山东大学生化实验报告-蛋白质浓度测定
蛋白质测定实验报告
蛋白质测定实验报告标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]蛋白质测定方法——化学报告蛋白质的检测酚试剂法灵敏度较高20~250mg 费时蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述：1 材料与方法仪器材料(1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。
(2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。
实验方法(1)凯氏定氮法测定蛋白质含量将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。
为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。
消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。
每个样品做三次重复测定,取平均值。
(2)紫外吸收法测定蛋白质含量蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。
此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。
利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。
低浓度的盐,例如,生化制备中常用的(NH4)2SO4 等和大多数缓冲液不干扰测定,特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。
生化实验 蛋白质测定含量
蛋白质含量的测定:1. 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。
然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。
根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。
2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3 F=5.71可知,蛋白质与氮的比例是5.71,每一摩尔氮对应一摩尔盐酸①凯氏定氮法原理：蛋白质平均含氮量为16%。
当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
②双缩脲法原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。
蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。
比色定蛋白质含量。
缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。
其精确度较差(数mg)，且会受样品中硫酸铵及Tris 的干扰，但准确度较高，不受蛋白质的种类影响。
③Folin酚法(Lowry)Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。
试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+，Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。
灵敏度较高(约0.1 mg)，但较麻烦，也会受硫酸铵及硫醇化合物的干扰。
步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。
④紫外法280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）⑤色素结合法（Bradford 法）直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
测定蛋白质浓度
测定蛋白质浓度[目的]:掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理，熟悉紫外分光光度计的使用。
[原理]:蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。
它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据，但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要准确定量，必需要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或且已经知道其消光系数作为参考。
另外，不少杂质在280nm波长下也有-定吸收能力，可能发生干扰。
其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶碱)的影响更为严重。
然而核酸的最大吸收峰是在260nm。
因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定OD260nm，与OD280nm。
，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。
