细胞毒性T细胞作用的分子机制04

第四章 细胞毒性T 细胞作用的分子机制免疫系统针对病原所产生的免疫应答分为两大类：以抗体为主体介导的中和细胞外病原体的体液免疫反应和以细胞毒性T 细胞（CTL ）为主体介导的特异杀伤被感染靶细胞的细胞免疫反应。

其中细胞免疫反应对于彻底地杀灭病原体、清除被感染的“改变”了的自身细胞显得尤为重要。

细胞免疫反应包括NK 细胞等介导的非特异性靶细胞杀伤和CTL 为主、Th 细胞为辅所介导的特异性靶细胞杀伤。

CTL 对于被感染细胞的MHC I 类分子限制特异性的杀伤是细胞免疫应答的重要内容，其研究对于了解免疫识别、免疫杀伤以及新型疫苗的分子设计都有重要意义。

第一节 CTL 作用概述CTL 即杀伤性T 细胞，是一类具有CD8+表面标志、受MHC I 类分子限制性杀伤功能的T 细胞。

CTL 的重要功能是可以特异性地杀伤靶细胞。

CTL 介导的靶细胞杀伤的特点是：杀伤受TCR 以及MHC I 类分子的严格限制。

CTL 对靶细胞的杀伤还具有特异性、程序性和快速性的特点。

另外，IL-2和其它一些细胞因子在CTL 前体的体外培养和效应CTL 的分化诱导中也起着重要作用。

一、CTL 的主要生物学功能CTL 对感染了病原的靶细胞杀伤构成了细胞免疫的重要部分。

CTL 在识别“改变”了的自身细胞，如病毒感染细胞、恶性细胞和移植反应中的移植细胞等起着非常重要的作用。

由于人体所有的有核细胞都表达I 类MHC 分子，因此，CTL 原则上可以识别和清除几乎所有改变了的自身细胞。

二、CTL 作用的MHC 限制性CTL 的杀伤作用受MHC 严格限制。

CTL 在杀伤抗原特异性靶细胞过程中，不识别可溶性抗原或者与非自身MHC I 类分子结合的抗原，而只能识别与自身MHC I 类分子相联系的特异性抗原多肽。

三、CTL 的组成CTL 的命名是根据体外与一定比例的特异性靶细胞孵育后杀伤一定百分率的靶细胞这一功能来确定的。

因此，CTL 不是一种特定的细胞，而是一个具有特异性杀伤活性的T 细胞群体。

在组成上，它包括CD8+T 细胞和CD4+T 细胞。

1、CD8+ T 细胞 主要有αβTCR 型CD8+T 细胞和γδTCR 型CD8+T 细胞。

前者以αβTCR 识别靶细胞表面上的MHC I 类分子-肽复合物（图1 ）；后者则以γδTCR 识别靶细胞表面的HLA-I HLA-II图1 TCR-抗原肽-HLA 三分子复合物αβ TCRαβ TCRMHC I 类分子-肽复合物。

尽管 TCR 型T 细胞仅占CTL 群体中的极小部分，但在对一些特殊抗原的免疫反应中，它们起着非常重要的作用。

2、CD4+T 细胞 CD4+T 细胞通常被认为是在抗原免疫过程中通过分泌细胞因子及表达表面分子介导细胞间相互作用，来调节和增进体液免疫和细胞免疫反应，主要起辅助作用。

但在某些情况下，CD4+T 细胞也具有杀伤功能，且主要依赖Fas-FasL 机制。

实验证明当抗原由II 类MHC 分子而不是由I 类MHC 分子呈递时，CD4+T 细胞可以取代CD8+T 细胞而发生反应，成为杀伤性的CTL 。

四、CTL 作用的主要过程CTL 介导的靶细胞杀伤反应可分为3个阶段：识别启动、增殖分化及效应阶段。

1、识别启动阶段在这一阶段，CTLp （CTL 前体）通过表面的TCR 特异性地识别并结合靶细胞表面呈递的I 类MHC 分子-抗原多肽复合物，和其它若干对表面分子的配体（图 2）。

图2 参与T 细胞活化的膜表面分子2、增殖分化阶段在此阶段，Th 细胞发生大量增殖并分泌IL-2等细胞因子；CTL 则在特异性增殖的同时，自前体细胞分化成为效应CTL 。

