分子生物学 研究方法(上)
分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae 自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
现代分子生物学(第三版)课后答案 第五章分子生物学研究方法(上)
第五章分子生物学的研究方法（上）西南大学生命科学学院09级XX(仅代表个人观点)1，哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生和发展？答：1，确定遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质；2，DNA的双螺旋结构模型和半保留复制机制的提出；3，中心法则，操纵子学说的提出和密码子的破译；4，重组工具酶的发现；5，运载体重组质粒的发现。
2，如何理解PCR扩增的原理和过程。
答：原理：DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
过程：1，变性，将DNA在临近沸点的温度下加热使变性，双链打开；2，退火，引物与模版的相结合；3，链的延伸，DNA合成。
3，简述定量PCR的原理和过程。
答：实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行，激发光可以直接头孤傲管盖，使其中的荧光探针被激发。
一逛探针事先混合在PCR反应液中，只有与DNA 结合之后，才能被激发发出荧光。
随着新和成DNA片段的增加，结合到DNA上的荧光探针，即被激发产生的荧光增加。
4，基因组DNA文库和cDNA文库在构建原理和用途上的主要区别是什么？答：基因组DNA是把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合，导入微生物细胞形成克隆。
应用：主要用于基因组作图、测序和克隆序列的对比。
cDNA文库是以mRNA为模版反转录而成的序列，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增。
应用：筛选目的基因、大规模测序、金银芯片杂交等功能基因组学的研究。
5，基因克隆的方法主要有哪几种？简述各种方法的作用和用途。
答：1，RACE技术，用于在已知cDNA序列的基础上克隆5’端和3’端缺失的序列；2，应用cDNA差示分析法克隆基因，在没有任何探针的情况下，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDAN两端接头的方法特异性的扩增目的基因片段。
分子生物学第五章分子生物学研究法(上)
分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
分子生物学第九章--分子生物学研究方法电子教案精选全文
可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。
电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。
从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。
分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
分子生物学的研究方法例题和知识点总结
分子生物学的研究方法例题和知识点总结分子生物学是一门从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学。
它的研究方法多种多样，下面我们将通过一些例题来深入理解这些方法，并对相关知识点进行总结。
一、核酸提取与纯化核酸包括 DNA 和 RNA，是分子生物学研究的重要对象。
提取和纯化高质量的核酸是后续实验的基础。
例题：从植物叶片中提取总 DNA，需要经过哪些步骤？知识点：1、破碎细胞：使用机械研磨、酶解法等破坏细胞壁和细胞膜，释放出核酸。
2、去除杂质：通过加入蛋白酶 K 去除蛋白质，用酚/氯仿抽提去除酚类、多糖等杂质。
3、沉淀核酸：常用乙醇或异丙醇沉淀 DNA，离心后获得核酸沉淀。
4、洗涤和溶解：用 70%乙醇洗涤沉淀去除盐分，干燥后用适当的缓冲液溶解。
二、PCR 技术（聚合酶链式反应）PCR 是一种用于扩增特定 DNA 片段的技术。
例题：设计一对引物用于扩增某基因的特定片段，需要考虑哪些因素？知识点：1、引物长度：通常为 18 25 个核苷酸。
2、碱基组成：G ＋ C 含量在 40% 60%之间，避免形成稳定的二级结构。
3、特异性：引物要与目的基因特异性结合，避免与其他序列有过多的同源性。
4、退火温度：根据引物的碱基组成计算退火温度，以保证扩增的特异性和效率。
PCR 的基本步骤包括：1、变性：高温使双链 DNA 解离为单链。