本法操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，多用于纯化之蛋白质的微量测定。
主要缺点:当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，则产生-定误差，混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD 值，再按公式推算蛋白质含量。
[操作]取试管7支，按下表操作:试剂标准管测定管空白管12345稀释标准蛋白液(ml)0.51.01.52.02.500稀释样本蛋白质(ml)000001.00生理盐水(ml)3.53.02.52.01.53.04/P各管混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以空白管调节零点，分别于280nm、260nm波长下测定各管光密度[计算](一)直接根据标准液与待测液的光密度值(OD280nm)，或从标准曲线，求得样本蛋白质含量。
以标准管各管光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线，然后根据测定管光密度值，直接查标准曲线求得样本中蛋白质的含量。
1.选一种与待测样本蛋白质氨基酸组成相近似的蛋白质纯品，用生理盐水稀释至浓度为lmg/m1，作为稀释标准蛋白质溶液。
蛋白质定量生化实验报告
一、实验背景蛋白质是生物体内的重要功能分子，具有多种生物学功能，如催化、结构、运输、信号传导等。
因此，蛋白质定量分析在生物科学研究中具有重要意义。
本实验旨在通过双缩脲法对蛋白质进行定量测定，并分析实验结果。
二、实验目的1. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法；2. 学会操作双缩脲试剂，并观察蛋白质定量结果；3. 分析实验数据，探讨蛋白质定量结果的影响因素。
三、实验原理双缩脲法是一种经典的蛋白质定量方法，其原理是：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子（Cu2+）发生反应，生成紫红色的络合物。
该络合物在540nm处的吸光度与蛋白质含量呈线性关系，通过测定吸光度可以计算出蛋白质的浓度。
四、实验材料1. 实验试剂：- 双缩脲试剂A：0.1g/L硫酸铜溶液；- 双缩脲试剂B：0.01g/L酒石酸钾钠溶液；- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白）；- 未知蛋白质样品；- 蒸馏水；- 6mol/L氢氧化钠溶液；- 50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。
2. 实验仪器：- 分光光度计；- 移液器；- 试管；- 烧杯；- 玻璃棒。
五、实验步骤1. 准备标准曲线：- 取6个试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准蛋白质溶液； - 加入1.8mL蒸馏水，使总体积为2.0mL；- 加入0.2mL双缩脲试剂A；- 混匀，静置10分钟；- 加入0.4mL双缩脲试剂B；- 混匀，静置10分钟；- 以蒸馏水为空白，在540nm处测定吸光度；- 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 测定未知蛋白质样品：- 取6个试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL未知蛋白质样品； - 加入1.8mL蒸馏水，使总体积为2.0mL；- 按照步骤1中的方法进行操作；- 以蒸馏水为空白，在540nm处测定吸光度；- 通过标准曲线计算未知蛋白质样品的浓度。
六、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：- 标准曲线呈线性关系，相关系数R2=0.998。
生化试验-蛋白质含量的测定
〔Ⅱ〕实验部分实验一蛋白质含量测定法本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。
了解各种测定方法的基本原理和优缺点。
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。
五、考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
蛋白质测定实验报告
蛋白质测定方法——化学报告蛋白质的检测酚试剂法灵敏度较高20~250mg 费时蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合,形成蛋白质一铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼酸还原,产生蓝色化合物酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法,下面以实验的形式进行详细阐述：1 材料与方法仪器材料1仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵;2试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0.050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂;实验方法1凯氏定氮法测定蛋白质含量将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨消化 ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵;为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清;消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量;每个样品做三次重复测定,取平均值;2紫外吸收法测定蛋白质含量蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度即光密度值与蛋白质含量成正比;此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比;利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定;紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用;低浓度的盐,例如,生化制备中常用的NH42SO4 等和大多数缓冲液不干扰测定,特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值;此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质;若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰;核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正;但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差;此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致;取待测样品制成蛋白浓度大约在0. 1～1. 0mgPmL的蛋白质溶液,用紫外分光光度计进行比色,对照标准曲线得出样品含氮量;每个样品做3次重复测定,取平均值;3双缩脲法测定蛋白质含量双缩脲NH3CONHCONH3是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物;在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应;凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应;紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量;此法的优点是测定较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少;主要的缺点是灵敏度差;因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定;取待测样品制成蛋白浓度大约在1～10mgPmL的蛋白质溶液,加双缩脲试剂染色30min,用可见光分光光度计进行比色,对照标准曲线得出样品蛋白质含量;每个样品做3次重复测定,取平均值;4考马斯亮蓝法测定蛋白质含量由于双缩脲法Biuret 法存在明显的缺点和许多限制,因此1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法Bradford法 ,这是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的;这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用;这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法;Bradford法的突出优点是:a.灵敏度高;据估计,比Lowry法约高4倍,其最低蛋白质检测量可达1mg;这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质- 染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大得多;b.测定快速、简便,只需加一种试剂;完成一个样品的测定,只需要5min左右;由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2min即可完成,其颜色可以在1h内保持稳定,且在5～20min之间,颜色的稳定性最好,因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间;c. 干扰物质少;如干扰Lowry法的、离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法;此法的缺点是:a.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用γ- 球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差;b.仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、TritonX- 100、十二烷基硫酸钠SDS和0. 1N的NaOH;如同0. 1N的酸干扰Lowry法一样 ;c.