（1）Th 细胞的增殖对CTLp 分化的辅助作用 当CTLp 识别了呈递于靶细胞表面与I 类MHC 分子相结合的特异性抗原多肽后，特征性地表达IL-2R （受体）。

由于此时Th 细胞也受到特异性抗原的刺激，产生大量的IL-2。

这些IL-2与激活的CTLp 表面的IL-2R 结合，使得CTLp 发生特异性的增殖，逐步分化成为成熟的效应CTL 。

（2）巨噬细胞对CTLp 分化的辅助作用 研究证明巨噬细胞的作用是用以激活II 类MHC 限制性的Th 细胞。

（3）细胞因子对CTL 的产生调节 多种细胞因子，包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12和IL-15，其中IL-2诱导CTL 杀伤活性的能力较强。

这些细胞因子通过诱导相关基因的表达，使CTLp 朝着成熟方向分化，并使抗原特异性CTL 克隆的生长和增殖加快。

3、效应阶段在效应阶段，已分化成熟的效应CTL 发挥其杀伤功能，特异性裂解靶细胞。

作用的过程可分为4个阶段：识别与结合、细胞器重排与颗粒外吐、CTL 解离、靶细胞解体（图3 ）。

TCR/CD ICAM-1 B7-1 B7-2 LFA-1 ICAM-3 LFA-3 B7-1 T APC（1）识别与结合CTL表面的TCR识别并结合靶细胞表面的I类MHC-多肽复合体，同时还需其它若干对表面分子参与，才能加强和稳定CTL与靶细胞的结合。