2、退火：降低温度，引物与单链 DNA 结合。
3、延伸：在 DNA 聚合酶的作用下，从引物 3'端开始合成新的DNA 链。
三、基因克隆基因克隆是将目的基因插入到载体中，导入宿主细胞进行复制和表达。
例题：简述构建重组质粒的过程。
知识点：1、目的基因获取：可以通过 PCR 扩增、从基因文库中筛选等方法获得。
2、载体选择：常见的载体有质粒、噬菌体等，要根据实验需求选择合适的载体。
3、酶切和连接：用相同的限制性内切酶分别切割目的基因和载体，然后用 DNA 连接酶将它们连接起来。
5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳 以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小， 其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力 就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝 胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产 率。所以再留出5分钟，以使正在复制 中的DNA能够复制完全，以合成更多 的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合 进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的 过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细 胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min
分子生物学 分子生物学研究法
5‘ 供者
探针
3‘ 受者
Taqman法 分子信标(molecular beacon)法
高效液相色谱 ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ质谱分析法 DNA芯片技术（DNA chip）
SNP数据库
国立生物技术信息中心 德国的HGBAS网站
JST的数据库
2.5基因打靶(gene targeting)
通过DNA定点同源重组，改变基因组中 的某一特定基因，在生物活体内研究该 基因的功能。(反向遗传学)
抗原－抗体 特异性结合
SDS-PAGE 后转膜
基因表达产 物――蛋白
的检测
ELISA 原理和用途类似于Western blot,但在酶标板中操作，无需SDSPAGE转膜，操作简单，可批量检测，并可半定量测定。
Southern blot
Northern blot
Western blot
双脱氧法测序
gradient gel electrophoresis,DGGE) 原理:当双链DNA在变性梯度凝胶中进行 到与DNA变性温度一致的凝胶位置时， DNA发生部分解链，电泳迁移率下降， DNA链中有一个碱基改变时，会在不同 的时间发生解链，因影响电泳速度变化 的程度而被分离。
荧光共振能量传递 (fluorescent resonance energy transfer, FRET)
基因敲除(gene knockout)：定向敲除 基因敲入(gene knockin)：定向替代
基因打靶的必备条件
胚胎干细胞(ES细胞)
能在体外培养，保留发育的全能性
打靶载体
Neo（新霉素）阳性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒
(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶 (thymidine kinase)
分子生物学研究方法
分子生物学研究方法
首先，核酸提取与分析是分子生物学的基础。
通过从生物体细胞中提
取核酸，可以获得DNA和RNA的样本，为后续的实验提供原料。
核酸的分
析方法包括凝胶电泳和聚合酶链式反应（PCR）等。
凝胶电泳可以根据核
酸分子的大小和电荷差异进行分离，从而获得目标核酸的纯度和浓度信息。
PCR是一种体外扩增DNA的方法，可以在短时间内从少量的DNA模板扩增
到大量的DNA产物，为后续实验提供更多的材料。
其次，蛋白质的表达与纯化是分子生物学的另一个重要研究方法。
蛋
白质是生物体内功能的执行者，因此研究蛋白质的表达与功能对于揭示生
命活动的机理具有重要意义。
蛋白质的表达通常利用重组DNA技术，将目
标基因克隆到可表达载体中，并转化到细菌或其他表达系统中。
随后，通
过诱导表达、细胞破碎、蛋白质纯化等步骤，最终获得目标蛋白质的产物。
蛋白质的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等多种方法，