标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度;取待测样品加入考马斯亮蓝G- 250试剂放置5min后,用可见光分光光度计比色,对照标准曲线得出样品蛋白质含量;每个样品做3次重复测定,取平均值;2 结果与分析实验结果表1 样品蛋白质含量的测定结果实验结果分析1凯氏定氮法可测出全部3种样品的蛋白含量,测试结果准确,只是蒸馏与吸收装置复杂,不便于操作,实验过程所需时间较长,操作复杂;2紫外吸收法无法测出牛奶、酸奶的蛋白含量,测出的豆浆蛋白含量也与实际值相差较大,不具实际使用价值;此方法实验过程简单,适用于测试无色样品,对于有色样品需进行预处理,排除颜色干扰后才适用于此方法;3双缩脲法适用于被测的3种样品,实验操作简便迅速,但其缺点是灵敏度较低,蛋白质量须在1～20mgPmL时测定结果较准确;因此实验前要估测被测样品的蛋白含量,把样品稀释至蛋白浓度为1～20mgPmL;4考马斯亮蓝染色法可以测出被测的全部3种样品,此方法快速、灵敏,但只有作微量蛋白测定时的结果才准确,因此在实验前应将样品稀释至蛋白浓度为0. 1～1mgPmL,而且实验必须在1h内完成,不然测试结果不准确;5酚试剂法原理：蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合,形成蛋白质一铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼酸还原,产生蓝色化合物,在一定条件下,利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度;优点：操作简便,灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,样品中蛋白质含量高于5μg 即可测得,是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一;缺点：费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多;对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰lowry反应;而且对后者的影响还要大得多;酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用;浓度较低的尿素%,硫酸纳1%,硝酸纳1%,三氯乙酸%,乙醇5%,乙醚5%,丙酮%等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线;含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液,即可显色测定;若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍;适用范围：适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定;此法可检测的最低蛋白质量达5mg;通常测定范围是20~250mg个人想法——蛋白质是我们生活中不可或缺的东西,无论是各种乳制品还是一些保健产品,蛋白质的含量无疑是一个受人瞩目的指标;然而,纵观我们现在使用的这些蛋白质检测方法,很明显的都有一个“不适合大规模检测”的特点,这对于现在的大规模生产模式显然不适用;而且,更为严重的是,所有的检测方法都会受到许多其它物质的干扰作用,之前闹得沸沸扬扬的三鹿奶粉事件就是利用了凯式定氮法中的检测漏洞检测时检测的是氮元素的含量,那么,一些非来自于蛋白质的氮就会被当成蛋白质中的,从而“提高”了蛋白质的含量检测结果所以,不管怎么样,在蛋白质的检测中,我们可以进行多重物质鉴定,从而减小误差;凯式定氮法并不是不能用了,我们还可以增加检测步骤,比如之前先检测原料的成分;而一汽也是可以随着科技的不断发展来提升它的精确度的;就现在的上述方法来讲,还是考马斯亮蓝法较为准确,虽然不适用于大规模检测,但是,当我们提高了产家的素质,完全可以只检测样品来确定蛋白质的含量;。
蛋白浓度测定(完成)
蛋白浓度测定蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。
在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。
蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。
目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA法，胶体金法染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法其他性质：荧光法蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。
例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。
常用的测定蛋白质含量方法的比较由于凯氏定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度又太低，下面介绍Folin—酚试剂法，考马氏亮蓝G—250染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。
试验一：BCA法BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。