其中，CTL上的CD11a/CD18 （LFA-1）与靶细胞上的ICAM-1或ICAM-2可能是最重要的一对结合分子。

图3 CTL介导的靶细胞杀伤过程（2）细胞器重排与颗粒外吐CTL上的TCR是与细胞内一些细胞骨架成分如小管和肌动蛋白偶联的。

当TCR与靶细胞上的MHC I-多肽复合体交联后，将通过这些细胞骨架成分启动细胞器的重排。

高电子密度的颗粒明显地向靶细胞方向移动，并在结合部位直接外吐颗粒内含物质，对靶细胞膜进行攻击。

这一胞质颗粒的外吐是由Ca2+流入CTL所诱发的。

（3）CTL解离CTL向靶细胞释放颗粒内含物后，即完成其杀伤过程，开始与靶细胞解离。

离开靶细胞后，又可重复以上过程，重新结合靶细胞，重复杀伤。

因此CTL可以杀伤多个靶细胞，即CTL可循环利用。

（4）靶细胞解体CTL离开靶细胞后，靶细胞开始出现核膜与细胞膜的破裂，直至细胞裂解死亡。

第二节CTL分子机制及应用前景一、CTL作用的分子模式CTL杀伤靶细胞的分子机制包括胞质颗粒依赖机制和FasL-Fas介导的凋亡机制（图4）。

1、胞质颗粒依赖机制CTL可以通过外吐胞质颗粒，释放颗粒内含物，导致靶细胞的损伤。

CTL胞内含许多颗粒，直径0.5~1 m，主要有两种成分：颗粒核心核多囊泡结构。

颗粒核心中包含穿孔素、颗粒酶和粘蛋白，而多囊泡结构则包含溶酶体酶和溶酶体的一些膜标志。

穿孔素是胞质颗粒中参与靶细胞损伤过程的最主要蛋白，穿孔素似乎唯一地表达于CTL颗粒中。

它可在靶细胞膜上聚合，形成穿膜孔道，以穿孔方式裂解靶细胞。

（1）穿孔素的穿孔机制穿孔素是一个含555个氨基酸的糖蛋白，分为两个重要的功能区：补体同源区和C2区。

穿孔素以单体存在，插入靶细胞膜中，发生聚合，产生多种不同聚合数目的多聚体。

CTL通过可咯外吐方式释放出穿孔素，进入细胞间隙。

穿孔素在Ca++存在下，引起构象变化，暴露其疏水基团，附着并插入脂质双层膜中，在靶细胞膜表面形成多个孔洞，最终引起靶细胞解体。

图4 CTL杀伤的胞质颗粒酶依赖和Fas/FasL凋亡机制（2）胞质颗粒内其它酶或分子依赖的非穿孔素机制 A 丝氨酸脂酶/颗粒酶；B 粘蛋白；TNF。

2、非胞质颗粒依赖机制—FasL/Fas机制CTL对靶细胞的杀伤主要引起靶细胞的膜结构破裂以及核DNA的快速降解，但胞质颗粒依赖机制只能引起靶细胞的膜结构破裂，而不能导致靶细胞核DNA的降解，目前认为Fasl/Fas介导的细胞凋亡是CTL杀伤靶细胞的非胞质颗粒依赖机制。

Fas/Apo-1即CD95分子，编码分子量45⨯103单位？的跨膜蛋白，是TNF受体相关蛋白（TNFR）的一种。

Fas蛋白由胞外区、跨膜区和胞内区组成，其中胞内区含一个与细胞凋亡相关的死亡区域。

Fas主要以膜受体形式存在，广泛表达于外周活化T、B细胞，NK 细胞，单核细胞，成纤维细胞等。

FasL是分子量为30⨯103单位？的TNF相关II型膜蛋白，也由细胞外区、跨膜区和胞内区组成，其胞外区与TNF家族成员高度同源。

FasL除了在淋巴细胞表达外，还在其他一些细胞表达，包括巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞、神经元细胞和若干肿瘤细胞。

因靶细胞上的Fas与CTL等具有杀伤功能的细胞上的FasL结合是诱导靶细胞产生凋亡的主要途径之一，因此Fas可称死亡分子，FasL则称死亡因子。

FasL-Fas作用的分子机制FasL-Fas机制介导的杀伤过程可分为两个时期：激活启动期和FasL-Fas结合期。

FasL-Fas机制的启动仍然必需CTL上的TCR对靶细胞MHC I-肽复合物的识别，同样需要CTL与靶细胞发生Mg++依赖的结合和粘连。

激活期依赖于细胞外Ca++/Mg++环境的存在以及细胞内RNA合成与蛋白合成所需的酶与基质。

TCR对靶细胞MHC I-肽复合体的识别与结合同时启动了CTL染色体DNA上FasL基因以及靶细胞染色体DNA上Fas基因的转录和翻译，随后，FasL表达在CTL细胞膜上，Fas表达于靶细胞膜上。

在一些粘附分子的辅助下，二者有效地发生结合。

Fas在配体的诱导下，形成三聚体，三聚体的形成导致一种级联反应衔接子——Fas相关的含死亡区域的蛋白（FADD/MORT1）的募集。

而FADD含一个蛋白-蛋白作用区域，又称死亡效应区域，可使FADD与其他含死亡效应区域的蛋白（如FLICE/MACHI/Mch5—caspase-8/胱冬肽酶8，N端含2个独立的死亡效应区域）形成二聚体。

Fas三聚体对FADD的募集又导致对caspase-8前体的募集，这样便形成了Fas信号传导复合物。

caspase-8前体发生自催化剪切，释放有活性的蛋白酶亚基。

一旦被激活，caspase-8可连续激活其他的下游caspase，并可降解其在胞内的底物。

经过caspase的一系列反应，细胞最终走向细胞凋亡（图5 ）。

３、细胞因子介导途径（１）细胞因子介导途径的作用机制在人类的病毒感染期，至少有两种以上的机制联合才能实现病毒的完全清除。

首先，病毒特异性CTL识别并杀伤一小部分被感染的靶细胞；其次，病毒特异性CTL可分泌炎性细胞因子直接或间接（通过激活巨噬细胞）地通过抑制病毒在胞内复制来治疗大部分的被感染的细胞。

CTL图5 FasL-Fas 通路导致细胞凋亡机制（２）细胞因子介导的双重作用细胞因子作用机制还不完全明确，但它在产生抗病毒效应的同时，也可能使病毒降低其复制水平以逃避免疫系统的识别。

已知不完全/不足量的病毒激活或者免疫系统的功能减退将会导致若干感染细胞内病毒抗原表达的下调，其微小的量正好可使这些感染细胞逃避免疫细胞如CTL的识别，从而引起病毒的持续性感染和慢性肝炎的发生。