可以根据蛋白质的性质和特点选择合适的方法进行纯化。
另外，生物信息学和计算生物学方法也是分子生物学研究的重要手段。
随着DNA测序技术的快速发展，大规模的基因组、转录组和蛋白质组数据
被不断积累，因此需要开发合适的计算方法进行存储、管理和分析这些数据。
生物信息学和计算生物学的研究方法涉及到生物数据库的建立和维护、序列比对、基因和蛋白质结构预测、分子动力学模拟等等。
这些方法可以
帮助研究人员更好地理解和分析分子生物学数据，从而揭示生命活动和疾
病发生发展的机理。
(NEW)朱玉贤《现代分子生物学》(第5版)笔记和课后习题(含考研真题)详解
4.3 名校考研真题详解 第5章 分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术
5.1 复习笔记 5.2 课后习题详解 5.3 名校考研真题详解 第6章 分子生物学研究法（下）——基因功能研究技术 6.1 复习笔记 6.2 课后习题详解 6.3 名校考研真题详解 第7章 原核基因表达调控 7.1 复习笔记 7.2 课后习题详解 7.3 名校考研真题详解 第8章 真核基因表达调控 8.1 复习笔记 8.2 课后习题详解 8.3 名校考研真题详解
② T2噬菌体感染大肠杆菌实验
a．在分别含有35S和32P的培养基中培养大肠杆菌。
b．用上述大肠杆菌培养T2噬菌体，分别制备含35S的T2噬菌体和32P的
T2噬菌体。
c．分别用含35S的T2噬菌体和32P的T2噬菌体感染未被放射性标记的大 肠杆菌。
d．培养一段时间后，将混合液离心，检测子代噬菌体放射性。上清液 主要是噬菌体，沉淀物主要是大肠杆菌。
（4）基因组、功能基因组与生物信息学研究
基因组计划是一项国际性的研究计划，其目标是确定生物物种基因组所 携带的全部遗传信息，并确定、阐明和记录组成生物物种基因组的全部 DNA序列。
功能基因组学相对于测定DNA核苷酸序列的结构基因组学，其研究内容 是在利用结构基因组学丰富信息资源的基础上，应用大量的实验分析方 法并结合统计学和计算机分析方法来研究基因的表达、调控与功能，以 及基因间、基因与蛋白质之间和蛋白质与底物、蛋白质与蛋白质之间的 相互作用和生物的生长发育等规律。功能基因组学的研究目标是对所有 基因如何行使其职能从而控制各种生命现象的问题作出回答。
严格地说，重组DNA技术并不完全等于基因工程，因为后者还包括其他
可能使生物细胞基因组结构得到改造的体系。
(整理)分子生物学研究方法
一．名词解释IP（免疫沉淀、免疫印迹）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
这个实验是用特异性抗体结合细胞裂解液中的目的蛋白，洗涤后解离特异性抗体和目的蛋白质，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），最后用Western blot分析目的蛋白质。
这种方法可以分析溶液中的、细胞内的、结合在细胞膜上的蛋白质或者受体，但只能是定性或者半定量的实验。
NLS（核定位序列）：核定位信号是另一种形式的信号肽, 可位于多肽序列的任何部分。
一般含有4～8个氨基酸, 且没有专一性, 作用是帮助亲核蛋白进入细胞核。
可分为单一型NLS和双分型NLS。
单一型NLS，由一段连续的碱性氨基酸序列排列而成（RKKKRKV），双分型NLS，有两段碱性氨基酸被中间10~12GE 非特异性氨基酸所分割而形成，（KRPAA TKKAGQAKKKKLDK）。
SUMO（small ubiquitin-related modifier）：是一种小的泛素相关修饰蛋白，它与泛素在序列上虽只有18%相同，但在二级结构和三级结构上有惊人的相似。
SUMO家族成员都有独特的N端氨基酸序列和C端外延序列。
SUMO 化（sumoylation）的功能与泛素化（ubiquitination）不同，它并不是蛋白降解，反而加强它们的稳定性或调解它们在细胞内的定位和分布，甚至与凋亡相关。
二．问答题1.什么是近交系小鼠，它们有什么特征？有哪些常见的近交系小鼠？答：近交系小鼠：是经连续20代（或以上）的全同胞兄妹交配（或亲代与子代交配）培育而成的小鼠，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。
特性：①基因位点的纯合性（Homozygosity）近交系小鼠中任何一个基因位点上纯合子的概率高达99％，因而也能繁殖出完全一致的纯合子后代。
②遗传组成的同源性（Isogenicity）品系内所有动物个体都可追溯到一对共同祖先，个体在遗传上是同源的，基因型完全一致。
分子生物学的新研究方法
分子生物学的新研究方法分子生物学是生物学的一个重要分支，研究对象是生命体内分子层面上的生命过程。
随着生物学研究的深入，分子生物学的研究方法也在不断地发展和更新。
本文将介绍分子生物学的新研究方法，包括单细胞测序、CRISPR-Cas9技术和光遗传学。