在组织细胞裂解实验中，常用浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。
基本原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
蛋白质浓度的测定(精华)
蛋白质浓度的测定一．紫外吸收法1. 近紫外吸收光谱法（280 nm）原理：蛋白质中含有色氨酸与酪氨酸残基，这两种氨基酸残基具有吸收紫外光的性质，它们的紫外光吸收谱峰值在280 nm附近。
某些蛋白质含有二硫键，也会在280 nm附近吸收紫外光。
近紫外吸收法就是根据这个性质，对蛋白质进行定量。
因为不同的蛋白质中所含有的色氨酸与酪氨酸的数量存在很大的差异，所以蛋白质在280 nm处的吸光度A280也存在非常大的差异。
比如，当蛋白质浓度为1mg/ml时，吸光度A280可为0-4之间的任何值。
但是，大部分的蛋白质的吸光度A280时0.5-1.5之间的某个值。
该方法测定蛋白质的浓度具有明显的优缺点。
这种方法操作简单，测定完成后，样品可以被回收，对buffer没有特殊要求，这是该方法的优点。
该方法的缺点是：其他的生色基团会影响蛋白质吸收光谱的测定，比如核酸在该波长的紫外吸收能力非常强，少量的核酸就会对蛋白质吸光值的测定造成很大的干扰。
同时，不同的蛋白质的消光系数需要在实验前确定。
蛋白质浓度的计算：朗伯比尔定律：A(absorbance) = ε c l，因此：c（mg/ml）= A/ε l (cm)。
消光系数：当蛋白质浓度为1 mg/ml，光径为1 cm时，所测得的吸收值为该蛋白质的消光系数。
蛋白质的消光系数计算公式：A280 (1 mg/mL) = (5690n w + 1280n y + 120n c)/M。
其中M为蛋白质分子质量，5690、1280与120分别是色氨酸、酪氨酸与半胱氨酸的消光系数，n是该氨基酸残基的数目。
2. 远紫外吸收光谱法在190-210 nm范围内，蛋白质中的肽键具有非常强的吸收紫外光的能力。
此波长范围内，肽键在190 nm处的吸收值是其在205 nm的2倍，而且在190 nm，氧气对紫外光的吸收非常强，因此，通常取205 nm处的吸收值对蛋白质进行定量。
对于1 mg/ml的蛋白质溶液，它们的消光系数通常在30-35之间。
蛋白质浓度测定
蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定:紫外分光光度法蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。
它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据，但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要准确定量，必需要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或且已经知道其消光系数作为参考。
另外，不少杂质在280nm波长下也有—定吸收能力，可能发生干扰。
其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶碱)的影响更为严重。
然而核酸的最大吸收峰是在260nm。
因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定ODnm，与ODnm。
，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过260280经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。
本法操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，多用于纯化之蛋白质的微量测定。
主要缺点:当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，则产生—定误差，混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值，再按公式推算蛋白质含量。
[操作]取试管7支,各管混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以空白管调节零点，分别于280nm、260nm波长下测定各管光密度。
[计算](一)直接根据标准液与待测液的光密度值(ODnm)，或从标准曲线，求得样本蛋白质280含量。
以标准管各管光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线，然后根据测定管光密度值，直接查标准曲线求得样本中蛋白质的含量。
1( 选一种与待测样本蛋白质氨基酸组成相近似的蛋白质纯品，用生理盐水稀释至浓度为lmg/m1，作为稀释标准蛋白质溶液。
2(用生理盐水稀释待测样本蛋白质至浓度约为lmg/m1，即为稀释样本蛋白质溶液。
(二)利用经验公式直接计算样本蛋白质含量，准确吸取血清样本0.1ml，置于50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度，即500倍稀释，在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值、再按下列公式计算。
蛋白质浓度的测定(精华)
蛋白质浓度的测定一．紫外吸收法1. 近紫外吸收光谱法（280 nm）原理：蛋白质中含有色氨酸与酪氨酸残基，这两种氨基酸残基具有吸收紫外光的性质，它们的紫外光吸收谱峰值在280 nm附近。
