80 rpm/min ,27 ℃下 ,摇荡培养 4 h。将挑好的胚性愈伤组织放入锥形瓶 ,菌液倒入另一锥形瓶中 ,并加入AAM培养基( +AS50 mg/L) ,分别调节OD600值至不同数值(0. 120、0. 145、0. 158、0. 190、0. 195) ,以确定最佳的发杆菌浓度。然后将菌液倒入愈伤组织中 ,用手轻摇 ,感染 15 min。再吸干菌液 ,将愈伤组织放入装有滤纸的培养皿中干燥 ,移至共培养基上27 ℃下共培养3～4 d。

2.3转化体的获得将共培养的愈伤组织转出 ,无菌水漂洗 3～4 次 ,再用 NB 培养基 + 50 mg/L 头孢霉素在室温下100 rpm摇洗1～2 h ,洗2 遍后吸干放在滤纸上。将吸干的愈伤组织转入 N6 选择培养基上( + 50 mg/L 潮霉素 + 500 mg/L 头孢霉素) ,27℃下暗培养20 d后 ,继代一次。将新长出的抗性愈伤组织转移到N6 预分化培养基上 ,28 ℃下 ,暗培养7 d。将抗性愈伤组织转移到 N6 分化培养基上 ,28下 ,光照12 h/ d ,培养2～3 周后 ,新鲜愈伤组织将有绿点出现 ,每2 周继代一次 ,待分化出完整小苗后转入壮苗培养基MS中。炼苗并移栽。

2.4 GUS染色分析参照Jefferson 的方法 ,切取 T0 代转化体的叶片、种子等器官进行染色 ,在 37℃下反应 12～16 h ,弃去染色液 ,用 95 %的酒精脱色 ,在解剖显微镜下观察拍照。染色液组成为 50mM的磷酸钠盐缓冲液 ,pH7. 0 ,10 mMEDTA ,0. 1 %TritonX- 100 ,1 mg/ml 的 X - Gluc ,0. 1 mM 铁氰化钾 ,0.1 mM亚铁氰化钾 ,20 %甲醇。

3结果与分析

3.1不同灭菌时间对愈伤诱导率的影响灭菌是转化成功的关键技术之一 ,既要保证灭菌彻底 ,又不能影响种子萌发和产生愈伤。用2.5 %次氯酸钠对200 粒种子分别处理 40 min、37 min、30min和25 min ,

结果表明 ,随着灭菌时间的增加 ,愈伤诱导率呈下降趋势。灭菌 40 min 时 ,愈伤诱导率仅为77 %,大部分种子不能萌发 ,推测可能是胚已被到灭菌效果 ,次氯酸钠对种子萌发无影响 ,种子萌发力强 ,但是由于萌发消耗了很多养分 ,反而部分抑制了愈伤组织的生长 ,故其愈伤诱导率为96.3 %,反而低于灭菌30 min 时的愈伤诱导率 97.3 %。而且 ,灭菌40 min 和 37 min 时 ,形成的愈伤颗粒比较小 ,侵染时易于褐死 ,不利于转化 ,而灭菌 30 min 时的愈伤颗粒大小在 3 mm左右 ,适合于转化 ,且诱导率最高。因此 ,2. 5 %次氯酸钠的最适灭菌时间为 30min。

3.2愈伤组织的继代培养时间对转化率的影响愈伤组织经过多代培养后 ,会产生体细胞突变 ,不利于转化体的筛选。同时 ,多代培养后 ,愈伤组织逐渐衰老死亡 ,将大大降低转化效率。但是传统的方法直接用诱导的愈伤来转化 ,也会降低转化效率 ,这可能是细胞的周期状态影响了转化效率 ,有报道认为当愈伤组织细胞处于细胞周期 S时期和 G2 周9期的比例高时转化效率最高 ,而且 S 期是细胞DNA复制期 ,此时转化有利于 T- 链转变成双链 ,增加稳定整合和遗传。所以经过适当的继代培养 ,可以使细胞处于转化最佳状态而提高转化效率。本实验通过观察 ,经继代培养后的愈伤组织表面光滑 ,质地致密 ,粒形好 ,继代

培养 6～7 d 时转化率最高。培养时间太短 ,愈伤组织表面粗糙 ,粒小 ,不利于转化;培养时间过长则愈伤组织变软 ,发粘 ,转化后易褐化死亡。

3.3农杆菌浓度对转化效率的影响农杆菌浓度直接影响到转化效率。农杆菌浓度太低时 ,每个愈伤组织块产生的抗性愈伤数极少 ,大部分不产生抗性愈伤;浓度太高 ,则愈伤组织很容易被过度侵染 ,共培养后

无法恢复活力 ,在进行选择培养时 ,大多数会褐化死亡。本研究用不同 OD 值的农杆菌菌液分别处理生长状况良好一致的 300 个愈伤组织 ,发现当OD600值为 0.145～0.190 时 ,转化效率基本保持在 79 %左右 ,当 OD600值低于 0. 145 时 ,转化率较低 ,超过 0. 190 时 ,愈伤死亡数量增多 ,并且选择培养时 ,因过多的农杆菌覆盖在抗性愈伤组织上 ,抑制了其生长。

4 结论与讨论

农杆菌转化效率的影响因子包括菌株类型、水稻基因类型、培养基成分组成、组织培养条件等。笔者通过对日本晴水稻转化条件的研究 ,发现在日本晴的转化过程中 ,当种子灭菌30 min时 ,愈伤的诱导率最高 ,继代培养 6～7 d后的转化率最高 ,菌浓度 OD600值为 0. 145～0. 190时 ,转化效率高。另外 ,试验还发现在分化培养时 ,黑暗条件下预培养7 d的可以大大减少愈伤组织的褐化程度 ,分化效率达到

85 %。优化后转化体系大大减少了组织培养时间 ,3 个月即可获得转化植株 ,不但节省成本 ,而且减少由于组培而激活 Tos17 等水稻内源转座子从而造成体细胞突变的频率。

农杆菌介导的基因转化技术已经很成熟 ,但是要适应高通量的水稻基因组研究 ,快速完成 T -DNA插入饱和突变体的创制 ,需要大大提高抗性愈伤组织的分化效率。传统转化技术将转化后的愈伤组织直接放在同一培养基上进行分化与选择培养 ,容易造成愈伤组织因褐化而抑制分化。因为选择培养基中含有的高浓度抗生素使未转化的愈伤组织褐化而产生酚类等有毒物质 ,抑制了抗性愈伤组织的生长和分化。有人对传统转化方法进行初步改进 ,把抗性愈伤组织单独放在含有抗生素的分化培养基上培养 ,但是由于抗生素的影响以及分化培养基中的ABA等见光分解 ,结果直接影响了分化效果。笔者在此基础上做了进一步的改进 ,将选择培养基上的抗性愈伤组织转到分化培养基上 ,然后放置在黑暗下培养 7 d ,再转到新的分化培养基上光照下培养 ,只需 10 d 左右就能分化成苗 ,分化效率可达85 %。该方法的优点在于使 ABA 在黑暗下充分发挥作用 ,促使愈伤组织很好的转入分化生理状态 ,再进行光照以提供能量进行分化。而且由于该方法减少了培养时间 ,也就降低了组织培养造成的体细胞突变的概率。

本实验的GUS染色分析显示,GUS基因已在水稻的叶片,根,颖壳,种皮,胚及胚乳各个部位表达,

染色阳性率达到30 %,表明T- DNA 已经稳定整合到水稻基因组中。