一、单细胞测序在分子生物学的研究中，传统的测序方法只能对大量细胞的基因表达进行测量。
然而，单个细胞的表达谱是有差异的，这些差异都不能被所谓的平均值来描述。
因此，单细胞测序近年来得到普及。
单细胞测序技术能够快速地捕获单个细胞的转录组数据，并从成千上万个单细胞中识别和分类。
它能够揭示细胞之间的多样性和功能异质性，并为研究单个细胞的生命过程提供丰富的信息。
单细胞测序技术主要分为两种：单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞DNA测序（scDNA-seq）。
其中，scRNA-seq技术应用最为广泛。
二、CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9技术是近年来分子生物学研究中的一大亮点。
它是一种基于人造的DNA切割工具，可以实现精准、高效的基因编辑。
CRISPR-Cas9技术以一种快速、简单和高效的方式来操纵基因中的特定序列。
它能够去除、添加或修复基因的特定区域，并在细胞、组织和动物等多种模型中得到应用。
CRISPR-Cas9技术已经在众多领域得到了成功的应用，如基因治疗、疾病诊断和治疗、农业生产等。
它被认为是基因工程领域的一项革命性技术。
三、光遗传学光遗传学是一种新的分子生物学研究方法，在光和基因学的交叉领域中应用较广。
它利用人造的光敏蛋白来刺激或抑制细胞的活动，并实现对生命过程的基因表达和神经元活动的精确控制。
光遗传学技术主要依赖于两类光敏蛋白：一类是光激活钠离子通道（如ChR2），可触发神经元的电信号；另一类是光抑制钙离子通道（如NpHR），可以用于精确抑制神经元活动。
这种技术可在分子和细胞层面促进生命过程的研究。
光遗传学技术的应用范围广泛，包括神经科学、基因工程、药物研发等。
第八章 分子生物学研究方法上自测题
第八章分子生物学研究方法上自测题1.（单选题）识别并切割特异DNA序列的酶是A. 非限制性核酸外切酶B. 限制性核酸内切酶C. 限制性核酸外切酶D. 非限制性核酸内切酶您的答案：2.（单选题）普通琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的上限是A. 30 kbB. 40 kbC. 50 kbD. 60 kb您的答案：3.（单选题）Sau3A酶切产生的DNA片段可插入到（）消化的λ噬菌体载体上A. EcoRⅠB. Hind ⅢC. BamHⅠD. SmaⅠ您的答案：4.（单选题）筛选基因文库不使用A. 核酸杂交法B. PCR筛选法C. 正负筛选法D. 免疫筛选法您的答案：5.（单选题）由于一些大肠杆菌细胞会切除带有5'-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以实验中常选用（）菌株以防止cDNA被降解A. mrr- tonA-B. mcrA- mcrB-C. mrr- mutS-D. mrr- malA-您的答案：6.（单选题）在RFLP作图中，1 cM（厘摩）相当于重组率A. 1%B. 2%C. 5%D. 10%您的答案：7.（单选题）RAM PAGE技术使用山梨醇和海藻糖的目的是A. 提高酶的热稳定性B. 提高酶的催化性C. 提高酶的高效性D. 提高酶的专一性您的答案：8.（多选题）可改造成基因工程载体的有A. 质粒B. 噬菌体C. 哺乳动物的病毒D. 逆转录病毒DNA您的答案：9.（多选题）关于pUC质粒载体，描述正确的是A. 有大肠杆菌β-半乳糖酶基因lacZ启动子B. 有原核复制起点（ori）C. 有编码β-半乳糖苷酶全长的DNA序列D. 有氨苄青霉素抗性基因（Ampr）您的答案：10.（多选题）引物设计时应注意A. 长度一般为18~27 bpB. GC含量控制在40%~60%C. Tm值在60℃为宜D. 3'端可加外切核酸酶的识别位点您的答案：11.（多选题）在构建文库时，通常采用哪些策略提高文库的代表性A. 用机械切割法随机断裂DNA，增加克隆的随机性B. 用限制性内切核酸酶切割随机断裂DNA，增加克隆的随机性C. 减少文库重组克隆的数目，以提高文库构建的准确性D. 增加文库重组克隆的数目，以提高覆盖基因组的倍数您的答案：12.（多选题）可用于基因组文库构建的载体包括A. λ噬菌体载体B. 细菌人工染色体（BAC）C. P1源人工染色体（PAC）D. 酵母人工染色体（YAC）您的答案：13.（多选题）基因的图位克隆法需要A. 通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段分离并克隆出来B. 通过建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位C. 通过对相同生态型个体的大量限制性内切酶和杂交探针分析，找出与目的基因距离最近的分子标记D. 确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记您的答案：14.（多选题）固相化pH梯度技术的优点是A. 提高了双向电泳的分辨率B. 避免了载体两性电介质向阴极漂移C. 大大提高了双向凝胶电泳结果的可重复性D. 减少了蛋白质上样量您的答案：15.（判断题）提取动物细胞的DNA，加入CATB溶解细胞膜。