某些蛋白质含有二硫键，也会在280 nm附近吸收紫外光。
近紫外吸收法就是根据这个性质，对蛋白质进行定量。
因为不同的蛋白质中所含有的色氨酸与酪氨酸的数量存在很大的差异，所以蛋白质在280 nm处的吸光度A280也存在非常大的差异。
比如，当蛋白质浓度为1 mg/ml时，吸光度A280可为0-4之间的任何值。
但是，大部分的蛋白质的吸光度A280时0.5-1.5之间的某个值。
该方法测定蛋白质的浓度具有明显的优缺点。
这种方法操作简单，测定完成后，样品可以被回收，对buffer没有特殊要求，这是该方法的优点。
该方法的缺点是：其他的生色基团会影响蛋白质吸收光谱的测定，比如核酸在该波长的紫外吸收能力非常强，少量的核酸就会对蛋白质吸光值的测定造成很大的干扰。
同时，不同的蛋白质的消光系数需要在实验前确定。
蛋白质浓度的计算：朗伯比尔定律：A (absorbance) = ε c l，因此：c（mg/ml）= A/ε l (cm)。
消光系数：当蛋白质浓度为1 mg/ml，光径为1 cm时，所测得的吸收值为该蛋白质的消光系数。
蛋白质的消光系数计算公式：A280 (1 mg/mL) = (5690n w + 1280n y + 120n c)/M。
其中M为蛋白质分子质量，5690、1280与120分别是色氨酸、酪氨酸与半胱氨酸的消光系数，n是该氨基酸残基的数目。
2. 远紫外吸收光谱法在190-210 nm范围内，蛋白质中的肽键具有非常强的吸收紫外光的能力。
此波长范围内，肽键在190 nm处的吸收值是其在205 nm的2倍，而且在190 nm，氧气对紫外光的吸收非常强，因此，通常取205 nm处的吸收值对蛋白质进行定量。
对于1 mg/ml的蛋白质溶液，它们的消光系数通常在30-35之间。
蛋白质的定量测定实验报告
蛋白质的定量测定实验报告蛋白质的定量测定实验报告引言：蛋白质是生物体内重要的基础组成部分，其含量的测定对于生物学研究和医学诊断具有重要意义。
本实验旨在通过比色法测定蛋白质的含量，并探讨不同方法对测定结果的影响。
材料与方法：1. 标准蛋白质溶液：取一系列浓度已知的蛋白质溶液，如0.1 mg/mL、0.2mg/mL、0.3 mg/mL等。
2. 待测蛋白质溶液：取待测蛋白质溶液，浓度未知。
3. 比色试剂：如Bradford试剂、Biuret试剂等。
4. 分光光度计：用于测定吸光度值。
实验步骤：1. 预处理标准溶液：将标准蛋白质溶液分别稀释至一定浓度，如0.01 mg/mL。
2. 加入试剂：将标准溶液和待测溶液分别与比色试剂混合，使试剂与蛋白质发生反应。
3. 反应时间：将混合液在室温下静置一段时间，使反应充分进行。
4. 测定吸光度：使用分光光度计测定混合液的吸光度值，并记录下来。
5. 绘制标准曲线：将吸光度值与标准溶液的浓度进行对应，绘制标准曲线。
6. 测定待测溶液的吸光度：使用相同的方法测定待测溶液的吸光度值。
7. 计算蛋白质浓度：根据标准曲线，计算出待测溶液中蛋白质的浓度。
结果与讨论：通过测定吸光度值和标准曲线，我们可以得到待测溶液中蛋白质的浓度。
然而，在实际操作中，我们需要注意以下几点：1. 试剂选择：不同的试剂对于不同类型的蛋白质可能有不同的反应特性。
因此，在选择试剂时，需要根据待测蛋白质的性质进行合理选择。
2. 反应时间：反应时间的长短会对测定结果产生影响。
反应时间过短可能导致反应不完全，而反应时间过长可能引起其他化学反应的发生。
因此，在实验中需要控制好反应时间。
3. 吸光度测定：吸光度的测定需要保持仪器的稳定性和准确性。
在测定过程中，应注意校准仪器，避免光线干扰和污染对结果的影响。
此外，本实验还可以通过其他方法进行蛋白质定量测定，如BCA法、Lowry法等。
这些方法在原理和操作步骤上有所不同，但都可以用于测定蛋白质的含量。
bca法测蛋白浓度实验报告
bca法测蛋白浓度实验报告BCA法测蛋白浓度实验报告一、引言蛋白质是生物体内重要的组成部分，其浓度的准确测定对于生物学研究和生物工程应用具有重要意义。
BCA法（Bicinchoninic Acid Assay）是一种常用的测定蛋白质浓度的方法，其原理是利用蛋白质与铜离子在碱性条件下形成蛋白质-铜络合物，进而与BCA试剂中的双香酮反应产生紫色产物，通过比色测定紫色产物的吸光度来确定蛋白质浓度。
二、实验目的本实验旨在通过BCA法测定给定蛋白溶液的浓度，掌握BCA法的基本原理和操作方法，并评估该方法的准确性和可靠性。
三、实验材料和方法1. 实验材料- BCA试剂盒- 待测蛋白溶液- BSA标准溶液- NaCl溶液- NaOH溶液- 96孔酶标板- 酶标仪2. 实验方法（1）制备标准曲线a. 准备一系列浓度递增的BSA标准溶液，如0 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL和10 μg/mL。
b. 取相应浓度的BSA标准溶液，加入BCA试剂，混匀后孵育30分钟。
c. 使用酶标仪测定各标准溶液的吸光度，记录吸光度值。
（2）测定待测蛋白溶液浓度a. 取待测蛋白溶液，加入BCA试剂，混匀后孵育30分钟。
b. 使用酶标仪测定待测蛋白溶液的吸光度，记录吸光度值。
（3）计算蛋白质浓度根据标准曲线的吸光度值和相应浓度的BSA标准溶液浓度，利用线性回归分析计算待测蛋白溶液的浓度。
四、实验结果与分析根据实验数据，我们绘制了标准曲线，并利用该曲线计算了待测蛋白溶液的浓度。
实验结果表明，待测蛋白溶液的浓度为X μg/mL。
BCA法作为一种常用的测定蛋白质浓度的方法，具有许多优点。
首先，BCA法使用的试剂易于制备和保存，操作简便。
