各生理指标实验步骤

1丙二醛（MDA）含量的测定

丙二醛在酸性和高温的条件下，可以和硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川，在532nm处有最大光吸收。植物组织中可溶性糖与TBA的显色反应产物在450nm和532nm处也有吸收。测定时要排除可溶性糖的干扰，因此分别测定532nm和450nm处的吸光值，直接求得植物样品提取液中MDA的浓度；MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定。

计算公式如下:

C(µmol.L-1)=6.45OD532-0.56OD450

进一步算出每克样品鲜重中丙二醛的含量（µmolg-1FW）。

试剂：

10%三氯乙酸（TCA）：10g三氯乙酸定容于100ml

0.6%硫代巴比妥酸：0.6g用10%三氯乙酸TCA定容于100ml

试验步骤:

（1）取植物材料用液氮迅速研磨成粉，取0.2g左右材料，放入5ml离心管。

（2）加入5ml 10%的三氯乙酸，提取30min后，10000r/min离心15min。

（3）取上清液2ml，加入2ml 0.6%TBA，混匀，在100℃水浴中煮15min，冷却，冷却后再测量。

（4）分别测定532nm和450nm处的吸光值。以2ml（加TBA,水）水代替提取液作为对照管。

2蛋白质含量测定----考马斯亮蓝G-250法

实验原理：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度围，蛋白质一色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

仪器和试剂：

牛血清白蛋白500微克/毫升：10ｍｇ蒸馏水定溶至100ｍｌ

考马斯亮蓝G-250：10ｍｇ溶于5ml 90％乙醇中，加入10ml85％的磷酸，用蒸馏水定溶于100ｍｌ

操作步骤：

1.标准曲线的制作：

取4支试管，按下表配制不同浓度的牛血清白蛋白溶液各1毫升,加入5毫升考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置2分钟后用10毫米光径的比色杯在595nm 下比色。做出标准曲线。

管号 1 2 3 4

蛋白质含量(微克) 0 50 100 150

500微克/毫升牛血0 0.1 0.2 0.3

清白蛋白量（毫升）

蒸馏水量(毫升) 1.0 0.9 0.8 0.7

考马斯亮蓝-G250 5 5 5 5

（毫升）

2.样品中可溶性蛋白质的提取测定：

称取植物叶片0.2克，用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，过滤，取滤液l.0ml(视蛋白质含量适当稀释)于试管中，加入5毫升考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置2分钟后用10毫米光径的比色杯在595nm下比色，以空白管调零，测定吸光度。根据吸光度查标准曲线，求出样品中的蛋白质含量。

3.结果计算

样品中的蛋白质含量(mg/g)=(C·Vt)/(1000Vs·WF)

式中：C--查标准曲线值（ug）

Vt一提取液总体积(ml)

WF一样品鲜重(g):

Vs一测定时加样量(ml)。

3脯氨酸（Pro）含量的测定

药品：3%的磺基水酸：3g 磺基水酸溶在100ml水中。

2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/l磷酸以3：2混合，作为溶剂进行配制：即2.5g茚三酮溶解在 60ml冰乙酸和40ml磷酸中，磷酸是16.4ml和2

3.6ml 水中。

脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，用蒸馏水定溶至250ml。

1.标准曲线制作

（1）取4支具塞刻度试管按下表加入各试剂。

试管号0 2 4 6

脯氨酸标准溶液(ml) 0 0.2 0.6 1.0

水（ml） 1.0 0.8 0.4 0

冰乙酸（ml） 1 1 1 1

茚三酮显色液（ml） 1.5 1.5 1.5 1.5

脯氨酸含量（µg）0 2 6 10

混匀后在沸水中加热20min。

（2）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管为对照在520nm波长下比色。

（3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。

2.样品提取测定

（l）提取：剪碎叶片0.2g，置于大试管中，加入5m1 3%磺基水酸溶液，管口加盖保鲜膜，于沸水浴中浸提l0 min。

（2）取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2m1冰乙酸、2m1水和4ml显色液，于沸水浴中加热40min，下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色。以甲苯为对照

从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量

脯氨酸含量（µg•g-1）（鲜重）＝（C·V）·（a·W）-1

式中：C一提取液中脯氨酸含量，由标准曲线求得；

V一提取液总体积（ml）；

a一测定时所吸取的体积（ml）：

W一样品重（g）

4相对电导率的测定

1.取已处理的叶片,用打孔器取小圆叶片20片（或称取0.5克）,放入小烧杯中，每个处理三次重复。

2．向烧杯中各加入25ml蒸馏水浸半小时。

3．用电导仪测各个处理松针外渗液的电导率和蒸馏水电导率。

4. 各烧杯用保鲜膜盖上，于水浴锅中沸水浴半小时，冷却补充蒸馏水25ml，测定煮沸电导率。令测蒸馏水电导率

叶绿素含量的测定：丙酮乙醇混合法

1 将丙酮、无水乙醇按照1:1=5ml:5ml比例配成混合浸提液。

2.称取0.2克叶片，剪成细丝于盛有混合液的试管中，加保鲜膜盖于暗处，浸提，隔一定时间观察浸提情况，以材料完全变白为准，用混合液作空白调零，测定663nm、645nm处光密度，一般隔夜测定。

1取叶片剪碎0.2克，用少量80%的丙酮研磨至匀浆，过滤，用 80%丙酮定溶至 25ML，测测定663nm、645nm处光密度。每次测量做3次重复。