分子生物学的研究方法
分子生物学的研究方法分子生物学是生命科学领域中的重要分支，研究生物大分子（如DNA、RNA、蛋白质等）的结构、功能及其在生物体内的相互作用关系。
分子生物学的研究方法随着技术的不断进步，越来越高效、精准。
本文将介绍几种常见的分子生物学研究方法。
1. PCR技术PCR技术是分子生物学中最常用的研究方法之一。
PCR技术简单来说就是以DNA为模板，通过循环加热和降温的方式使DNA 分离成两条单链，并利用DNA聚合酶合成新的DNA分子。
通过PCR技术可以扩增目标DNA片段，为其他分子生物学研究提供了重要的基础。
PCR技术的具体操作是：首先选择适当的引物，引物是一段长度为15~30个核苷酸的单链DNA，与目标DNA上的两端互补，可用来定向扩增DNA。
然后将待扩增的DNA样品与引物混合，加入适当浓度的DNA聚合酶和反应缓冲液，反复加热降温，反应若干个周期后，就可以得到扩增的DNA产物。
近年来，PCR技术不断发展，出现了许多高级变体，如RT-PCR技术和qPCR技术等。
这些技术在分子生物学、医学以及疾病诊断等领域得到了越来越广泛的应用。
2. 质谱技术质谱技术是一种分析化学技术，用于测定化合物的分子量、化学式以及数量等信息。
在分子生物学中，质谱技术主要用于分析蛋白质和核酸的结构和功能。
质谱技术的基本原理是将待测样品中的分析物（如蛋白质、核酸等）转化成气态或溶液状态下的离子，并利用质谱仪测定离子的质荷比。
通过离子的质谷比可以确定分析物的分子量、化学式以及数量等信息。
质谱技术的应用范围非常广泛，包括蛋白质组学、代谢组学以及疾病诊断等领域。
随着技术的不断进步，质谱技术也变得更加高效、精准，未来将有更多的应用。
3. 基因编辑技术基因编辑技术近年来获得了长足发展，它可以通过将基因序列中的单个碱基替换、插入或删除，来打造定制化的基因组序列。
这种技术有巨大的应用潜力，可以用于人类基因疾病的治疗以及植物、动物品种改良等领域。
基因编辑技术最常用的手段是CRISPR-Cas9系统，它是一种通过结合RNAs和酶分子来定向剪切DNA的系统。
分子生物学的研究方法
分子生物学的研究方法1. 基因克隆啊，这就好比是复制粘贴一样神奇！比如说我们要研究一个很重要的基因，那我们就可以通过基因克隆这个方法把它复制出来，然后好好研究它。
就像找到一把神奇的钥匙，打开我们了解生命奥秘的大门啊！2. 聚合酶链式反应，哇，这可是个厉害的家伙！你想想看，就像快速变魔术一样，能把少量的 DNA 迅速扩增好多倍。
比如要检测一个很微小的病原体，聚合酶链式反应就能大显身手啦！3. 核酸杂交，嘿，这不就像是在茫茫人海中寻找那个特别的人嘛！通过它可以找到特定的核酸序列哦。
比如说在基因诊断中，核酸杂交就能精准地找到出问题的地方，是不是超厉害呀！4. 基因测序就像在解读生命的密码本！我们可以知道基因的具体序列啦。
像破解一个神秘的代码一样，让我们对生命的了解深入到每一个碱基。
比如研究遗传病，基因测序就能告诉我们到底是哪里出了问题呀！5. 蛋白质印迹，这就像照妖镜一样，能让特定的蛋白质现形！当我们想知道某种蛋白质有没有表达或者表达量多少的时候，它就派上大用场了。
哎呀，简直太妙了！6. 细胞培养，哇塞，这就如同给细胞安个家呀！我们可以让细胞在特定的环境中生长繁殖。
比如想研究某种药物对细胞的影响，细胞培养不就正好嘛，多有趣呀！7. 基因编辑，这可是能直接修改生命蓝图的神技啊！就像我们拿着笔可以随心所欲地修改一样。
像要治疗一些基因导致的疾病，基因编辑没准就是未来的希望呢！8. 免疫印迹，嗯，这有点像侦探在找线索呢！通过它可以检测特定的蛋白质和抗体。
比如说研究自身免疫性疾病，免疫印迹就能帮忙找出那些捣乱的家伙呀！9. 实时荧光定量 PCR，嘿，这绝对是个精确的计量器呀！能实时检测DNA 的变化呢。
在监测基因表达的动态过程中，它可太有用啦，厉害不厉害！我觉得分子生物学的这些研究方法真的超级神奇，它们让我们对生命的探索不断深入，有着无比广阔的前景和重要性啊！。
分子生物学的研究方法例题和知识点总结
分子生物学的研究方法例题和知识点总结分子生物学作为一门研究生物大分子结构与功能的学科，对于理解生命现象的本质具有至关重要的意义。
其研究方法多种多样，涵盖了从分子水平到细胞水平，再到整体生物个体水平的多个层次。
下面我们将通过一些具体的例题来深入探讨分子生物学的研究方法，并对相关知识点进行总结。
一、分子克隆技术分子克隆技术是分子生物学研究中最常用的方法之一，它能够实现特定 DNA 片段的复制和扩增。