其次，BCA法对于大多数常见蛋白质具有较好的线性响应，测定范围广。
此外，BCA法的结果稳定可靠，对于样品中存在的干扰物质具有较好的抗干扰能力。
然而，BCA法也存在一些局限性。
山东大学生化实验报告-蛋白质浓度测定
蛋白质浓度的测定（Folin-酚试剂法）【实验目的】熟悉并掌握用Folin-酚法测定蛋白质浓度的方法。
【实验原理】蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可通过绘制标准曲线，用比色法测定蛋白质浓度。
【实验试剂】1.标准酪蛋白200ug/ml2.Folin-酚乙液（原液与水按1:1比例混合，实验室已准备）3.Folin-酚甲液（实验室已准备）A液4%Na2CO3: 0.2%NaOH=1：1B液1%CuSO4 : 2%酒石酸钾钠=1：1A：B= 50：1 混匀4.样品血清（稀释200倍）【实验步骤】1.准备9支干净的试管，按表一顺序加入试剂表一2.各试管中加入5ml Folin-酚甲液，用旋涡摇匀器充分混合均匀，静置水浴（37度）10min。
3.各试管中加入0.5ml Folin-酚乙液，用旋涡摇匀气充分混合均匀，静置水浴（37度）30min。
4.使用分光光度计，用640nm波长进行比色。
【实验结果】表二各试管中标准蛋白浓度和OD值A、B、C三支试管中液体在640nm处OD值的平均值为ODλ=640nm=（0.177+0.177+0.17）/3=0.175如图一蛋白质浓度的标准曲线，当OD=0.175时，标准蛋白质浓度为109.375μg/ml，则所测样品血清的浓度为109.375μg/ml，经转化，样品血清浓度为10.9375g/100ml图一蛋白质浓度的标准曲线【思考讨论】1.结果分析，三组平行实验最终测得的OD值理论上是一样的，但我们的实验结果中有一个数值偏离较大，给最终的实验结果带来误差。
分析原因：①可能是因为加样的误差造成的三个试管中卵清蛋白的浓度不同，最终影响测定结果②可能是因为没有充分混匀，导致每个试管中的浓度不同③可能是因为分光光度计自身误差造成的。
2.实验注意事项：（1）在使用分光光度计时，拿比色皿要拿它的毛面，不可以用手接触它的光滑面，防止自己手上的油污导致测量值不准确。
蛋白质浓度的测定
实验九蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。
此反应重复性好，精确度高，线性关系好。
标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。
强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
生化蛋白质实验报告
生化蛋白质实验报告生化蛋白质实验报告引言：蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它们在细胞的结构和功能中起着至关重要的作用。
生化蛋白质实验旨在研究蛋白质的组成、结构和功能，以及它们在生物体内的相互作用。
本实验通过一系列的步骤来分离和纯化蛋白质，并对其进行进一步的分析和鉴定。
实验材料与方法：1. 细胞培养：使用细胞培养技术培养目标蛋白质所在的细胞系，确保细胞处于健康生长的状态。
2. 细胞裂解：通过加入细胞裂解液，使细胞膜破裂释放蛋白质。
3. 蛋白质分离：利用离心技术将裂解液中的细胞碎片与蛋白质分离。
4. 蛋白质纯化：采用色谱层析技术，如亲和层析、离子交换层析等，将目标蛋白质从其他蛋白质中纯化出来。
5. 蛋白质分析：利用凝胶电泳技术对纯化后的蛋白质进行分析，如SDS-PAGE、Western blot等。
实验结果与讨论：通过以上步骤，我们成功地从细胞中提取并纯化出目标蛋白质。
在SDS-PAGE凝胶电泳中，我们观察到了明显的蛋白质带，表明纯化过程取得了一定的成功。
进一步的Western blot实验结果显示，目标蛋白质在细胞系中的表达水平较高，并且具有较好的免疫原性。
在蛋白质组成分析方面，我们使用质谱技术对纯化后的蛋白质进行了鉴定。
质谱分析结果显示，目标蛋白质的分子量约为50 kDa，与文献报道的相符。
此外，通过质谱分析还发现了一些可能是目标蛋白质的修饰，如磷酸化、甲基化等，这些修饰对蛋白质的功能和调控具有重要的影响。
蛋白质结构是了解其功能和相互作用的关键。
在实验中，我们采用了X射线晶体学技术对目标蛋白质的结构进行了解析。
通过解析蛋白质的晶体结构，我们可以观察到其二级结构、立体构型以及可能的结合位点。
这些结构信息为我们进一步研究蛋白质的功能和相互作用提供了重要的线索。
结论：通过本次生化蛋白质实验，我们成功地从细胞中提取、纯化并鉴定了目标蛋白质。
通过分析其组成、结构和功能，我们对该蛋白质的特性有了更深入的了解。
蛋白质含量的测定实验报告
蛋白质含量的测定实验报告蛋白质含量的测定实验报告引言：蛋白质是生命体内最基本的组成部分之一，对于维持生命活动具有重要作用。
因此，准确测定蛋白质含量对于生物学、医学等领域的研究具有重要意义。
本实验旨在通过一系列的实验步骤，准确测定样品中蛋白质的含量。
实验材料和方法：1. 实验材料：- 样品：选择具有高蛋白含量的食品样品，如鸡蛋、牛奶等。
- 试剂：含有蛋白质的测定试剂盒，如BCA试剂盒。
- 标准品：含有已知蛋白质含量的标准品。
2. 实验步骤：1) 样品预处理：将样品加热至一定温度，使蛋白质变性，以便更好地释放出蛋白质。
2) 标准曲线制备：取一系列已知浓度的标准品，按照试剂盒说明书的要求进行处理，制备标准曲线。
3) 样品处理：将经过预处理的样品与试剂盒中的试剂混合，按照说明书的要求进行反应。