例题：假设我们需要从一个复杂的基因组中克隆出编码某种特定蛋白质的基因。
首先，我们通过设计特异性引物，利用 PCR（聚合酶链式反应）技术扩增出目标基因片段。
然后，将这个片段插入到合适的载体（如质粒）中，转化到宿主细胞（如大肠杆菌）中进行扩增和表达。
知识点：1、 PCR 技术的原理：基于 DNA 半保留复制的原理，通过高温变性、低温退火和适温延伸的循环过程，实现 DNA 片段的指数级扩增。
2、载体的选择：常见的载体有质粒、噬菌体和病毒等，需要根据实验目的和宿主细胞的特性来选择。
3、转化方法：包括化学转化法、电穿孔法等，目的是将重组载体导入宿主细胞。
二、核酸杂交技术核酸杂交技术是基于核酸分子的碱基互补配对原则，用于检测特定核酸序列的存在。
例题：为了检测某一细胞样本中是否存在特定的 mRNA 分子，我们可以设计与之互补的 DNA 探针，进行 Northern 杂交实验。
知识点：1、 Southern 杂交：用于检测 DNA 分子。
2、 Northern 杂交：用于检测 RNA 分子。
3、探针的标记：可以采用放射性同位素标记或非放射性标记（如荧光标记、生物素标记等）。
4、杂交条件的优化：包括温度、离子强度等，以保证特异性杂交的发生。
三、基因测序技术基因测序技术能够确定 DNA 或 RNA 分子的核苷酸序列。
例题：对一个未知基因进行测序，以确定其碱基组成和排列顺序。
知识点：1、 Sanger 测序法：通过双脱氧核苷酸终止法进行测序。
分子生物学研究方法
分子生物学研究方法
分子生物学研究方法是研究生物分子结构、功能和相互作用的一系列实验方法和技术。
这些方法帮助科学家了解细胞的基本结构和功能，研究生物分子在疾病发展、遗传变异和进化中的作用。
以下是一些常用的分子生物学研究方法：
1. DNA提取：从细胞或组织中提取DNA，以用于后续实验。
2. 聚合酶链式反应（PCR）：用于扩增DNA片段，以便进行分析和检测。
3. 凝胶电泳：用电场将DNA、RNA或蛋白质分离成不同大小的片段，以便研究其结构和功能。
4. 蛋白质纯化：通过一系列步骤将目标蛋白质从混合物中纯化出来，以获得足够的纯度用于研究。
5. 克隆：将DNA序列插入到载体中，以产生大量目标DNA 分子，用于进一步的分析和实验。
6. 基因测序：确定DNA序列的顺序，以研究基因功能、分析遗传变异或进行进化研究。
7. 基因表达：将目标基因转录成mRNA，并翻译成蛋白质，以研究基因功能和调控机制。
8. 蛋白质相互作用：使用技术如亲和层析、酵母双杂交等研究蛋白质之间的相互作用关系，以探索细胞信号传导和代谢途径。
9. 基因编辑：利用技术如CRISPR/Cas9，对细胞或生物体的基因进行精确的编辑，以研究基因功能或治疗遗传疾病。
分子生物学研究方法的不断发展和创新使得科学家可以更深入地了解生物分子的结构、功能和相互作用，为疾病治疗和生物技术的发展提供了基础。
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➢ 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2 - 50kb之间
➢ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1-1000个碱基对
凝胶类型及浓度 0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖 4.0%聚丙烯酰胺 10.0%聚丙烯酰胺 20.0%聚丙烯酰胺
1)电泳:将已酶切的待检DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳。 2)转膜:将分离的核酸样品转移到滤膜上（印迹转移）。 3)杂交:将滤膜与标记的DNA或RNA探针进行杂交。
印迹法：凝胶印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和 噬菌斑印迹法。 杂交膜：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。
杂交模式图 －
DNA印迹转移
探针杂交
1.3.3 核酸分子杂交
复性（退火）：在一定条件 下变性的两条单链重新结合 为双链的过程
杂交：来源不同的两条单链 结合为双链分子的过程。
核酸探针：指序列或功能特 性已知的标记分子，为双链 或单链，长度通常为几十至 几百bp,包括DNA探针、RNA探 针和cDNA探针。
若退火的核酸来自 不同的生物有机体，则 所形成的双链分子就被 称为杂种核酸分子。
分离DNA片段的大小范围（bp） 50 000~1 000 20 000~1 000 6 000~300 1 000~100 500~25 50~1
凝胶的分辨能力同凝胶类型和浓度有关，凝胶 浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高， 孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低， 孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。
➢ 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度：15-30bp，常为20nt左右。 ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜。避免5个以上 相同碱基的成串排列。 ④引物内部应避免出现出现二级结构，避免两条引 物间互补。 ⑤引物3ˊ末端碱基，应与模板单链严格配对。 ⑥引物中具有或能够加上合适的酶切位点。 ⑦特异性：与数据库中的其它序列无明显同源性。
① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右 一定时间后，使模板DNA双链解离，使之成为单 链，以便与引物结合。
② 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热 变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链上的互补序列配对结合。
③ 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚
放射自显影
＋
例题：
某作者用人的一放射性DNA探针与鼠基因组DNA 进行杂交，在所得到的杂交图谱中，第1泳道的点 样处有一略呈拖尾状的放射性杂交斑点；第2泳道 呈较长的弥散形杂交带；第3泳道有3条较清晰的杂 交条带，上下两条带的显色程度相当，中间的条带 显色最深，约分别为其上下两侧条带的两倍。试分 析上述实验结果。
1.3.2 分子杂交类型
根据鉴定对象不同，可将分子杂交法分为3种类型：
Southern杂交由E.M.Southern于1975年创立。
Southern杂交：将DNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上， 然后与核酸探针进行杂交。 Northern杂交：将RNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上， 然后与核酸探针进行杂交。 Western杂交：将蛋白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上， 然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质进行反应。
PCR仪
注: Taq来自Thermus aquaticus
1.4.2 PCR反应体系
Tmplate DNA DNA Primers dNTPs Taq DNA Polymerase 10× Buffer
1.4.3 基本反应步骤
1个循环包括高温变性、低温退火和中温延伸反应。 经n次循环后, 一个DNA分子可扩增为2n个分子。
定向克隆应用举例
pPICZα物理图谱
定向克隆应用举例---PCR引物设计
复制机制。
(3)50年代末至60年代，相继提出了“中心法则” 和操纵子学说, 成功地破译了遗传密码，充分 认识了遗传信息的流动和表达途径。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板， 按碱基配对原则，合成一条新的与模板DNA互补的链。
1个PCR循环产生2条双链分子 一般每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能 将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
PCR的基本原理
模板DNA
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
（1）Southern杂交（Southern印迹）：用适当 的限制酶消化待测DNA，电泳后，将凝胶浸于碱 性溶液中以变性DNA，再经毛细作用将变性的 DNA从凝胶中转移至杂交膜上并固定，然后与放 射性同位素标记的核酸探针杂交，再经放射自 显影显示杂交结果。该技术可有效地分析基因 结构或检测待测DNA样本中是否含有特定的序列。
1.2.3 植物转基因的方法 (1)Ti质粒介导 (2)电转化法 (3)基因枪法
1.3 核酸的分子杂交
1.3.1 放射性同位素技术
同位素：原子序数相同而质量不同的元素。
➢ 放射性同位素 同位素可分为稳定同位素和不稳 定同位素，后者又称为放射性同位素。不稳定同位 素原子核结构不稳定，易自发产生衰变，产生α射线、β-射线和γ-射线等，同时从不稳定同位素 变成稳定同位素。在分子生物学研究中，得到应用 的是放射性同位素。