4) 光度测定：使用分光光度计测定反应液的吸光度，并与标准曲线进行比较，计算出样品中蛋白质的含量。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了样品中蛋白质的含量。
根据实验数据，我们可以得出以下结论：1. 样品与标准品的比较：通过与标准品的比较，我们可以确定样品中蛋白质的相对含量。
如果样品的吸光度与标准品相近，说明样品中蛋白质含量较高；反之，如果吸光度较低，则说明样品中蛋白质含量较低。
2. 实验误差的影响：在实验过程中，存在一定的误差。
这些误差可能来自于样品的处理过程、试剂的质量以及实验操作的技巧等方面。
因此，在进行实验时，需要注意控制这些误差，以保证测定结果的准确性和可靠性。
3. 实验结果的应用：蛋白质的测定结果可以应用于许多领域。
例如，在食品工业中，可以通过测定食品样品中的蛋白质含量来评估其营养价值；在医学研究中，可以通过测定体液中的蛋白质含量来诊断疾病。
结论：通过本实验，我们成功地测定了样品中蛋白质的含量。
在实验过程中，我们掌握了一系列的实验技巧和操作步骤，并了解了蛋白质测定的原理和应用。
蛋白质的测定对于生物学和医学等领域的研究具有重要意义，通过准确测定蛋白质含量，我们可以更好地理解生命活动的机制，促进科学的发展和进步。
实验蛋白质的浓度测定
Folin酚法 酚法
实验原理： Folin甲试剂：碳酸钠，氢氧化钠，酒石酸 钠，硫酸铜 Folin 乙试剂：磷钼酸-磷钨酸试剂 蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，然 后这种复合物以及蛋白质中的Tyr，Thy残基还 原磷钼酸-磷钨酸试剂，发生蓝色反应。蓝色 的深浅与蛋白质的含量成正比。
实验报告要求： 实验报告要求：Байду номын сангаас
实验原理：请结合自己的理解和讲义的内容用简单
的文字描述本次实验的原理
实验操作：请如实记录每次实验中所进行的所有实
验步骤
实验结果：请真实的记录和分析每次实验所获的实
验数据。
实验分析：对于实验中出现的现象和问题请结合所 学的理论知识予以分析。
实验课程要求： 实验课程要求：
实验操作：具体步骤参见讲义 实验结果：根据标准曲线判断待测样品的浓度 注意事项： Folin 乙试剂仅在酸性条件下稳定，而还 原反应需在碱性条件下发生，所以在加入 Folin 乙试剂后需立即摇匀（加一管摇一管）， 确保还原反应的发生。
紫外线吸收法
实验原理： 蛋白质中的Tyr，Thy残基的苯环含有共轭双键， 因此在280nm处有一个紫外吸收高峰。在一定 的浓度范围内（0.1~1.0g/L)，蛋白质溶液的 A280与其浓度成正比，可用作定量测定。 实验操作：具体步骤参见讲义 实验结果：根据标准曲线判断待测样品的浓度
按时达到实验室，事先对将要进行的实验内容进行预 习，做到心中有数。 实验过程中，认真进行实验操作,请不要在实验室大声 喧哗。 操作前了解实验中需注意的事项，操作过程独立完成， 认真观察和记录相关的实验现象和结果。 实验后，清理好自己的实验用具和实验台面。值日生 负责总体地清扫实验室台面和地面。 认真完成并按时交实验报告。
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蛋白质浓度的测定（Folin-酚试剂法）
【实验目的】
熟悉并掌握用Folin-酚法测定蛋白质浓度的方法。
【实验原理】
蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可通过绘制标准曲线，用比色法测定蛋白质浓度。
【实验试剂】
1.标准酪蛋白200ug/ml
2.Folin-酚乙液（原液与水按1:1比例混合，实验室已准备）
3.Folin-酚甲液（实验室已准备）A液4%Na2CO3: 0.2%NaOH=1：1
B液1%CuSO4 : 2%酒石酸钾钠=1：1
A：B= 50：1 混匀
4.样品血清（稀释200倍）
【实验步骤】
1.准备9支干净的试管，按表一顺序加入试剂
表一
2.各试管中加入5ml Folin-酚甲液，用旋涡摇匀器充分混合均匀，静置水浴（37
度）10min。
3.各试管中加入0.5ml Folin-酚乙液，用旋涡摇匀气充分混合均匀，静置水浴（37
度）30min。
4.使用分光光度计，用640nm波长进行比色。
【实验结果】
表二各试管中标准蛋白浓度和OD值
A、B、C三支试管中液体在640nm处OD值的平均值为
OD
λ=640nm=（0.177+0.177+0.17）/3=0.175
如图一蛋白质浓度的标准曲线，当OD=0.175时，标准蛋白质浓度为109.375μg/ml，则所测样品血清的浓度为109.375μg/ml，经转化，样品血清浓度为10.9375g/100ml
图一蛋白质浓度的标准曲线
【思考讨论】
1.结果分析，三组平行实验最终测得的OD值理论上是一样的，但我们的实验
结果中有一个数值偏离较大，给最终的实验结果带来误差。
分析原因：①可能是因为加样的误差造成的三个试管中卵清蛋白的浓度不同，最终影响测定结果②可能是因为没有充分混匀，导致每个试管中的浓度不同③可能是因为分光光度计自身误差造成的。
2.实验注意事项：
（1）在使用分光光度计时，拿比色皿要拿它的毛面，不可以用手接触它的光滑面，防止自己手上的油污导致测量值不准确。
（2）在比色皿中装入的液体量大约是比色皿体积的三分之二，太多容易洒出来，给测量造成不便，太少也容易造成测量的不准确。
（3）一定要注意实验时间，因为溶液的光密度值随时间会发生变化，时间太长会导致测量误差。