Localization of RNA
1.4 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR）
➢ PCR技术简史 1.4.1 PCR原理 PCR是一种体外无性扩增DNA的实验技 术。待扩增DNA片段经高温变性成为单链后，在低温 （如52℃）下与寡聚核苷酸引物退火，然后在中温下 以每一条单链为模板，由多聚酶催化延伸引物链，分 别合成一条新链。经过解链、退火和链延伸等多个循 环反应，原DNA片段就可得到大量扩增。
基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具 有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因 置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的 能力。
1962年Arber 发现限
重组DNA实验中常见的主要工具酶
功能
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
末端转移酶
在双链核酸的3ˊ末端加上多聚单核苷酸
DNA外切酶III
从DNA链的3ˊ末端逐个切除单核苷酸
λ噬菌体DNA外切酶
从DNA链的5ˊ末端逐个切除单核苷酸
碱性磷酸酯酶
切除位于DNA链5ˊ或3ˊ末端的磷酸基团
科学家已几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段， 再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。
1 DNA操作技术
• DNA分子的切割与连接 • 核酸分子杂交 • 凝胶电泳 • 细胞转化 • 核酸序列分析 • 基因的人工合成 • 基因的定点突变 • PCR扩增 • 基因敲除
1.1 核酸的凝胶电泳
原理： 种类：琼脂糖（agarose）凝胶电泳；
聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳 用途：鉴定重组DNA分子
为菌落杂交和空斑杂交。在杂交膜上接种转化子细胞，裂 解以释放待检DNA，变性并固定DNA，与探针杂交，放射自 显影。用于鉴定阳性重组体。
检测重组体克隆的菌落杂交技术
（4）组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）：
指组织或细胞的原位杂交。经适当处理后，使细胞通透 性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，以确定探针互 补序列在胞内的空间位置。
第五章
分子生物学研究方法（上）
本章主要内容
常见的DNA操作技术 基因克隆技术简介 蛋白质组学及研究技术
引言
➢ 重组DNA技术发展史上的重大事件
(1) 40年代，解决了遗传的物质基础问题。确定了
遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋 白质。
(2)50年代，解决了基因的自我复制和世代交替问 题。建立了DNA分子的双螺旋结构模型，提出了半保留
➢ Southern杂交应用举例
环状芽孢杆菌基因启动子的分离与鉴定
（2）斑点杂交（Dot blot）：直接将DNA样品点在滤 膜上使之成为斑点，变性并固定，与探针杂交，放射 自显影。
环状芽孢杆菌C-2基因启动子探针与重组DNA分子的斑点杂交
（3）菌落原位杂交（Hybridization in situ)：又分
从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。
➢ 基因工程的主要内容或步骤
“分---切---连---转---筛”
（1）从基因组中分离、或PCR扩增、或人工合成带有目的 基因的DNA片段。 （2）用适当的限制酶分别切割适当的载体分子和含有目 的基因的DNA分子。 （3）将目的基因连接到载体分子上，形成重组DNA分子。 （4）将重组DNA分子转移到适当的受体细胞中并增殖。 （5）筛选重组转化子，扩增目的基因。再将目的基因克 隆到表达载体上，导入受体细胞，使表达目的产物。
引物1
引物2
• PCR反应条件
PCR的基本原理 • PCR过程 • PCR的特点 Taq酶 引物1
引物2 Taq酶
• PCR反应条件
PCR的基本原理 • PCR过程 • PCR的特点 第1轮结束
• PCR反应条件
PCR的基本原理 Ta•q PCR过程 • PCR的特点 Taq Taq Taq
• PCR反应条件
(t1/2 = 4.5×109a)
➢ 放射性强度的探测
（1）盖革计数器（Geiger counter tuber）， 闪烁计数器。
（2）放射自显影：X-光乳胶片覆盖于样品，在 黑暗中，-70℃，曝光。